調控水稻葉片衰老和抗旱能力的基因OsNAP及應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一個調控水稻葉片衰老和抗旱能力的基因OsNAP及應用。該基因的核酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；其cDNA序列如SEQ?ID?NO：2所示。其蛋白質的序列如SEQ?ID?NO：3所示。該基因在幼嫩的水稻葉片中有一定的表達，隨著葉片衰老程度加深其表達量逐漸上升，當葉片衰老程度到達晚期時表達活性達到頂點。通過對超量表達和抑制表達該基因的轉基因水稻植株的研究，發現超量表達轉基因植株葉片衰老進程加速，同時苗期抗旱性明顯提高。抑制表達轉基因植株的葉片衰老進程明顯延緩。表明該基因具有調控水稻葉片衰老和提高抗逆性的功能。
【專利說明】調控水稻葉片衰老和抗旱能力的基因 OsNAP及應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物基因工程和水稻分子育種【技術領域】，具體涉及一個調控水稻葉片 衰老和抗旱能力的基因 OsNAP及應用。

【背景技術】
[0002] 葉片衰老是葉片發育過程中的一個必經階段，它伴隨著葉片顏色的變化，反映在 葉綠素的喪失，最后導致葉片的死亡和脫落。葉片衰老會導致光合作用的下降，導致碳同化 的減少，從而影響農作物的產量。因此近幾十年，人們一直在研究葉片衰老產生的原因和機 理，希望能夠有計劃的控制葉片衰老的發生。
[0003] NAC轉錄因子（MAM, ATAF and OTC)是植物中特有的轉錄因子，很多研究表 明它們在調控葉片衰老的過程起著重要的作用。小麥中的一個NAC基因 NAM-B1受 衰老調控，在調節谷粒蛋白中鋅和鐵的含量中起著一定的作用（Uauy等，A NAC gene regulating senescence improves grain protein, zinc,and iron content in wheat. Science，2006,314:1298-1301)。ANAC092/AtNAC2/0REl 是擬南芥中的一個 NAC基因，其表達量也受葉片衰老調控，它能正調控擬南芥葉片中年齡依賴的細胞死 亡；oresaral(orel)突變體由于缺少ANAC092/AtNAC2/0REl基因的功能，表現出延緩 葉片衰老的表型；ANAC092/AtNAC2/0REl也能被鹽脅迫誘導表達，其突變體anac092-l 的離體葉片在鹽脅迫處理下葉綠素降解速度下降，表現出延緩葉片衰老的表型；在 ANAC092/AtNAC2/0REl的超量表達植株中有170個基因激活表達，其中很多基因能被 鹽脅迫誘導，說明ANAC092/AtNAC2/0REl在鹽脅迫誘導的葉片衰老過程起著重要的作 用（Oh 等，Identification of three genetic loci controlling leaf senescence in Arabidopsis thaliana. Plant J，1997, 12:527-535 ;Kim 等，Trifurcate feed-forward regulation of age-dependent cell death involving miR164 in Arabidopsis. Science，2009, 323:1053-1057 ;Balazadeh 等，A gene regulatory network controlled by the NAC transcription factor ANAC092/AtNAC2/0REl during salt-promoted senescence. Plant J，2010a，62:250-264 ;Balazadeh 等，Salt-triggered expression of the ANAC092_dependent senescence regulon in Arabidopsis thaliana. Plant Signal Behav，2010b，5:733-735)。0RS1 是 0REl/ANAC092/AtNAC2 的同源基因，在衰老 的組織中表達量很高且能被鹽和H202誘導，0RS1超量表達植株葉片早衰，同時0RS1的突 變體otsI-1和RNAi轉基因植株葉片延緩衰老，說明0RS1可能在鹽和H 202誘導的葉片衰 老過程起著一定的作用（Balazadeh 等，0RSl，an H202_responsive NAC transcription factor, controls senescence in Arabidopsis thaliana. Mol Plant，2011，4:346-360)〇 擬南芥中的VND-INTERACTING2 (VNI2)也編碼一個NAC轉錄因子，它的表達量受ABA和 葉片衰老誘導，通過調控 RESPONSIVE TO DEHYDRATION(RD)和 C0LD_RE(；ULATED(C0R)來 介導鹽脅迫和葉片衰老途徑（Yang 等，The Arabidopsis NAC transcription factor VNI2integrates abscisic acid signals into leaf senescence via the C0R/RD genes.Plant Cell，2011，23:2155-2168)。AtNAP僅在衰老葉片中表達，而且它的表達 量隨著葉片的衰老逐漸上升；突變體atnap在自然生長狀態和黑暗誘導狀態下均表現 出延緩葉片衰老的表型，超量表達AtNAP的轉基因植株出現明顯的早衰現象，而且水稻、 四季豆的NAP同源基因都能異源互補擬南芥突變體atnap的持綠表型；進一步研究發 現 AtNAP 可以和 SENESCENCE-ASSOCIATED GENE113 (SAG113)的啟動子結合，形成一個 ABA-AtNAP-SAG113蛋白調控鏈來控制葉片衰老時的氣孔運動和失水速率（Guo等，AtNAP，a NAC family transcription factor, has an important role in leaf senescence. Plant J，2006,46:601-612 ;Zhang 等，An abscisic acid-AtNAP transcription factor_SAG113 protein phosphatase 2C regulatory chain for controlling dehydration in senescing Arabidopsis leaves. Plant Physiol, 2012, 158:961-969)。盡管很多 NAC 轉錄 因子的表達量都能被衰老所上調，但是它們在葉片衰老中的作用還不是很清楚，還有待人 們去研究。
[0004] 水稻是人類主要的糧食作物之一，水稻中60 %到100 %的碳都是在籽粒灌漿 期間固定的，因而水稻在生育期內葉片衰老的快慢會直接影響其產量（Murchie等， Interactions between senescence and leaf orientation determine in situ patterns of photosynthesis and photoinhibition in field-grown rice.Plant Physiol，1999, 119:553-564)。隨著生物技術的發展，在培育持綠性水稻的策略中，采用分 子遺傳調控的手段來延緩葉片衰老是一條經濟有效且保護環境的措施。因此，對優良的衰 老相關基因加以改良，培育出延緩葉片衰老的水稻品種，對于增加水稻的產量有著重要的 意義。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于克服現有技術存在的缺限，提供一個能調控葉片衰老和提高抗 旱性的基因及應用，所述的基因與NAC轉錄因子基因有關。
[0006] 本發明提供了一種能調控水稻葉片衰老和提高抗旱性的NAC轉錄因子，該轉錄因 子基因是OsNAP基因，該基因來源于水稻。其cDNA核苷酸序列如SEQ ID N0:2中第1-1783 位所示；其蛋白質的序列如SEQ ID NO :3所示。
[0007] 本發明還涉及所述能調控水稻葉片衰老和提高抗旱性的相關基因 OsNAP的表達 載體的構建，所述表達載體包含有如SEQ ID N0 :1中第1-1895位所示的核苷酸序列。
