專利名稱：發酵云芝高產eps的培養基配方及其在卷煙中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵技術領域，具體涉及一種液體發酵云芝生產胞外多糖的工藝及胞外多糖的應用。
背景技術：
云芝(Coriolus versicolor)又名彩絨革蓋菌、雜色云芝、彩絨菌和瓦菌等，隸屬非褶菌目，多孔菌科，栓菌屬。子實體一般較小，無柄，呈覆瓦狀排列。云芝是中藥和食品中用途最為廣泛的真菌之一，具有健脾利濕、止咳平喘、清熱解毒、抗腫瘤等功能。云芝中含有多種生理活性成分，其中最主要的成分之一就是云芝多糖。云芝多糖分子量在10萬以上， 是富含β_(1，;3)糖苷鍵的葡聚糖，同時含有甘露糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖。大量的研究資料表明云芝多糖成分是一類具有多種生物活性的多糖物質，具有多種藥理和生理功能，功效顯著，藥用價值高，可做各類藥品、保健品、功能性食品的原料。大量研究表明， 云芝多糖具有抗細菌、霉菌及病毒的功能，刺激巨噬細胞轉化，增加血液里的白細胞介素I、 Y干擾素及腫瘤壞死因子的作用，能抑制癌細胞生成，是一種新型的抗腫瘤免疫調節劑，能激活免疫細胞，提高機體免疫功能而對正常細胞，沒有毒副作用。云芝多糖是國際公認的高效免疫促進劑，是一種口服有效的多糖，臨床可用于治療慢性乙型肝炎、酒精肝，加強消化系統、肺及宮頸、乳腺等部位的癌癥放化療作用，可明顯提高患者的細胞免疫功能和體液免疫功能，增強機體對化學治療的耐受性減少感染與出血，提高患者生命質量。云芝多糖同時具有保肝護肝作用，可顯著降低血清轉氨酶，對肝組織病變和肝壞死有明顯的修復作用。云芝多糖包括三類，一是從云芝的子實體中提取的粗多糖(CVPQ，二是從云芝深層培養菌絲體中分離到一種結合蛋白多糖(PSK)(又稱為云芝肽糖)，三是從液體發酵云芝的發酵液中提取的云芝胞外多糖(EPS)。從云芝菌絲體和發酵液中提取的多糖均具有極強烈的抑制癌細胞活性，抗氧化活性和免疫調節功能，是良好的免疫增強劑，可提高動物機體 IgM的量等作用；而云芝糖肽的抗腫瘤作用、免疫增強作用和保護肝臟的作用也已普遍用于臨床。在臨床上，云芝多糖具有安全性高、毒副作用小、適用面廣和對機體損害小等優點， 已作為一種免疫療法用藥應用于慢性乙型肝炎，消化系統、呼吸系統疾病及宮頸和乳腺等部位癌癥疾病的治療和輔助治療。將云芝多糖開發為天然藥物免疫促進劑和調節劑應用于其他疾病的防制方面具有更廣闊的前景。近年來人們對云芝子實體和發酵菌絲體多糖的提取方法、功能和應用等已進行了大量的研究，但就發酵云芝生產胞外多糖(EPQ和EPS功能及應用方面的研究還很少。隨著世界范圍內反吸煙運動的不斷深入和人類對自身健康的關注，“吸煙與健康” 已經成為醫藥界和煙草界共同面臨的重大難題，是煙草行業所面臨的主要挑戰及當今社會廣泛關注的焦點。近年來，隨著履行《煙草控制框架公約》工作的啟動，社會對吸煙與健康問題的關注不斷加強，減少吸煙對健康的危害已成為煙草行業必須承擔的責任和義務。目前國內已在中草藥選擇、藥物作用機理以及臨床應用效果上對中國特有的新型卷煙進行了深入的研究，研制開發成功對人體某些疾病具有一定療效商業卷煙，如“金圣”、“五葉神”、“江山”等。這些卷煙除對緩解人體呼吸系統疾病有一定良性作用外，還可對心血管系統疾病等有一定的預防作用。還有研究表明，含有云芝等類中草藥有效成分的卷煙在燃吸時，其有效成分被蒸餾、氣化、揮發和升華形成微粒相和氣相，可捕獲煙氣中的自由基，阻斷或降低有害物質的生成，減輕吸煙引起的心血管和微循環系統的危害。因此，煙用中草藥的研究目前已成為各煙草企業和科研院所研究的熱點之一。但目前，還未見發酵產云芝胞外多糖用于卷煙中的相關報道。

發明內容
本發明的目的之一在于提供一種發酵云芝高產EPS的培養基配方。本發明的另一目的在于提供一種液體發酵云芝培養物的方法及從云芝培養發酵液中分離純化胞外多糖的方法。本發明的再一目的是公開了云芝胞外多糖在卷煙中的應用。為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下本發明的發酵云芝高產EPS的培養基配方為多價胨4_7g/L，麥芽糖50_55g/L，起始PH為5。優選為多價胨5.870g/L，麥芽糖53. 120g/L，起始pH為5。本發明的液體發酵云芝培養物的方法，以4%的接種量將種子培養液接種于基礎培養基中培養，培養基配方為多價胨4-7g/L，麥芽糖50-55g/L，起始pH為5，在，150r/ min條件下培養7-9天。優選為以4%的接種量將種子培養液接種于基礎培養基中培養，培養基配方為多價胨5. 870g/L,麥芽糖53. 120g/L,起始pH為5，在28°C，150r/min條件下培養8天。