專利名稱：從淡水魚魚鱗中制備未變性膠原蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)天然產(chǎn)物的化學的提取領域，具體涉及一種從魚鱗中制備未變性膠原蛋白的 方法。
背景技術：
膠原(Collagen)蛋白是一種重要的功能性蛋白質(zhì)，它與細胞增生、分化、運動、免疫、 關節(jié)潤滑、傷口愈合等密切相關。由于膠原蛋白的特殊功能，其提取物已被廣泛應用于醫(yī)藥、 食品、日用化工、生物合成等工業(yè)領域，如醫(yī)用膠囊、外科手術材料、食用明膠、照相明膠、 化妝品等。目前生產(chǎn)的膠原蛋白制品的原料主要來源是從豬、牛等陸生哺乳動物的皮、骨和 肌腱，因近年來隨著全球生態(tài)環(huán)境惡化導致許多瘋牛病、口蹄疫等流行病的發(fā)生，使得從陸 生動物皮、骨中提取膠原蛋白的危險性增大。歐美、閂本等國家相繼出臺了不少法規(guī)，限制 從牛等哺乳動物皮骨中提取物用于食品醫(yī)藥等對人體直接影響的產(chǎn)品中。因此，從水生動物 魚體廢棄物中提取安全、衛(wèi)生、無害的膠原蛋白已成為當前國內(nèi)外業(yè)內(nèi)人士研發(fā)的一個熱門 課題。
分析顯示，膠原蛋白含量占魚體總蛋白的25-30%,主要分布于魚鱗和魚皮中，且魚鱗、 魚皮中的粗膠原蛋白就約占80%，而一般水產(chǎn)加工中都將魚鱗、魚皮作為廢棄物扔掉的，尤 其是魚鱗。因此，充分而合理地利用廢棄物魚鱗提取膠原蛋白不僅可推動水產(chǎn)加工業(yè)的發(fā)展， 而且能化廢為寶、減少環(huán)境污染，更好地造福于人類。我國是世界上最大的淡水魚養(yǎng)殖國， 據(jù)不完全統(tǒng)計，每年廢棄魚鱗約達5萬噸，魚鱗資源相當豐富，目前國內(nèi)己有多家魚鱗收購 公司，將魚鱗曬干作為一種資源出口。國外如F1本也十分看好中國魚鱗資源，并將在中國籌 建生產(chǎn)基地共同開發(fā)魚鱗膠原蛋白產(chǎn)品。
目前國內(nèi)外公開發(fā)表的有關利用魚體廢棄物資源提取膠原蛋白的研究文獻不少，以魚皮 為原料制取膠原蛋白較多， 一般可采用酸堿處理法和酶解法。而魚鱗膠原蛋白提取工藝通常 采取以下工藝流程魚鱗一清洗涼干一酸堿脫鹽處理一熬膠一過濾一濃縮一凝固一切片一干 燥一粉碎制成品。上海水產(chǎn)研究所文獻報道了制取魚鱗膠原蛋白新工藝，其釆用魚鱗一清洗 —脫脂一脫灰一熱熔法一酶解一脫色一精濾一濃縮一滅菌一干燥一膠原蛋白粉末的制作工 藝。專利號為CN1628540的文獻涉及其以魚鱗為原料，經(jīng)清洗處理(去魚鱗表面粘稠物及雜質(zhì))、干燥去腥、酸堿法脫灰脫脂，后迸行高壓催化蒸解，提煉液體狀魚鱗膠原蛋白產(chǎn)品。專 利CN1582771涉及一種用魚皮生產(chǎn)膠原蛋白工藝將魚皮洗凈浸入稀堿水(NaOH或NaHCO》中 去除其雜蛋白，用醋酸水溶液溶解膠原蛋白后加食品酶和風味酶水解，使膠原蛋白形成小分 子，經(jīng)除苦、脫色、濃縮、干燥，即制成膠原蛋白肽。專利CN1560270還利用廢棄物魚皮膠 原蛋白，以復合酶分步定向水解法生產(chǎn)降血壓活性肽。其將魚皮膠原蛋白放入磷酸緩沖溶液 中，加入菠蘿蛋白酶進行酶解，滅酶后用堿調(diào)pH至7.0-8.0，再加入Alcalase堿性蛋白酶 酶解、滅酶、冷卻至常溫，凍干后制得其降血壓活性肽。專利CN1382806通過堿溶液處理深 海魚皮，再利用限制性酶解法處理魚皮，凈化酶解上清液即得可降解生物相容性的魚皮膠原 蛋白。日本專利JP2001200000公丌了從海洋生物鮭魚魚皮中提取膠原蛋白的制備方法，先對