[0008] 本發明還涉及利用所述水稻葉片相關衰老基因 OsNAP表達載體轉化水稻宿主。
[0009] 本發明的OsNAP基因可以構建到不同的表達載體中發揮其功能，例如：
[0010] 1)為了便于對轉基因的細胞或植物進行篩選，可以對所使用的載體進行改造，如 加入植物可選擇性標記（Bar基因、⑶S基因、GFP基因和Lux基因等）；
[0011] 2)為了改變目的基因 OsNAP的表達量，可在其轉錄起始核苷酸前使用不同的啟動 子，如增強型啟動子、誘導型啟動子、組成型啟動子、組織特異性啟動子、發育時期特異性啟 動子等。
[0012] 3)帶有本發明的OsNAP基因的表達載體轉化不同的植物細胞或組織，以獲得葉片 衰老進程改變、抗旱能力增強等性狀的轉基因植物。其中，被轉化的宿主可以是單子葉植 物，如水稻、玉米、小麥和草坪草等；也可以是雙子葉植物，如擬南芥、楊樹、大豆和棉花等， 但不局限于以上所述物種。
[0013] 4)帶有本發明的OsNAP基因的表達載體除了可以通過農桿菌Ti質粒介導法來進 行轉化外，還可以通過Ri質粒、植物病毒載體、顯微注射等方法來轉化不同的植物細胞或 組織，并將其育成植株，以得到含有目的性狀的轉基因植物。
[0014] 實現本發明的具體步驟是：
[0015] (1)超量表達載體P1301-0SNAP的構建及表型分析
[0016] 1)以水稻品種中花11基因組DNA為模板，經PCR擴增得到OsNAP的基因組DNA， 其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0017] 2)將步驟1)中得到的DNA片段連接到質粒pCAMBIA1301 (由澳大利亞CAMBIA惠 贈）上，得到pl301-0sNAP載體，然后將其導入農桿堿型的根癌農桿菌EHA105 (由澳大利亞 CAMBIA惠贈），再利用農桿菌介導的遺傳轉化方法將所述的載體導入水稻品種中花11，獲 得轉基因植株。
[0018] 3)用qRT-PCR的方法檢測轉基因植株及野生型中OsNAP基因的表達量。
[0019] 4)測定轉基因植株及野生型各時期葉片的葉綠素含量和凈光合速率，觀察其表型 并拍照，分析轉基因和野生型植株葉片衰老情況的差異。
[0020] 5)將正常生長至4葉期的野生型和轉基因植株進行干旱脅迫處理，觀察其表型， 比較轉基因和野生型植株對干旱脅迫的抗性差別。
[0021] (2)RNAi載體的構建及表型分析
[0022] 1)以水稻品種中花11衰老葉片RNA反轉錄的cDNA為模板，經PCR擴增OsNAP非 保守的3'_UTR區域，然后分別連接到pMCG161和pDS1301上（Yuan等，Mitogen-activated protein kinase 0sMPK6 negatively regulates rice disease resistance to bacterial pathogens. Planta, 2007, 226:953-960)，形成 pMCG161-〇sNAP 和 pDS1301-0sNAP。再分別酶 切 pMCG161-〇sNAP 和 pDS1301-0sNAP，將 pMCG161-〇sNAP 的外源和 pDS1301-0sNAP 的載體相 互連接形成RNAi載體。
[0023] 2)將步驟1)中得到的RNAi載體導入農桿堿型的根癌農桿菌EHA105,再利用農桿 菌介導的遺傳轉化方法將所述的載體導入水稻品種中花11，獲得轉基因植株。
[0024] 3)測定轉基因植株各時期葉片的葉綠素含量，觀察其表型并拍照，分析轉基因和 野生型植株葉片衰老情況的差異。
[0025] 4)用qRT-PCR的方法檢測轉基因植株中OsNAP和衰老Marker基因的表達量，分析 它們在轉基因和野生型植株葉片中的表達量差異。
[0026] 本發明的優點在于：
[0027] (1)本發明鑒定了一個葉片衰老相關基因 OsNAP，可以作為水稻中研究葉片衰老 的Marker基因，為后續的研究者提供參考。
[0028] (2)本發明中鑒定葉片哀老相關基因的方法，可為后續的研究者提供參考。
[0029] (3)本發明得到的改變葉片衰老進程的轉化植株為基因工程和分子育種提供了新 的資源。
[0030] (4)本發明得到的超量表達轉化植株可以一定程度上提高抗旱能力，為水稻抗旱 改良提供了新的資源。
[0031] (5)帶有本發明的OsNAP基因的表達載體可以轉化不同的植物細胞或組織，以獲 得衰老進程改變、抗旱能力增強等性狀的轉基因植物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 序列表SEQ ID N0 :1是本發明克隆的OsNAP基因的核苷酸序列，序列長度為1895 bp。
[0033] 序列表SEQ ID NO :2是本發明克隆的OsNAP基因的全長cDNA序列；長度為1783 bp ;在該序列的172-1350 bp區段是該基因的⑶S區，長度為1179 bp。
[0034] 序列表SEQ ID NO :3是OsNAP基因的蛋白質序列，編碼392個氨基酸。
[0035] 圖1 :是本發明商購的原始載體PCAMBIA1301的圖譜。
[0036] 圖2 :是本發明制備的重組載體，即表達載體pl301_0sNAP的構建圖。圖中標記說 明：LB，T-DNA左邊界；hyg，潮霉素磷酸轉移酶基因；35S，CaMV 35S啟動子；RB，T-DNA右左 邊界。
[0037] 圖3 :是本發明制備的OsNAP RNAi載體的構建圖。圖中標記說明：LB，T-DNA左 邊界；hyg，潮霉素磷酸轉移酶基因；35S，CaMV 35S啟動子；intron，水稻Waxy基因內含子； ⑶S，β -葡萄糖苷酸酶基因；RB，T-DNA右左邊界。
[0038] 圖4 :是用qRT-PCR的方法對野生型植株不同時期葉片中OsNAP基因的表達量的 檢測結果。圖中標記說明：SL1 :孕穗期的劍葉；SL2 :開花期的劍葉；SL3 :乳熟期的劍葉； SL4 :黃熟期的劍葉。
[0039] 圖5 :是用qRT-PCR的方法對野生型（非轉基因）和OsNAP基因超量表達轉基因 植株中OsNAP的表達量的檢測結果。圖中標記說明：圖5中的a圖和b圖中的RNA樣分別 來自于轉基因家系Iinel5、linel7和linel9及野生型苗期葉片和成熟后期的劍葉。
[0040] 圖6 :顯不的是OsNAP超表達轉基因水稻植株葉片哀老表型的分析。圖中標記：圖 6中的a圖和b圖分別表示OsNAP超表達轉基因水稻家系和野生型水稻植株分別在抽穗后 30 d和40 d時劍葉的照片。
[0041] 圖7 :是OsNAP超表達轉基因水稻家系和野生型水稻植株的劍葉在抽穗后各時期 葉綠素含量的測定。誤差線表示4次重復的標準差；表示t測驗的P值小于0. 05,差異 顯著；"**"表示t測驗的P值小于0. 01，差異極顯著。
[0042] 圖8 :是OsNAP超表達轉基因水稻家系和野生型水稻植株的劍葉在抽穗后各時期 凈光合速率的測定。誤差線表示4次重復的標準差；表示t測驗的P值小于0. 05,差異 顯著；"**"表示t測驗的P值小于0. 01，差異極顯著。
[0043] 圖9 :是本發明OsNAP RNAi轉基因水稻植株的表型分析情況。圖中標記：圖9中 的a圖表示抽穗后50 d的OsNAP RNAi轉基因家系（RNAi-Ι和RNAi-2)和野生型植株的整 株照片。圖9中的b圖和c圖分別抽穗后50 d的野生型植株和OsNAP RNAi轉基因家系 (RNAi-Ι和RNAi-2)的劍葉和倒二葉照片。
[0044] 圖10 :是本發明的轉基因水稻家系RNAi-l、RNAi-2和野生型水稻的劍葉和倒二葉 的葉綠素含量的測定。誤差線表示3次重復的標準差；"**"表示t測驗的P值小于0. 01， 差異極顯著。
[0045] 圖11 :是用qRT-PCR的方法對野生型（非轉基因）和OsNAP RNAi轉基因水稻家 系（RNAi-Ι和RNAi-2)劍葉中OsNAP和OsDOS的表達量的檢測結果。
[0046] 圖12 :顯示的是野生型（非轉基因）和OsNAP超量表達轉基因植株苗期干旱處理 情況。圖中標記說明：干旱脅迫復水后，高表達量家系linel7和linel9的存活率顯著高于 低表達量家系line 15和野生型對照。

【具體實施方式】
[0047] 實施例1 :候選片段的獲得