所述的種子培養液為菌種cfcc 87458的斜面培養物經一次平板培養和一次液體培養的產物，斜面培養基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；接種后 28 °C培養4-6天;平板培養基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；接種后在 28 °C培養6-8天;液體培養基配方為多價胨4_7g/L，麥芽糖50_55g/L，起始pH為5，以4%的接種量接種后在^°C，150r/min條件下培養4_6天。從云芝培養發酵液中分離純化胞外多糖的方法為發酵液通過旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無水乙醇，4°C 過夜；lOOOOr/min離心lOmin，得沉淀為粗多糖；將粗多糖樣品用蒸餾水溶解，加入1/4體積的氯仿-正丁醇溶液，氯仿與正丁醇的體積比為4 1，置于具塞容器中，充分振搖30min后，經離心機lOOOr/min離心5min，然后將水相與氯仿相分開；將水相再加入相當于其體積1/4的氯仿-正丁醇溶液，重復上述過程，共計重復二次；純化出的胞外多糖成分用旋轉蒸發儀濃縮，透析除去NaCl，得精制云芝胞外多糖，真空冷凍干燥保存。云芝胞外多糖在卷煙中的應用，將精制的云芝胞外多糖的噴入煙絲或注入煙卷中，胞外多糖含量為煙絲質量的0. 01% -0. 04%，然后放入恒溫恒濕箱在溫度22°C，濕度60%下平衡48h。本發明中所用的菌種cfcc 87458購于北京北納創聯生物技術研究院，保藏于中國林業微生物保藏管理中心。本發明公開了一種發酵云芝高產EPS的培養基配方及液體發酵云芝培養物的方法，采用該發明的培養基配方及培養方法，多糖得率為10. 0982g/L。并對EPS生理活性進行初探，為大規模發酵生產云芝EPS及其在醫藥食品行業中的進一步應用做好了準備。本發明就是找到了一種云芝胞外多糖在卷煙中的應用方法，為云芝等真菌的胞外多糖在卷煙中的應用提供了一種可行方案，具有廣闊發展空間，將產生深遠的經濟和社會效應。利用中草藥搭建起具有傳統吸煙文化內涵和中式吸味特征的低危害卷煙的技術壁壘，提高中國卷煙產品的市場競爭力，可應對WHO和WTO帶來的壓力和挑戰。將云芝等優質溫補中草藥發酵提取胞外多糖添加到卷煙中，形成的獨特的香氣風格、口味特征以及加工方式均符合國家局提出的中式卷煙發展方向，對卷煙煙氣能起到減害增益的作用，符合國家煙草科技發展方向，有利于提高我國煙草工業產品的技術含量和競爭力，使卷煙消費者在享受吸煙樂趣的同時盡可能的降低吸煙的危害性。


圖1精制云芝胞外多糖過kpharose CL-6B層析柱結果。圖2過柱得云芝胞外多糖組分的紅外光譜圖。圖3精制云芝胞外多糖在卷煙煙氣中的轉移率。
具體實施例方式實施例1(1)斜面菌種培養配制固體培養基，分裝試管，斜面培養基配方為250g/L 土豆， 麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；滅菌后制備斜面，劃線接種云芝后，于培養5天， 冷凍保藏即為云芝菌株菌種。(2)從保存菌株的試管中，使用接種鉤在試管斜面取出0. 5平方厘米的一小塊，接種到P天A固體平板中。平板培養基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2% 瓊脂；接種時要使接種塊上包含盡量少的培養基，一個平板接兩塊，放入恒溫培養箱，接種后在培養7天。(3)使用直徑0. 5cm的打孔器，從固體平板培養基上取下兩片位于菌落邊緣的菌體，接種于液體種子培養基中O50ml三角瓶，50毫升培養液)，液體培養基配方為多價胨 5. 870g/L,麥芽糖53. 120g/L,起始pH為5，在，150r/min條件下培養5天。(4)以4%的接種量將種子培養液接種于基礎培養基中培養，培養基配方為多價胨5. 870g/L,麥芽糖53. 120g/L,起始pH為5，在，150r/min條件下培養8天。云芝發酵結束后，將50mL的發酵物通過真空抽濾法分離菌絲與發酵液，發酵液通過旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無水乙醇，4°C過夜。lOOOOr/min 離心lOmin，得沉淀為粗多糖；稱取0. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸餾水，用苯酚硫酸法可測定計算發酵液中多糖含量為10. 10g/L。實施例2