魚皮進行脫脂脫灰酸法處理，然后進行蛋白酶酶解、過濾、脫色、精濾、濃縮、滅菌干燥制 得膠原蛋白粉。美國專利US2002164681提及從魚皮、豬或牛皮中，采用蛋白酶酶解法提取制 備膠原質(zhì)，其中蛋白酶可選用木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶等，經(jīng)脫脂脫磷、酸處理后可得到生 物相容性好的魚皮膠原蛋白。歐洲專利EP682873公丌了從海洋動物魚體廢棄物中采用胃蛋白 酶、胰蛋白酶等酶解處理方法制得魚體膠原蛋白。
上述專利或?qū)＠暾埗嘁贼~皮為研究對象，與本發(fā)明的主題有很大的差別，且傳統(tǒng)魚類 膠原蛋白提取大都采用氫氧化鈉和鹽酸或氯化鈉和鹽酸浸泡等前處理去雜脫鈣，豐富的鈣質(zhì) 未能得到有效利用，提取過程中有大量腐蝕性物質(zhì)(氫氧化鈉、鹽酸等)介入，而且很多工 藝還采用高溫高壓或酶解處理，所得產(chǎn)物均為水解或變性的膠原肽，不屬于未變性膠原蛋白 的范疇。Nagai等的文獻報道了一種從海水魚魚鱗中提取天然膠原蛋白的方法，但提取過程 中也是采用氫氧化鈉浸泡等去雜，Tris-HCl及EDTA脫鈣，生產(chǎn)過程中三廢污染嚴重，前處 理工藝就需7天，提取周期長，難以實現(xiàn)工業(yè)化；雖然專利CN1597741涉及一種未變性天然 魚膠原制備法，以魚皮為原料，用醚或與水混合的非離子表面活性劑溶液中浸泡5-24h，過 濾后用EDTA溶液撹拌處理24-48 h。在過濾后沉渣中加入蛋白酶，用pH=2-4酸調(diào)節(jié)與攪拌， 在離心過濾得到的膠原溶液中加入NaCl鹽析，經(jīng)膜透析反復處理得到高純度的未變性天然魚 膠原蛋白液。此專利的主體與本發(fā)明明顯不同，同時其具體提取方法與本發(fā)明也有很大差別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，研制一種從淡水魚副產(chǎn)物中特別是從淡水魚 鱗中提取天然膠原蛋白的方法。本發(fā)明不僅工藝簡便、實用，提取周期大大縮短，提取率高，
能耗低，生產(chǎn)成本較低，整個提取過程都沒有毒害或腐蝕性物質(zhì)的涉入，對環(huán)境無污染，且
所提膠原蛋白為未變性膠原蛋白，可大大提高水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的附加值，產(chǎn)生明顯的經(jīng)濟效益和社會效益。
本發(fā)明所述的制備方法包括以魚鱗的預處理、脫鈣、膠原蛋白的提取、分離等處理過程。 具體為-
一種從淡水魚鱗中提取未變性膠原蛋白的方法，其步驟包括魚鱗預處理、脫鈣、膠原蛋 白提取和分離，其特征在于以下歩驟-
(1) 魚鱗的預處理將洗凈的魚鱗按重量/體積比為1: 10至1: 15加入潔凈自來水，采
用電動攪拌器于2(TC以下間歇攪拌，攪拌速度為1500-3500r/min ，攪拌時間為1-IO分鐘(優(yōu) 選地，步驟(1)中攪拌機的速度為2500r/min，處理時間為3-5分鐘)，用蒸餾水將所述的 魚鱗洗至表面無色素和脂肪附著，自然風干或置于〈5(TC溫度下干燥，將所述的魚鱗粉碎至 40-50目，得到預處理魚鱗；
(2) 脫鈣處理將步驟(1)得到的預處理魚鱗按重量/體積比為1: 10-1: 20，加入濃度 為4-12%的擰檬酸或蘋果酸溶液，冰水浴中用微波處理1-5min，所述的微波功率為100-500W， 然后于4-25"下脫鈣處理6-30h,過濾分離得到脫鈣魚鱗和濾液，將所得的濾液置l(TC以下 靜置5-10h，得到擰檬酸鈣沉淀，(優(yōu)選地，步驟(2)所述的微波功率為200-300W，處理2min， 所述的檸檬酸、蘋果酸溶液的濃度為8-10%，處理溫度為10-2(TC):