[0048] 利用生物信息學網站 NCBI (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/)軟件 BlastP (Gish 等，Identification of protein coding regions by database similarity search. Nature Genet. 1993, 3:266-272)搜索擬南芥葉片衰老特異性蛋白AtNAP在水稻基因組的同源序 列， 申請人:以AtNAP的蛋白序列為基礎，在水稻全基因組中搜索與其同源的NAC蛋白，得到 其同源蛋白 OsNAP，TIGR 號碼為 L0C_0s03g21060。利用其 L0C 號在 TIGR(http://rice. plantbiology. msu. edu)中搜索，得到OsNAP的Q)S、基因組（其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 :1所不）和蛋白質序列（其序列如序列表SEQ ID N0 :3所不）。利用OsNAP的CDS 序列在 K0ME(http://cdna01. dna. affrc. go. jp/cDNA/)中進行比對，得到 OsNAP 的 cDNA 序 列（其cDNA序列如SEQ ID NO :2所示）。
[0049] 以水稻中花11 (來自中國農業科學院作物科學研究所）基因組DNA為模板，經PCR 擴增OsNAP的基因組DNA。擴增該片段的引物的DNA序列為：正向引物F :5' -ATCGggtcac cTTCGCCATGTGCAATTATGT-3,；反向引物 R:5, -ATCGccatggCAGGGAGGTGTGTGTTGTGT-3，。PCR 反應程序：94°C 5 min ;94°C 1 min，58°C 3 min，72°C 1 min，30 個循環；72°C 7 min。回收 PCR產物后，將其連入pGEM-T載體（購自Promega公司）；將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a 感受態細胞，通過抗性篩選、酶切及測序檢測（為常規方法），得到OsNAP基因組DNA的陽 性TA克隆。對陽性TA克隆進行測序（為常規方法），結果表明，該陽性TA克隆含有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0050] 在中花11不同發育時期取葉片抽提總RNA(SL1 :孕穗期的劍葉；SL2 :開花期的劍 葉；SL3 :乳熟期的劍葉；SL4 :黃熟期的劍葉），提取總RNA方法根據該Trizol的試劑說明 書（Invitrogen 公司）。3yg 總 RNA 用 1 units RNase-free DNase I (購自 Invitrogen 公司）處理15 min以除去基因組DNA污染，然后加入0.5 mg 01igo(dT)15，l mM dNTPs， 10 mM dithiothreitol，200 units SuperScript?III反轉錄酶（購自 Invitrogen 公司） 進行反轉錄，終體積20μ1。50°C水浴1 h后，加20μ1 ddH20對反轉錄產物進行稀釋。 qRT-PCR 采用 SYBR Green I (購自 TaKaRa 公司）的試劑盒在 Applied Biosystems 75〇0 Real-Time PCR System(購自Applied Biosystems公司）上進行，每次反應每個樣品設置 3次重復。反應程序：95°C10 s;95°C5 s，60°C36 s，40個循環。以Actinl作為內標來判 斷OsNAP在中花11不同發育時期的表達情況。OsNAP基因的qRT-PCR引物序列為：正向引 物 F :5' _aaccatttcatcgcgaacaac_3,;反向弓|物 R :5' _cagtgacgatccctgcaagg_3,〇 Actinl 基因的qRT-PCR引物序列為：正向引物F :5' -tggcatctctcagcacattcc-3' ；反向引物R : 5'-tgcacaatggatgggtcaga_3'。結果表明：隨著葉片的衰老，OsNAP基因的表達量逐漸上升 (圖4)，說明是OsNAP基因一個葉片衰老相關基因。
[0051] 實施例2 :0sNAP基因抑制和超量表達載體的構建
[0052] (1)超量表達載體pl301_0sNAP的構建：
[0053] 1)將實施例1中含有OsNAP基因組DNA的陽性ΤΑ克隆用Nco I和BstE II雙酶 切，與經Nco I和BstE II雙酶切的載體pCAMBIA1301骨架片段連接。pCAMBIA1301載體圖 如圖1所示。
[0054] 2)將步驟1)中的連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞。
[0055] 3)通過抗性篩選和酶切檢測證實，重組載體pl301-0sNAP為載體pCAMBIA1301的 Nco I和BstE II位點間插入了如SEQ IDN0:1所示的核苷酸序列，重組載體pl301-0sNAP 的T-DNA區結構示意圖如圖2所示。
[0056] (2)RNAi載體的構建：
[0057] 1)取中花11衰老的葉片，利用Trizol試劑（購自Invitrogen公司）抽提 總RNA(提取方法參考Trizol試劑的操作手冊）。3yg總RNA用1 units RNase-free DNase I (購自Invitrogen公司）處理15 min以除去基因組DNA污染，然后加入0.5 mg 01igo(dT)15，l mM dNTPs，10mM dithiothreitol，200 units SuperScript?III反轉錄酶（購 自Invitrogen公司）進行反轉錄，終體積20μ 1。5(TC水浴1 h后，加20μ 1 ddH20對反轉 錄產物進行稀釋。
[0058] 2)以中花11衰老葉片RNA反轉錄的cDNA為模板，經PCR擴增OsNAP非保守的 3'-UTR 區域。PCR 反應程序：94°C5 min;94°C30 s，58°C30 s，72°C30 s，30 個循環；72°C7 min。引物序列為：正向引物 F : 5 ' -ATCggatccCCACCACCAACAACAACAAC-3 反向引物 R:5'_ ATCggtaccCTCAGTCCCAGTGACGATCC-3 '。
[0059] 3)回收PCR產物后，將其連入pGEM-T載體（購自Promega公司）。
[0060] 4)將連接產物轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，通過抗性篩選、酶切及測序檢測 (為常規方法），得到含有OsNAP非保守的3' -UTR區域的陽性TA克隆。
[0061] 5)對陽性TA克隆用Κρη I和BamH I進行酶切，然后分別連接到pMCG161和 pDS1301上（Yuan等，Mitogen-activated protein kinase 0sMPK6 negatively regulates rice disease resistance to bacterial pathogens. Planta, 2007,226:953-960),形 成 pMCG161-〇sNAP 和 pDS1301-0sNAP。再用 Sac I 和 Spe I 分別酶切 pMCG161-〇sNAP 和 pDS1301-0sNAP，將pMCG161-〇sNAP的外源和pDS1301-0sNAP的載體相互連接形成RNAi載 體，重組載體的T-DNA區結構示意圖如圖3所示。
[0062] 實施例3 :表達載體的轉化
[0063] 將上述構建好的表達載體導入農桿堿型的根癌農桿菌EHA105,構成轉化菌株。農 桿菌介導的遺傳轉化方法主要參照本 申請人:華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室 發表的"農桿菌介導的遺傳轉化操作手冊"所示的方法（林擁軍等，農桿菌介導的牡丹江8 號高效轉基因體系的建立，作物學報，2002, 28 :294-300)。具體步驟如下：
[0064] (1)試劑和溶液縮寫
