專利名稱：未變性天然魚膠原的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種未變性天然魚膠原的制備方法，屬于生物醫用材料的制備領域。
背景技術：
膠原蛋白或稱膠原，是一種纖維狀蛋白質，是重要的動物蛋白之一。膠原廣泛地存在于各類動物體內，從脊椎動物到魚類、兩棲類、鳥類和哺乳類等動物的皮膚、腱、軟骨、各種內臟器官、血管壁以及食道等處都有膠原。脊椎動物體內所有蛋白質中膠原占據了總量的30％，是主要的結構蛋白質，皮膚含有膠原50％以上。
未變性天然膠原(即生物活性膠原)，是一種生物大分子，分子量約為30萬。其結構仍然保持在動物體內時的天然結構，即膠原的三股螺旋結構，這種天然膠原蛋白被看作是生物體的一個組成部分而不被認為是外來物質。天然膠原有利于細胞的存活和生長、能促進血小板凝結、低抗原性和良好的生物相容性等功能，在燒傷、創傷、眼角膜疾病、美容、矯形、硬組織修復方面已得到廣泛應用。Chi H.Lee，Anuj Singla andYugyung Lee，Biochemical applications of collagen，International Journal of Pharmaceutics，2001，2211-22.由于未變性天然膠原還具有優良的保濕性能和促進表皮細胞生長繁殖，所以可有效地增強皮膚彈性、減少皺紋，所以也用于高檔化妝品中。Chvapil，M.andEckmayer，Z.，Role of proteins in cosmetics，International Journal of Cosmetic Science，1985，741-49。
未變性天然膠原的廣泛應用必然對膠原的需求量和質量的要求越來越高。目前國內所使用的未變性天然膠原主要來自于豬和牛等屠宰動物的皮膚或跟腱中，但由于全球一體化趨勢等因素，使瘋牛病和口蹄疫等動物傳染性疾病在全球普遍流行，并且目前尚無有效的治療方法。于是探求更高質量和更高安全性的天然膠原的來源就顯得非常重要。而從人體如胎盤中提取的膠原雖安全，但數量有限。相對于豬、牛等陸生動物膠原蛋白，水產動物膠原蛋白在使用安全性方面顯示其優勢。Yuko Ushiki，ShunjiHattori and Shinkichi Irie，Safety aspect of collagen as a raw material for biomedicalapplication，Fragrance Journal，1997，742-47。
世界上海域遼闊，海岸線長，海洋漁業資源豐富，種類繁多。僅魷魚的捕獲量，每年世界總量就達250萬噸以上，中國每年魷魚的捕獲量也有近25萬噸。海洋生物的多樣性、多量性都決定了海洋生物在膠原方面的利用，且魚類，特別是海洋魚類受環境污染小，可以得到最天然安全的天然膠原。中國是一個水產大國，無論海產魚還是河魚都相對豐富。幾條大江貫串了整個中國，河魚是內陸地區的主要食物之一，盡管也受到環境方面的一些影響，但隨著科學養魚的發展，各種魚類數量日益增多。因此，魚膠原提取用原材料是相當可觀的。
目前從魚類提取的魚膠原蛋白主要用于(1)啤酒、葡萄酒等生產過程中的澄清劑；Roger B.Boulton，Vernon L.Singleton，Linda F.Bisson，Ralph E.Kunkee著，趙光鰲，尹卓容，張繼民，楊明，李記明譯，《葡萄酒釀造學——原理及應用》，中國輕工業出版社，2001，P276-277。(2)美容飲料。秦玉青，劉承初，魷魚皮膠原蛋白的測定與回收，《上海水產大學學報》，2002，11(2)138-144。這些魚膠原蛋白主要成分是水解膠原蛋白，而水解膠原蛋白是已經發生變性了的膠原蛋白，它不具有生物活性，不屬于未變性天然膠原的范疇。