(3) 提取分離向步驟(2)所得的脫鈣魚鱗按重量/體積比為1: 5至1: 20加入質(zhì)量濃
度為1%的含質(zhì)量分數(shù)為0. 1-2%胃蛋白酶或0. 5-1%堿性蛋白酶的蘋果酸或檸檬酸溶液，于0-20 。C下提取2-4次，其中，采用胃蛋白酶時的提取溫度為4-25°C，采用堿性蛋白酶時提取溫度 為0-l(TC (優(yōu)選地，采用胃蛋白酶時溫度控制在10-2(TC，釆用堿性蛋白酶時提取溫度控制 在0-4°C)。上述胃蛋白酶或堿性蛋白酶提取時間均為12-48h,提取完畢后用紗布過濾，將得 到的濾液置20'C以下5000-50000g離心10-20min，取上清液，加NaCl至其終濃度為 0. 7-0. 90mol/L，鹽析過夜，5000-50000g離心10-30min，取沉淀，將所得的沉淀用0. 50mol/L 乙酸溶解，重復鹽析1次，再將得到的沉淀用蒸餾水透析l-3d，每天更換蒸餾水2 — 3次， 將透析液冷凍干燥，即得未變性的魚鱗膠原蛋白。
本發(fā)明較好的解決了現(xiàn)有技術存在的兩大缺陷； 一是現(xiàn)有技術在提取過程中使用大量的 毒害或腐蝕性物質(zhì)如氫氧化鈉或鹽酸等進行前處理去雜脫鈣，不僅腐蝕設備，污染環(huán)境，所 得鈣液無法被回收利用，本發(fā)明先采用機械攪拌處理去除魚鱗表面的脂肪、色素等雜質(zhì)，然 后采用微波短時處理結合食用酸脫鈣巧妙地解決了這一技術缺陷。二是本發(fā)明大大簡化和縮 短了魚鱗膠原蛋白提取前處理工藝，縮短了膠原蛋白的提取周期，提高了提取效率，且提取所 得產(chǎn)物均為未變性膠原蛋白。 本發(fā)明的積極效果是1) 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明整個提取過程均所用可食性試劑，沒有毒害或腐蝕性物質(zhì)的涉 入，這不僅可使設備免于被腐蝕，也使得所提膠原蛋白具有更高的安全性。
2) 本發(fā)明魚鱗膠原蛋白得率較高據(jù)測定，從草魚魚鱗中提取膠原蛋白的得率可達到26.4 一38.9%。
3) 本發(fā)明提取的膠原蛋白為天然I型膠原蛋白，其純度達83.2%—93.9%。
4) 本發(fā)明在提取膠原蛋白的同時鈣也能被回收利用。
5) 本發(fā)明的制備方法使魚鱗膠原蛋白的提取周期從傳統(tǒng)的10-15天縮短至5-6天，且對環(huán) 境無污染。
以下結合實例，對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但并不說明本發(fā)明僅限于此范圍。


圖1是魚鱗膠原蛋白酸溶液的熱變性曲線 圖2是魚鱗膠原蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖
1.高分子量標準蛋白質(zhì);2.小牛腱I型膠原蛋白；3.草魚魚鱗膠原蛋白 圖3是魚鱗膠原蛋白傅立葉紅外光譜圖
1.魚鱗魚鱗膠原蛋白；2.小牛腱I型膠原蛋白
具體實施例方式
實施例1
將洗凈的的新鮮草魚(市售)魚鱗按l: 10 (W/V)的比例加入潔凈的自來水，采用電
動攪拌器(儀器型號JJ-200W，江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠)于2(TC以下間歇攪拌3分 鐘(2500轉/分)，用潔凈的自來水將魚鱗洗至表面無色素和脂肪等附著。自然風干或40-50 "干燥后粉碎至50目。稱取100g經(jīng)預處理原料按l: 10 (W/V)的比例加入濃度為10%檸檬 酸水溶液，冰水浴中微波(500W)處理lmin (保持體系溫度低于2CTC)，然后于10脫鈣24 h, 過濾分離得脫鈣魚鱗片和濾液，將所得的濾液置4'C靜置10 h，得到擰檬酸鈣沉淀；向所得 的脫鈣魚鱗片中按l: 10 (W/V)比例加入質(zhì)量濃度為1%檸檬酸溶液(溶液內(nèi)含1%胃蛋白酶 或0.5-1%堿性蛋白酶，以質(zhì)量分數(shù)計)于ltrC提取2次，每次24h，提取完畢經(jīng)紗布過濾， 濾液在4。