[0065] 本發明中培養基所用到的植物激素的縮寫表示如下： 6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-節基腺噪呤）；CN(Carbenicillin,羧節青霉素）； KT(Kinetin，激動素）；NAA(Napthalene acetic acid,萘乙酸）；IAA(Indole-3_acetic 已(^(1，11引哚乙酸）；2,4-0(2,4-0;[(311101'0卩116110叉5^061:;^3(^(1，2,4-二氯苯氧乙酸）； AS(Acetosringone，乙醜丁香酮）；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白）； HN(Hygromycin B，潮霉素）；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞諷）；N6max(N6 大量兀素 成分溶液）；N6mix (N6微量元素成分溶液）；MSmax (MS大量元素成分溶液）；MSmix (MS微量 元素成分溶液）。
[0066] (2)主要溶液配方
[0067] 1) N6培養基大量元素母液（按照10 X濃縮液配制）：
[0068] 硝酸鉀（KN〇3) 28.3 g 磷酸二氫鉀（KH2P〇4) 4.0 g 硫酸銨（(NH4)2S04) 4.63 g 硫酸鎂（MgS047H20) 1,85 g 氯化鈣（CaCl2_2H20) 1.66 g
[0069] 將上述試劑逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1000 ml。
[0070] 2) N6培養基微量元素母液（按照100 X濃縮液配制）
[0071] 碘化鉀（KI) 0.08 g 硼酸（H3B03) 0.16 g 硫酸錳（MnS〇4_4H20) 0.44 g 硫酸鋅（ZnS04_7H20) 0.15 g
[0072] 將上述試劑在室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000 ml。
[0073] 3)鐵鹽（Fe2+EDTA)貯存液（按照100X濃縮液配制）
[0074] 將 3. 73 g 乙二銨四乙酸二鈉（Na2EDTA · 2H20)和 2. 78 g FeS04 · 7H20 分別溶解， 混合并用蒸餾水定容至1000 ml，至70°C溫浴2 h，4°C保存備用。
[0075] 4)維生素貯存液（按照100 X濃縮液配制）
[0076] 煙酸（Nicotinic acid) 0.1 g 維生素B1 (Thiamine HC1) 0.1 g 維?.'/?Κ.Β? (Pyridoxinc I1C1) 0.1 g 甘氨酸（Glycine) 0.2 g 肌醇（Inositol) 10 g
[0077] 加蒸餾水定容至1000 ml，4°C保存備用。
[0078] 5) MS培養基大量元素母液（按照10 X濃縮液配制）
[0079] 硝酸銨（ΝΗ4Ν03) 16.5 g 硝酸鉀（KN〇3) 19.0 g 磷酸二氫鉀（KH2P〇4) l.7g 硫酸鎂（MgS04) 3.7 g 氯化鈣（CaCl2) 4.4 g
[0080] 將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000 ml。
[0081] 6) MS培養基微量元素母液（按照100 X濃縮液配制）
[0082] 硫酸錳（MnS04_4H20) 2.23 g 硫酸鋅（ZnS04.7H20) 0.86g 硼酸（H3B〇3) 0.62 g
[0083] 碘化鉀（ΚΙ) 0.083 g 鉬酸鈉（Na2Mo04.2H20) 0.025 g 硫酸銅（CuS04,5H20) 0.0025 g 氯化鈷（CoC12.6H20) 0.0025g
[0084] 將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000 ml。
[0085] 7) 2, 4-D 吧存液（1 mg/ml)的配制：
[0086] 稱取2, 4-D 100 mg，用1 ml 1 N氫氧化鉀溶解5 min，然后加10 ml蒸餾水溶解 完全后定容至100 ml,于室溫下保存。
[0087] 8) 6-BA 吧存液（1 mg/ml)的配制：
[0088] 稱取6-BA 100 mg，用1 ml 1 N氫氧化鉀溶解5 min，然后加10 ml蒸餾水溶解完 全后定容至100 ml,室溫保存。
[0089] 9)萘乙酸（NAA)貯存液（1 mg/ml)的配制：
[0090] 稱取NAA 100 mg，用1 ml 1 N氫氧化鉀溶解5 min，然后加10 ml蒸餾水溶解完 全后定容至100 ml，4°C保存備用。
[0091] 10)吲哚乙酸（IAA)貯存液（1 mg/ml)的配制：
[0092] 稱取IAA 100 mg，用1 ml 1 N氫氧化鉀溶解5 min，然后加10 ml蒸餾水溶解完 全后定容至100 ml，4°C保存備用。
[0093] 11)葡萄糖貯存液（0. 5 g/ml)的配制：
[0094] 稱取葡萄糖125 g，然后用蒸餾水溶解定容至250 ml，滅菌后4°C保存備用。
[0095] 12) AS貯存液的配制：
[0096] 稱取AS 0. 392 g，加入DMS0 10 ml溶解，分裝至1. 5 ml離心管內，4°C保存備用。
[0097] 13) 1N氫氧化鉀貯存液
[0098] 稱取氫氧化鉀5. 6 g,用蒸饋水溶解定容至100 ml,室溫保存備用。
[0099] (3)用于水稻遺傳轉化的培養基配方
[0100] 1)誘導培養基 [0101] N6max母液（取已經制備好的1〇χ濃縮液，下同） 100 ml N6mix母液（取已經制備好的10〇x濃縮液，下同） 10 ml Fe2+EDTAC：存液（取已經制備好的l〇〇x濃縮液，下同） l〇ml 維生素貯存液（取已經制備好的10〇x濃縮液，下同） 10 ml 2,4-D貯存液（取上述制備好的） 2.5 ml 脯氨酸（Prolinc.) 0.3 g CTT 0.6 g 蔗糖 30 g
[0102] Phytagel 3 g
[0103] 加蒸餾水至900 ml，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 9,煮沸并定容至1000 ml，分裝到 50 ml三角瓶（25 ml/瓶），封口后按常規方法滅菌（例如121°C下滅菌25 min，下述的培 養基滅菌方法與本培養基的滅菌方法相同）。
[0104] 2)繼代培養基
[0105] N6max母液（10χ) 100 ml N6mix母液（10〇x) 10 ml Fe2+EDTA貯存液（10〇x ) 10 ml 維生素貯存液（10〇x) 10 ml 2,4-D貯存液 2.0 ml 脯氨酸 0.5 g CTT 0.6 g 蔗糖 30 g Phytagel 3 g
[0106] 加蒸餾水至900 ml，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 9,煮沸并定容至1000 ml，分裝到 50 ml三角瓶（25 ml/瓶），封口，按上述方法滅菌。
[0107] 3)預培養基
[0108] N6max母液（10χ) 12.5 ml N6mix母液（10〇x) 1.25 ml Fe2+EDTA貯存液（10〇x) 2.5 ml 維生素貯存液（l〇〇x) 2.5 ml 2.4- D貯存液 0.75 ml CH 0 15 g 鹿糖 5 g 瓊脂粉 1.75 g
[0109] 加蒸餾水至250 ml，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 6,封口，按上述方法滅菌。
[0110] 使用前加熱溶解培養基并加入5 ml葡萄糖貯存液和250 μ 1 AS貯存液，分裝倒入 培養皿中（25 ml/皿）。
[0111] 4)共培養基
[0112] N6max母液（1〇χ) 12.5 ml N6mix母液（10〇x) 1.25m! Fe2+EDTAC：存液（l〇〇x) 2.5 ml 維生素貯存液（l〇〇x) 2.5 ml
[0113] 2.4- D貯存液 0.75 ml CH 0.2 g 庶糖 5 g 瓊脂粉 1.75 g
[0114] 加蒸餾水至250 ml，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 6,封口，按上述方法滅菌。
[0115] 使用前加熱溶解培養基并加入5 ml葡萄糖貯存液和250 μ 1 AS貯存液，分裝倒入 培養皿中（25 ml/每皿）。
[0116] 5)懸浮培養基