由于魚生長在水中，魚生活的環境決定了魚膠原的變性溫度低于陸生動物豬、牛等膠原的變性溫度。一般從豬、牛的組織提取的未變性天然膠原變性溫度為38-44℃，而河魚天然膠原的變性溫度為20-28℃，海產魚類天然膠原的變性溫度更低，一般只有12-25℃(因魚的種類不同而不同)。由于魚類膠原變性溫度低，現有從豬、牛等陸生動物組織提取未變性天然膠原的制備技術并不適宜制備未變性天然魚膠原。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種未變性天然魚膠原的制備方法，其特點是用有機溶劑和非離子表面活性劑脫脂，EDTA溶液除鈣，于低溫和酸性條件下用蛋白酶提取獲得未變性天然魚膠原。
本發明的目的由以下技術措施實現，其中所述原料份數除特殊說明外，均為重量份數。
未變性天然魚膠原的制備方法1、原料的預處理選用富含膠原的冷凍海產魚皮或新鮮河魚皮，去鱗、去肉，切成0.2-2cm的小塊100重量份，用醚2-5重量份，浸泡5-24小時或與水以任意比例混合的非離子表面活性劑5-10重量份浸泡5-24小時，過濾，加入0.1-4M EDTA溶液500-700重量份浸泡24-48小時，攪拌，過濾。所有操作的溫度為4-6℃。所得沉渣作為以下提取原料備用。
2、未變性天然魚膠原的提取預處理后的魚皮碎塊100重量份，蛋白酶10-20重量份，用酸調節pH＝2-4，在4-6℃低溫下處理1-3天，獲得未變性天然魚膠原蛋白液。
3、提取物的純化將上述膠原蛋白液用16000-20000rpm高速離心機分離，除去濾渣，上清液中加入0.5-5M NaCl鹽析，所得沉淀經離心分離后用0.1-2M乙酸溶解，如此反復鹽析操作3-5次，再經膜透析處理3次，獲得濃度為0.5-2％的未變性天然魚膠原純溶液。
脫脂劑為乙醚、石油醚、乙二醇乙醚或者脂肪酸聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚非離子表面活性劑脫脂中的至少一種。
蛋白酶為胃蛋白酶、537蛋白酶或者真菌復合酶中的任一種。
制得的天然魚膠原用差式掃描量熱計進行測試，得到的未變性天然魚膠原測試結果詳見圖1所示。結果表明河魚膠原變性溫度為20-28℃，海產魚膠原變性溫度為12-25℃。分子量測試采用SDS-PAGE凝膠電泳法，詳見圖2所示。結果表明其α鏈、β鏈、γ鏈分子量分別為10萬、20萬和30萬。這種具有生物活性的未變性天然魚膠原可代替豬、牛天然膠原用于組織工程、外科手術用止血纖維等生物醫學領域，也可用于高級美容化妝品、保健品。
四

圖1為魚膠原的DSC熱變性溫度測試圖。
圖2為魚膠原的SDS-PAGE電泳分離圖。
五具體實施例方式
下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是本實施例用于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護的限制，該領域的技術熟練人員可以根據上述本發明的內容，作出一些非本質的改進和調整。
實施例1將宰殺后的新鮮草魚，取皮，除去鱗片，刮去多余的肉類組織，用高純水洗凈后，切成0.2-2cm的小碎塊，取小碎塊100g，加入乙醚2g、石油醚3g混合液中浸泡24小時，在0.5M EDTA溶液700g中攪拌24小時。用酸調節pH至2-4，加入胃蛋白酶12g，于溫度為4-6℃，攪拌48小時。離心除去未溶解部分，上清液中加入1MNaCl鹽析，用2M乙酸溶解沉淀，鹽析反復處理3次。得到澄清的濃度為1-2％的粘稠狀未變性天然魚膠原溶液500g。