C以謹Og離心10-2(Mn，傾出上清液，加NaCl至其最終濃度為0. 90mol/L，鹽 析過夜，20000g離心IO-30min，沉淀用0. 50mol/L乙酸溶解，重復鹽析和溶解操作1次， 將得到沉淀移入透析袋，用蒸餾水透析1-3d，每天更換蒸餾水2 — 3次。透析液冷凍干燥(德 國Marin Christ公司，ALPHA l-4LD真空冷凍干燥機)后得到12. 4g未變性魚鱗膠原蛋白天然魚鱗膠原蛋白，其純度為93.4%。 實施例2
將洗凈的新鮮鯽魚(市售產(chǎn)品)魚鱗按l: 15 (W/V)的比例加入潔凈自來水，2(TC以下 采用電動攪拌器(儀器型號JJ-200W，江蘇環(huán)宇科學儀器廠)間歇攪拌5分鐘(1500轉/分)， 蒸餾水洗至表面無色素和脂肪等附著。自然風干或5CTC干燥后粉碎至40目。稱取100g經(jīng)預 處理原料按l: 15 (W/V)的比例加入濃度為8%蘋果酸水溶液，冰水浴中微波(380W)處理 2min (保持體系溫度低于2(TC)，然后于15。C脫鈣20 h，過濾分離得脫鈣魚鱗片和濾液，將 所得的濾液置1(TC以下靜置8h，得到檸檬酸鈣沉淀；向所得的脫鈣魚鱗片中按l: 10 (W/V) 比例加入質(zhì)量濃度為1%蘋果酸溶液(含1%胃蛋白酶，以質(zhì)量分數(shù)計)于15'C提取3次，每 次12h，提取完畢經(jīng)紗布過濾，濾液在20。C以下以12000g離心10-20min，傾出上清液，加 NaCl至其最終濃度為0. 90mol/L，鹽析過夜，20000g離心10-30min，沉淀用0. 50mol/L乙 酸溶解，重復鹽析和溶解操作l次，將得到沉淀移入透析袋，用蒸餾水透析l-3d，每天更換 蒸餾水2 — 3次。透析液冷凍干燥(德國Marin Christ公司，ALPHA l-4LD真空冷凍干燥機) 后得到10. 9g未變性魚鱗膠原蛋白天然魚鱗膠原蛋白，其純度為83. 6%。
實施例3
將洗凈的草魚(市售產(chǎn)品)魚鱗按l: 12 (W/V)的比例加入潔凈自來水，2(TC以下釆 用電動攪拌器(儀器型號JJ-200W，江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠)間歇攪拌2分鐘(3500 轉/分)，蒸餾水洗至表面無色素和脂肪等附著。自然風干或5(TC干燥后粉碎至40目。稱取 100g經(jīng)預處理原料按1: 10(W/V)的比例加入濃度為10%檸檬酸水溶液，冰水浴中微波(100W) 處理5min(保持體系溫度低于2(TC)，然后于l(TC脫鈣24 h，過濾分離得脫鈣魚鱗片和濾液， 將所得的濾液置4"C靜置10 h，得到檸檬酸鈣沉淀；向所得的脫鈣魚鱗片中按l: 10 (W/V) 比例加入質(zhì)量濃度為1%檸檬酸溶液(該溶液內(nèi)含1M咸性蛋白酶，以質(zhì)量分數(shù)計)于0-4'C提 取2次，每次24h，提取完畢經(jīng)紗布過濾，濾液在4t:以12000g離心10-20min，傾出上清液， 加NaCl至其最終濃度為0. 90mol/L'鹽析過夜，20000g離心10-30min，沉淀用0. 50mol/L 乙酸溶解，重復鹽析和溶解操作l次，將得到沉淀移入透析袋，用蒸餾水透析1-3d，每天更 換蒸餾水2 — 3次。透析液冷凍干燥(德國Marin Christ公司，ALPHA l-4LD真空冷凍干燥機) 后得到13. 7g未變性魚鱗膠原蛋白天然魚鱗膠原蛋白，其純度為91. 8%。