[0117] N6max 丨1/:液（Ι〇χ .) 5 ml N6mixllh^(IO〇x) 0.5 ml Fc2H"nDT/\!)!:、:iV:液（l〇〇x ) 0.5 ml 維生素貯存液（l〇〇x) 1 ml 2.4- D貯存液 0.2 ml CIT 0.08 g 蔗糖 2g
[0118] 加蒸餾水至100 ml，調pH值到5. 4,分裝到兩個100 ml的三角瓶中，封口，按上述 方法滅菌。
[0119] 使用前加入1 ml無菌葡萄糖貯存液和100 μ 1 AS貯存液。
[0120] 6)選擇培養基
[0121] N6max母液（1〇χ) 25 ml N6mix母液（10〇χ) 2.5 ml Fe2+EDTAC：存液（l〇〇x) 2.5 ml 維生素貯存液（l〇〇x) 2.5 ml 2,4-D貯存液 0.625 ml C1T 0.15 g 鹿糖 7.5 g 瓊脂粉 1.75 g
[0122] 加蒸餾水至250 ml，調節pH值到6.0,封口，按上述方法滅菌。
[0123] 使用前溶解培養基，加入250 μ 1 HN(50 mg/ml)和400 μ 1 CN(250 mg/ml)分裝倒 入培養皿中（25 ml/皿）。（注：第一次選擇培養基羧芐青霉素濃度為400 mg/1，第二次及 以后選擇培養基羧節青霉素濃度為250 mg/1)。
[0124] 7)分化培養基
[0125] N6max母液（10χ) 100 ml
[0126] N6mix丨:j:液 ΠΟΟχ) I0 ml FpEDTAF:介:液（10〇x ) ΙΟ ml 維生素存液（100χ) 10 ml 6-BA貯存液 2 ml KT貯存液 2 ml NAAfC存液 0.2 ml IAA貯存液 0.2 ml Cl! 1 g 蔗糖 30 g Phvtagcl 3 g
[0127] 加蒸餾水至900 ml，1 N氫氧化鉀調節pH值到6. 0。煮沸并用蒸餾水定容至1000 ml，分裝到50 ml三角瓶（50 ml/瓶），封口，按上述方法滅菌。
[0128] 8)生根培養基
[0129] MSmax母液（1〇χ) 50 ml MSmix母液（10〇x ) 5 ml Fe2+EDTA貯存液（100x) 5 ml 維生素貯存液（10〇x) 5 ml 蔗糖 20 g Phvtagcl 3 g
[0130] 加蒸餾水至900 ml，用IN氫氧化鉀調節pH值到5. 8。煮沸并用蒸餾水定容至1000 ml，分裝到生根管中（25 ml/管左右），封口，按上述方法滅菌。
[0131] (4)農桿菌介導的遺傳轉化步驟
[0132] 1)愈傷誘導
[0133] 將成熟的中花11水稻種子去殼，然后依次70%的乙醇處理1 min，0. 15%氯化汞 (HgCl2)溶液處理15 min，滅菌水清洗4-5次后將種子轉移到誘導培養基上。將接種后的 培養基暗培養4周，溫度26 °C左右。
[0134] 2)愈傷繼代
[0135] 挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養基上暗培養2周，溫度 26°C左右。
[0136] 3)預培養
[0137] 挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預培養基上暗培養2周，溫度26°C左右。
[0138] 4)農桿菌培養
[0139] 首先在帶有對應抗性選擇的LA培養基（LA培養基的配制參照J.薩姆布魯克等， 分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等（譯），科學出版社，2002,北京）上預培養農桿菌 EHA105(該菌株來自CAMBIA公司公開使用的農桿菌菌株）2天，溫度28°C ;隨后，將農桿菌 轉移至懸浮培養基中，28°C搖床上培養2-3 h。
[0140] 5)農桿菌侵染
[0141] 首先調節農桿菌懸浮液至〇D_值為0. 8-1. 0,隨后將預培養的愈傷轉移至農桿菌 懸浮液中浸泡30 min，將愈傷轉移至滅菌好的濾紙上吸干，然后放置在共培養基上培養3d， 溫度 19-20°C。
[0142] 6)愈傷洗滌和選擇培養
[0143] 滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；浸泡在含400 mg/1 CN的滅菌水中30 min ;轉 移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；轉移愈傷至選擇培養基上選擇培養2-3次，每次2周。
[0144] 7)分化
[0145] 將抗性愈傷轉移至預分化培養基上于黑暗處培養5-7 d ;轉移預分化培養的愈傷 至分化培養基上，光照（1500-2000 lx)培養30-40 d，培養溫度26°C。
[0146] 8)生根
[0147] 剪掉分化時產生的根，然后將其轉移至生根培養基中光照（1500-2000 lx)培養 2-3周，培養溫度26 °C。
[0148] 9)移栽
[0149] 洗掉根上的殘留培養基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室。
[0150] 實施例4 :超量表達轉基因后代調控水稻葉片衰老進程的生物驗證分析
[0151] (1) 申請人:首先在水稻野生型（非轉基因）和T2代的OsNAP超量表達轉基因植株 (linel5、linel7和linel9)的苗期用qRT-PCR的方法驗證了 OsNAP基因的表達量。結果 顯示：和野生型相比，OsNAP的表達量在linel7和linel9中很高，而在linel5中則上升不 大（圖5中的a圖）。隨后在成熟期檢測了轉基因植株中OsNAP基因的表達量。結果顯示： 與野生型相比，linel5、linel7和linel9中OsNAP基因的表達量上升倍數不大，但是趨勢 和苗期相同（圖5中的b圖）。進一步說明OsNAP基因的表達量隨葉片的衰老而上升。
[0152] (2)表型觀察
[0153] 在抽穗后30天時，高表達轉基因家系linel7和linel9劍葉的葉尖變黃，而低表 達量家系linel5和野生型仍是綠色（圖6中的a圖）。在抽穗后40 d時，高表達轉基因家 系linel7和linel9劍葉葉片明顯比linel5和野生型的葉片要黃（圖6中的b圖）。
[0154] (3)葉綠素含量的測定
[0155] 葉綠素含量的測定采用丙酮分光光度計法。取約0.04 g水稻野生型（非轉基 因）和T2代的OsNAP超量表達轉基因植株（linel5、linel7和linel9)葉片樣品于葉綠 素抽提液（抽提液為丙酮：乙醇：水體積比=4. 5 :4. 5 :1)中，4°C抽提過夜，待葉片全部變 白后用分光光度計在663 nm和645 nm處測定樣品的吸光值，葉綠素含量按文獻方法進行 計算（Mao 等，Two complementary recessive genes in duplicated segments control etiolation in rice. Theor Appl Genet, 2011，122:373-383)，用 mg/g 葉鮮重來表不。結 果顯示：在抽穗后20 d左右時，高表達轉基因家系linel7和linel9劍葉的葉綠素含量與 低表達轉基因家系linel5和野生型相比沒有明顯差異；但是在抽穗后30 d左右時，linel7 和linel9劍葉的葉綠素含量明顯低于linel5和野生型，在抽穗后40 d左右時更為明顯 (圖 7)。
[0156] (4)凈光合速率的測定
[0157] 申請人:用光合測定儀CIRAS-2 (購自PP system公司）來測定水稻野生型（非轉 基因）和T2代的OsNAP超量表達轉基因植株（Iinel5、linel7和linel9)不同發育時期葉 片的凈光合速率，測定時間為上午9:00至11:00或者下午3:00至5:00。結果顯示：在抽 穗后20 d左右時，高表達轉基因家系linel7和linel9劍葉的凈光合速率與低表達轉基因 家系linel5和野生型相比沒有明顯差異；但是在抽穗后30 d左右時，linel7和linel9劍 葉的凈光合速率明顯低于linel5和野生型，在抽穗后40 d左右時更為明顯（圖8)。說明 OsNAP的超量表達植株加速了葉片的衰老。
[0158] 實施例5 :RNAi轉基因后代調控水稻葉片衰老進程的生物驗證分析
[0159] (1)表型觀察