實施例2取已經水洗干凈的冷凍魷魚皮，用高純水洗凈后，切成0.2-2cm的小碎塊，取100g，放入乙二醇乙醚3g、脂肪酸聚氧乙烯醚2g、烷基酚聚氧乙烯醚3g中浸泡24小時，在1M EDTA溶液600g中攪拌24小時，用酸調節pH至2.5-3.5，加入537蛋白酶10g，于溫度4-6℃下攪拌48小時，經離心分離除去未溶解部分，上層清液中加入3M NaCl鹽析、用0.5M乙酸溶解，鹽析反復處理4次，得到濃度為0.5-1.0％未變性天然魚膠原約400g。
實施例3取冷凍三文魚皮，用刀盡量刮去下層肉類組織，并去盡鱗片，水洗干凈，切成碎狀小塊。取100g，加入乙二醇乙醚4g、脂肪酸聚氧乙烯醚3g、烷基酚聚氧乙烯醚3g的復配物非離子表面活性劑配成的500ml水溶液中浸泡48小時。過濾后在含有2M EDTA的溶液500g中攪拌40小時，過濾，用酸調節pH值2-3.5，加入真菌類復合蛋白酶15g，于溫度4-6℃下攪拌72小時，經離心分離除去未溶解部分，上層清液加入5M NaCl鹽析，1M乙酸溶解，鹽析反復處理5次，得到濃度為0.5-1％的未變性天然魚膠原液450g。
權利要求
1.未變性天然魚膠原的制備方法，其特征在于(1)原料的預處理選用富含膠原的冷凍海產魚皮或新鮮河魚皮，去鱗、去肉，切成0.2-2cm的小塊100重量份，用醚2-5重量份，浸泡5-24小時或與水以任意比例混合的非離子表面活性劑5-10重量份浸泡5-24小時，過濾，加入0.1-4M EDTA溶液500-700重量份浸泡24-48小時，攪拌，過濾，所有操作的溫度為4-6℃，所得沉渣作為以下提取原料備用。(2)未變性天然魚膠原的提取將上述已預處理的原料100重量份，蛋白酶10-20重量份，用酸調節pH＝2-4，于溫度4-6℃下緩慢攪拌1-3天，得到未變性天然魚膠原蛋白液。(3)提取物的純化將上述魚膠原蛋白液，用16000-20000rpm高速離心機分離，除去濾渣，上層清液加入0.5-5M NaCl鹽析，所得沉淀經離心分離后用0.1-2M乙酸溶解，如此反復鹽析處理3-5次，再經膜透析處理3次，獲得濃度為0.5-2％的高純度未變性天然魚膠原溶液。
2.如權利要求書1所述未變性天然魚膠原的制備方法，其特征在于醚為乙醚和石油醚脫脂或者乙二醇乙醚、脂肪酸聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚非離子表面活性劑脫脂中的至少一種。
3.如權利要求書1所述未變性天然魚膠原的制備方法，其特征在于蛋白酶為胃蛋白酶、537酸性蛋白酶或真菌復合酶中的任一種。
全文摘要
本發明公開了一種未變性天然魚膠原的制備方法。其特點是選取富含膠原蛋白的冷凍海產魚皮或新鮮河魚皮100重量份，用醚2－5重量份或與水以任意比例混合的非離子表面活性劑5－10重量份溶液中浸泡5－24小時，過濾，用0.1－4M EDTA溶液500－700重量份中攪拌處理24－48小時。過濾后的沉渣100重量份，加入蛋白酶10－20重量份，用酸調節pH＝2－4，于溫度4－6℃攪拌1－3天，離心過濾得到的膠原溶液中加入0.5－5MNaCl鹽析、反復處理3－5次，膜透析處理3次，得到濃度為0.5－2％的高純度未變性天然魚膠原蛋白液。用差熱儀測得變性溫度河魚天然膠原為20－28℃、海產魚天然膠原12－25℃，電泳法測得其含有α鏈、β鏈和γ鏈的分子量分別為10萬、20萬和30萬。
文檔編號C08H1/06GK1597741SQ20041004048
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月19日 優先權日2004年8月19日
發明者李國英, 石碧 申請人:四川大學