權利要求
1、從淡水魚鱗中提取未變性膠原蛋白的方法，其步驟包括魚鱗預處理、脫鈣、膠原蛋白提取和分離，其特征在于以下步驟(1)魚鱗的預處理將洗凈的魚鱗按重量/體積比為1∶10至1∶15加入潔凈的自來水，采用電動攪拌器于20℃以下間歇攪拌，攪拌速度為1500-3500r/min，攪拌時間為1-10分鐘，用蒸餾水將所述的魚鱗洗至表面無色素和脂肪附著，自然風干或置于＜50℃溫度下干燥，將所述的魚鱗粉碎至40-50目，得到預處理魚鱗；(2)脫鈣處理將步驟(1)得到的預處理魚鱗按重量/體積比為1∶10-1∶20，加入濃度為4-12％的檸檬酸或蘋果酸溶液，冰水浴中用微波處理1-5min，所述的微波功率為100-500W，然后于4-25℃下脫鈣處理6-30h，過濾分離得到脫鈣魚鱗和濾液，將所得的濾液置10℃以下靜置5-10h，得到檸檬酸鈣沉淀；(3)提取分離向步驟(2)所得的脫鈣魚鱗按重量/體積比為1∶5至1∶20加入質(zhì)量濃度為1％的含質(zhì)量分數(shù)為0.1-2％胃蛋白酶或0.5-1％堿性蛋白酶的蘋果酸或檸檬酸溶液，于0-20℃下提取2-4次，其中，采用胃蛋白酶時的提取溫度為4-25℃，采用堿性蛋白酶時提取溫度為0-10℃，每次處理12-48h，提取完畢后用紗布過濾，將得到的濾液置20℃以下5000-50000g離心10-20min，取上清液，加NaCl至其終濃度為0.7-0.90mol/L，鹽析過夜，5000-50000g離心10-30min，取沉淀，將所得的沉淀用0.50mol/L乙酸溶解，重復鹽析1次，再將得到的沉淀用蒸餾水透析1-3d，每天更換蒸餾水2-3次，將透析液冷凍干燥，即得未變性的魚鱗膠原蛋白。
2、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中攪拌機的速度為2500r/min， 處理時間為3-5分鐘。
3、 根據(jù)權利要求l所述的方法，其特征在于，歩驟(2)所述的微波功率為200-300W，處 理2min，所述的檸檬酸、蘋果酸溶液的濃度為8-10%，處理溫度為10-2CTC。
4、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的蛋白酶是胃蛋白酶或堿性 蛋白酶，采用胃蛋白酶時溫度為10-2(TC，采用堿性蛋白酶時提取溫度為0-4'C。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)天然產(chǎn)物提取領域，具體涉及從淡水魚鱗中制備未變性膠原蛋白的方法，具體步驟為1)將洗凈的魚鱗加入蒸餾水，用電動攪拌器間歇攪拌3-5分鐘，蒸餾水洗至表面無色素和脂肪等附著；自然風干或低溫干燥后粉碎至40-50目；2)將1)的材料按1∶10-1∶20加入為8-10％檸檬酸、蘋果酸溶液，冰水浴微波處理2min，10-20℃脫鈣8-24h，過濾，濾液置10℃以下靜置5-10h，得檸檬酸鈣沉淀；3)向經(jīng)步驟2)處理后所得的脫鈣魚鱗中按1∶5至1∶20比例加入1％的蘋果酸或檸檬酸溶液(含蛋白酶)于0-20℃攪提取2-4次，每次12-48h，離心，取上清，加NaCl至終濃度為0.7-0.90mol/L，鹽析過夜，離心，沉淀用0.50mol/L乙酸溶解，重復鹽析和溶解操作1次，將沉淀透析，冷凍干燥得本發(fā)明的產(chǎn)品。
文檔編號C12P21/02GK101307348SQ200810048018
公開日2008年11月19日 申請日期2008年6月13日 優(yōu)先權日2008年6月13日
發(fā)明者萬瓊紅, 黨美珠, 李春美, 熊善柏, 鐘朝輝 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學