[0160] 當野生型植株葉片表現出明顯的黃色時，轉基因家系RNAi-Ι和RNAi-2的葉片大 部分都是綠色的（圖9中的a)。在抽穗后50 d時，OsNAP的RNAi轉基因家系RNAi-Ι和 RNAi-2的劍葉衰老明顯延緩（圖9中的b)，同時野生型的倒二葉大部分已經變黃，而RNAi 轉基因家系的葉片只有尖端變黃（圖9中的c)。
[0161] (2)葉綠素含量的測定
[0162] 葉綠素含量的測定見實施例4。樣品來自于水稻野生型（非轉基因）和OsNAP的 RNAi轉基因家系（RNAi-Ι和RNAi-2)的葉片。結果顯示：2個RNAi轉基因家系（RNAi-Ι和 RNAi-2)葉片的葉綠素含量明顯高于野生型（圖10)。說明OsNAP的RNAi轉基因植株延緩 了葉片的衰老。
[0163] (3) 申請人:用qRT-PCR的方法在RNAi轉基因家系（RNAi-Ι和RNAi-2)中檢測了 OsNAP和OsDOS表達量的變化。結果顯示：和野生型相比，RNAi-Ι和RNAi-2中OsNAP的表 達量明顯下降；而RNAi-Ι和RNAi-2的葉片中OsDOS表達量明顯高于野生型（圖11)，OsNAP 的表達量越低，劍葉和倒二葉的葉綠素含量越高，同時OsDOS表達量也越高，說明OsNAP 的RNAi轉基因植株延緩了葉片的衰老。OsDOS基因的qRT-PCR引物序列為：正向引物F: 5 ' -ATGATGATGATGGGGGAAGG-3 ' ；反向引物 R : 5 ' -CTCACGGGGAGGTGAGACC-3 '。
[0164] 實施例6 :轉基因植株苗期抗旱性試驗
[0165] 將超量表達家系Iinel5、linel7和linel9在1/2 MS培養基（實施例3中的生根 培養基）發芽，一周后將幼苗種入小紅桶中。植株在正常生長條件下長至4葉期，進行斷水 干旱脅迫7 d，然后復水3 d，觀察表型，并拍照。結果顯示：斷水干旱脅迫7 d，復水3 d后， 野生型植株中花11葉片發黃后枯死，低表達量家系linel5葉片還有少許綠色，而高表達量 家系linel7和linel9的葉片大部分都是綠色的（圖12)。說明OsNAP的超量表達轉基因 植株可以增強抗旱能力。
[0001] 說明書序列表 <110〉華中農業大學 <120〉調控水稻葉片衰老和抗旱能力的基因及應用 <130> <141〉 2014-07-08 <160> 3 <170> Patentln version 3. 1 <210> 1 <211> 1895 <212> DNA <213> 水稻（Oryza sativa) <220> <221> gene <222〉 （1)..(1895) <223> <400> 1 ttcgccatgt gcaattatgt tcagtgttta atcaggctgt ggtattatgt acgaagaacg 60 agctatcagt tcatccccat gttagagtgg agcagcatct ggtggctcag tcccagtgac 120 gatccctgca aggcgctgcc tatttggaaa gttgcaccaa cgcatgaacc gttcggcttc 180 ttggccgccg cggcagcagg aggcagcgcc tggalcgtcg gctcgcctcc giccgatgat 240 ctcttgcgct tcccggtgac ggccggcggc tcgacgacgg cgcctgccga cgtcgaggcg 300 gccgcagagg aggacgggtc caggtgcgcg agctgaacca tgctgttgtt cgcgatgaaa 360 tggttcatga cggggtggcc aaagagggcg tgttgttgtt gttggtggtg gtggtggtcg 420 ggctgcctcg ccatctcctg caggggggcg gcggcggcgg cgccgccgtc gtcgaagagc 480 tgcgacagcg agtactcgtt gagcaggtcg gaaatggaag ggatcttctg catcgccgtc 540
[0002] ctctgcgtag cggcggcggc ggcgtgcagc gacgggaagg cgccggcggc agcgccctgc 600 aagatcatgg atgcggcgct cgacgacgac ggcgcgtaca gcggcgcgtt ctcctccagg 650 gcgcacggct cgtcctgctc gtggtcggag agcggcggca cggccagcgg cgacgcgtgg 720 ctgctcttct tgtagatccg gcacagcacc cagtcatcca gctgcacaaa aatccacgca 780 catcgatcga tcaatcacac ggatgcatat actatatgat taagaaatta agagtatcaa 840 aaatagaagg gattaatttc agggggtatg catgcgcgca tatgcagaga tgaaccagtc 900 atcaacacgt acgcatcgtg gctatcattg tcggatctat tgacttgcgc aaccatgcca 960 agtattgcct aaagaacacc crctttaaaa cagacacact aaaagcagcg agttgcgtcc 1020 attggcaagg cacaaaccga tgcgataata ctgacgtgcc gacgaacacg tatcgatcat 1080 cagaaacaac cacccaaaaa aaccacggtg tgcaactgtg caaglgcact agcacatcag 1140 acagagatga ataatagacg acctactclc tactccatcg atagcaagat ccagctgcta 1200 gggtttgttc ataat taagt tgtttggttt agataatttg aatctggctg ctaggtaacg 1260 tagatggagc Ltgcttaccc Icatggaggt gttgcggaac tLcatggggc ggcaggtgtt 1320 ggcggcgtgg gcgtctgcgg cggcgaggcg gtactcgtgc atgaiccagt tggtcltggt 1380 gcccttgggc gggcggccct tgtagaagac gagcgccttc ttgacgccga cgctctcgtt 1440 ggtcgccgcg ccgccgctgc tgtggatggg cttgtcggtg ccggtggcct tccagtagcc 1500 ggagcccgcg gcgcggttcg gccggatccc gttcgggtac tlgcggtccc tcgggctgaa 1560 gaagtaccac tccctgtccc cgtaattctc cttggctgat gcaaatcaaa acacaagtcg 1620 atcaccaacg aaattaattg caaatcagtg atcgatcgat cgcggcgagc tgtgagggtg 1680 ggtactaaca tgggaggtcc cacggatcga acttgtagat gtcgacgtcg gcgatgatgg 1740 agacggggca cggcgaggag gcggcccggt tgcggaggta gtgcacgatc agctcctcgt 1800 ccgtcgggtg gaaccggaac cccggcggca gcatcgccgg gttcgacaga accatcgtct 1860
[0003] ccggcagtca cccacacaca acacacacct ccctg 1895 <210> 2 <211〉 1783 <212> DNA <213〉水稻（Oryza sativa) <220〉 <221> gene <222> (1)..(1783) <223> <220〉 <221> CDS <222〉（172). . (1350) <223〉 <400> 2 gccctcctcc atctctcgcc tcctcttgat acaagctcga ccctgataga tctcatagat 60 catagctgag aggggatcga gtggcttgat cttggaagtg agcagctata gctagatagg 120 ttttgcttgt gcagggaggt gtgtgttgtg tgtgggtgac tgccggagac g atg gtt 177 Met Val 1 ctg teg aac ccg geg atg ctg ccg ccg ggg ttc egg ttc cac ccg aeg 225 Leu Ser Asn Pro Ala Met Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr 5 10 15 gac gag gag ctg ate gtg cac tac etc ege aac egg gee gee tee teg 273 Asp Glu Glu Leu lie Val His Tyr Leu Arg Asn Arg Ala Ala Ser Ser 20 25 30 ccg tgc ccc gtc tee ate ate gee gac gtc gac ate tac aag ttc gat 321 Pro Cys Pro Val Ser lie lie Ala Asp Val Asp lie Tyr Lys Phe Asp 35 40 45 50 ccg tgg gac etc cca tee aag gag aat tac ggg gac agg gag tgg tac 369 Pro Trp Asp Leu Pro Ser Lys Glu Asn Tyr Gly Asp Arg Glu Trp Tyr 55 60 65
[0004] ttc ttc age ccg agg gac ege aag tac ccg aac ggg ate egg ccg aac 417 Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly lie Arg Pro Asn 70 75 80 ege gee geg ggc tee ggc tac tgg aag gee acc ggc acc gac aag ccc 465 Arg Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Thr Asp Lys Pro 85 90 95 ate cac age age ggc ggc geg geg acc aac gag age gtc ggc gtc aag 513 He His Ser Ser Gly Gly Ala Ala Thr Asn Glu Ser Val Gly Val Lys 100 105 110 aag geg etc gtc ttc tac aag ggc ege ccg ccc aag ggc acc aag acc 5bl Lys Ala Leu Val Phe Tyr Lys Gly Arg Pro Pro Lys Gly Thr Lys Thr 115 120 125 130 aac tgg ate atg cac gag tac ege etc gee gee gca gac gee cac gee 609 Asn Trp lie Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Ala Ala Asp Ala His Ala 135 140 145 gee aac acc tac ege ccc atg aag ttc ege aac acc tee atg agg ctg 557 Ala Asn Thr Tyr Arg Pro Met Lys Phe Arg Asn Thr Ser Met Arg Leu 150 155 160 gat gac tgg gig ctg tgc egg ate tac aag aag age age cac geg teg 705 Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg lie Tyr Lys Lys Ser Ser His Ala Ser 165 170 175 ccg ctg gee gtg ccg ccg etc tee gac cac gag cag gac gag ccg tgc 753 Pro Leu Ala Val Pro Pro Leu Ser Asp His Glu Gin Asp Glu Pro Cys 180 185 190 gee ctg gag gag aac geg ccg ctg tac geg ccg teg teg teg age gee 801 Ala Leu Glu Glu Asn Ala Pro Leu Tyr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ala 195 200 205 .210 gca tee atg ate ttg cag ggc get gee gee ggc gee ttc ccg teg ctg 849 /Ua Ser Met He Leu G丄n G丄y Ala Ala Gly A丄a Phe Fro Ser Leu 215 220 225 cac gee gee gee gee get aeg cag agg aeg geg atg cag aag ate cct 897 His Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gin Arg Thr Ala Met Gin Lys lie Pro 230 235 240
[0005] tcc att tcc gac ctg etc aac gag tac teg ctg teg cag etc ttc gac 945 Ser lie Ser Asp Leu Leu Asn Glu Tyr Ser Leu Ser Gin Leu Phe Asp 245 250 255 gac ggc ggc gcc gcc gcc gcc gcc ccc ctg cag gag atg geg agg cag 993 Asp Gly Glv Ala Ala Ala Ala Ala Pro Leu Gin Glu Met Ala Arg Gin 260 265 270 ccc gac cac cac cac cac caa caa caa caa cac gcc etc ttt ggc cac 1041 Pro Asp His His His His Gin Gin Gin Gin His Ala Leu Phe Gly His 275 280 285 290 ccc gtc atg aac cat ttc ate geg aac aac age atg gtt cag etc geg 1089 Pro Val Met Asn His Phe lie Ala Asn Asn Ser Met Val Gin Leu Ala 295 300 305 cac ctg gac ccg tcc tcc tet geg gcc gcc teg aeg teg gca ggc gcc 1137 His Leu Asp Pro Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ser Thr Ser Ala Gly Ala 310 315 320 gtc gtc gag ccg ccg gcc gtc acc ggg aag ege aag aga tea teg gac 1185 Val Val Glu Pro Pro Ala Val Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Ser Asp 325 330 335 gga ggc gag ccg aeg ate cag geg ctg cct cct gel gcc geg geg gcc 1233 Gly Gly Glu Pro Thr lie Gin Ala Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ala 340 345 350 aag aag ccg aac ggt tea tgc gtt ggt gca act ttc caa ata ggc age 1281 Lys Lys Pro Asn Gly Ser Cys Val Gly Ala Thr Phe Gin lie Gly Ser 355 360 365 370 gcc ttg cag gga teg tea ctg gga ctg age cac cag atg ctg etc cac 1^29 Ala Leu Gin Gly Ser Ser Leu Gly Leu Ser His Gin Met Leu Leu Ilis 375 380 ：^85 tet aac atg ggg atg aac tga tagetegtte ttcgtacata ataccacagc 1380 Ser Asn Met Gly Met Asn 390 ctgattaaac actgaacata attgcacatg gegaattgat gatttgaaca glgaggtcta 1440 tttcgaaagc aaataggtcc aaaacgatag atttaaatag xaaatatatt gggaaagaaa 丄bOO
[0006] ttgtacttaa tttgtacttg tgtggactag ctaggtcgtc cgatcatgca tagctatata 1560 gtttgtggtg tgtatacatt ttttctcatg gtactatact actgtgtact caagctagct 1620 cagtactaaa gattaattaa gctagatagg ggttgataag actttgagat agacccacta 1680 gaagtctgga acatgagatc aaggagaatg atgtcaagat cataaagccg gatttatagc 1740 tcatattcat gtaaatcaat caataagtga ttcttraatg gcg 1783 <210> 3 <211> 392 <212> PRT <213〉水稻（Oryza sativa) <400〉 3 Met Yal Leu Ser Asn Pro Ala Met Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His 15 10 15 Pro Thr Asp Glu Glu Leu lie Val His Tyr Leu Arg Asn Arg Ala Ala 20 25 30 Ser Ser Pro Cys Pro Val Ser lie I]e A]a Asp Val Asp lie Tyr Lys 35 40 45 Phe Asp Pro 1'rp Asp Leu Pro Ser Lys G_Lu Asn Tyr G_Ly Asp Arg Glu 50 55 60 Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly lie Arg 65 70 75 80 Pro Asn Arg Ala. Ala Gly Ser Gly Tyr Trp lys Ala, Thr Gly Thr Asp 85 90 95 Lys Pro lie His Ser Ser Gly Gly Ala Ala Thr Asn Glu Ser Val Gly 100 105 110
[0007] Val Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Lys Gly Arg Pro Pro Lys Gly Thr 115 120 125 Lys Thr Asn Trp lie Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Ala Ala Asp Ala 130 135 140 His Ala Ala Asn Thr Tyr Arg Pro Met Lys Phe Arg Asn Thr Ser Met 145 150 155 160 Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg lie Tyr Lys Lys Ser Ser His 165 170 175 Ala Ser Pro Leu Ala Val Pro Pro Leu Ser Asp His Glu Gin Asp Glu 180 185 190 Pro Cys Ala Leu Glu Glu Asn Ala Pro Leu Tyr Ala Pro Ser Ser Ser 195 200 205 Ser Ala Ala Ser Met lie Leu Gin Gly Ala Ala Ala Gly Ala Phe Pro 210 215 220 Ser Leu His Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gin Arg Thr Ala Met Gin Lys 225 230 235 240 lie Pro Ser lie Ser Asp Leu Leu Asn Glu Tyr Ser Leu Ser Gin Leu 245 250 255 Phe Asp Asp Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Pro Leu Gin Glu Met Ala 260 265 270 Arg Gin Pro Asp His His His His Gin Gin Gin Gin His Ala Leu Phe 275 280 285
[0008] Gly His Pro Val Met Asn His Phe lie Ala Asn Asn Ser Met Val Gin 290 295 300 Leu Ala His Leu Asp Pro Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ser Thr Ser Ala 305 310 315 320 Gly Ala Val Val Glu Pro Pro Ala Val Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser 325 330 335 Ser Asp Gly Gly Glu Pro Thr lie Gin Ala Leu Pro Pro Ala Ala Ala 340 345 350 Ala Ala Lys Lys Pro Asn Gly Ser Cys Val Gly Ala Thr Phe Gin lie 355 360 365 Gly Ser Ala Leu Gin Gly Ser Ser Leu Gly Leu Ser His Gin Met Leu 370 375 380 Leu His Ser Asn Met Gly Met Asn 385 390
【權利要求】
1. 一個來源于水稻的OsNAP基因在調控葉片衰老進程和抗旱能力中的應用，其特征在 于，所述的基因是下列序列之一： 1. SEQ ID NO :1所示的基因組核苷酸序列； 2. SEQ ID NO :2所示的全長cDNA核苷酸序列。
2. -個來源于水稻的OsNAP基因的編碼蛋白在調控葉片衰老進程和抗旱能力中的應 用，其特征在于，所述的基因編碼蛋白質的序列如序列表SEQ ID NO :3所不。
3. 如權利要求1所述的基因 OsNAP的應用，其特征在于，將含有權利要求1所述基因 OsNAP的表達載體轉入水稻，以超量表達該基因從而加速葉片衰老進程和/或提高苗期抗 旱能力，還包括通過抑制該基因的表達從而延緩葉片衰老進程。
4. 一種改變目標植物葉片衰老進程的方法，其特征在于，通過提高權利要求1所述基 因 OsNAP的表達量來加速葉片衰老進程或通過下調權利要求1所述基因 OsNAP的表達量來 延緩葉片衰老進程。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的目標植物為單子葉植物或雙子葉植 物。
6. 如權利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的單子葉植物為水稻、玉米、小麥和 草坪草。
7. 如權利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的雙子葉植物為擬南芥、楊樹、大豆 和棉花。
【文檔編號】C07K14/415GK104120137SQ201410362588
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】林擁軍, 周勇 申請人:華中農業大學