(1)斜面菌種培養配制固體培養基，分裝試管，斜面培養基配方為250g/L 土豆， 麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；滅菌后制備斜面，劃線接種云芝后，于培養4天， 冷凍保藏即為云芝菌株菌種。(2)從保存菌株的試管中，使用接種鉤在試管斜面取出0. 5平方厘米的一小塊，接種到P天A固體平板中。平板培養基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2% 瓊脂；接種后在培養6-8天；接種時要使接種塊上包含盡量少的培養基，一個平板接兩塊，放入恒溫培養箱，28°C培養8天。(3)使用直徑0. 5cm的打孔器，從固體平板培養基上取下兩片位于菌落邊緣的菌體，接種于液體種子培養基中O50ml三角瓶，50毫升培養液)，液體培養基配方為多價胨 4g/L，麥芽糖55g/L，起始pH為5，在，150r/min條件下培養6天。(4)以4%的接種量將種子培養液接種于基礎培養基中培養，培養基配方為多價胨4g/L，麥芽糖55g/L，起始pH為5，在，150r/min條件下培養7天。云芝發酵結束后，將50mL的發酵物通過真空抽濾法分離菌絲與發酵液，發酵液通過旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無水乙醇，4°C過夜。lOOOOr/min 離心lOmin，得沉淀為粗多糖；稱取0. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸餾水，用苯酚硫酸法可測定計算發酵液中多糖含量為10. 12g/L。實施例3(1)斜面菌種培養配制固體培養基，分裝試管，斜面培養基配方為250g/L 土豆， 麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；滅菌后制備斜面，劃線接種云芝后，于培養6天， 冷凍保藏即為云芝菌株菌種。(2)從保存菌株的試管中，使用接種鉤在試管斜面取出0. 5平方厘米的一小塊，接種到P天A固體平板中。平板培養基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2% 瓊脂；接種后在培養6天；接種時要使接種塊上包含盡量少的培養基，一個平板接兩塊，放入恒溫培養箱，培養6天。(3)使用直徑0. 5cm的打孔器，從固體平板培養基上取下兩片位于菌落邊緣的菌體，接種于液體種子培養基中O50ml三角瓶，50毫升培養液)，液體培養基配方為多價胨 7g/L,麥芽糖50g/L，起始pH為5，在，150r/min條件下培養4天。(4)以4%的接種量將種子培養液接種于基礎培養基中培養，培養基配方為多價胨7g/L，麥芽糖50g/L，起始pH為5，在，150r/min條件下培養9天。云芝發酵結束后，將50mL的發酵物通過真空抽濾法分離菌絲與發酵液，發酵液通過旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無水乙醇，4°C過夜。lOOOOr/min 離心lOmin，得沉淀為粗多糖；稱取0. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸餾水，用苯酚硫酸法可測定計算發酵液中多糖含量為10. 09g/L。實施例4(1)斜面菌種培養配制固體培養基，分裝試管，斜面培養基配方為250g/L 土豆， 麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；滅菌后制備斜面，劃線接種云芝后，于培養6天， 冷凍保藏即為云芝菌株菌種。(2)從保存菌株的試管中，使用接種鉤在試管斜面取出0. 5平方厘米的一小塊，接種到P天A固體平板中。平板培養基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；接種后在培養6天；接種時要使接種塊上包含盡量少的培養基，一個平板接兩塊，放入恒溫培養箱，培養6天。(3)使用直徑0. 5cm的打孔器，從固體平板培養基上取下兩片位于菌落邊緣的菌體，接種于液體種子培養基中O50ml三角瓶，50毫升培養液)，液體培養基配方為多價胨 6g/L,麥芽糖53g/L，起始pH為5，在，150r/min條件下培養4天。(4)以4%的接種量將種子培養液接種于基礎培養基中培養，培養基配方為多價胨5g/L，麥芽糖52g/L，起始pH為5，在，150r/min條件下培養9天。云芝發酵結束后，將50mL的發酵物通過真空抽濾法分離菌絲與發酵液，發酵液通過旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無水乙醇，4°C過夜。lOOOOr/min 離心lOmin，得沉淀為粗多糖；稱取0. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸餾水，用苯酚硫酸法可測定計算發酵液中多糖含量為10. 09g/L。稱取Ig的的粗多糖樣品，室溫下加入50mL蒸餾水溶解，加入1/4體積的氯仿-正丁醇(預先配制成體積比為4 1混合液)溶液，置于具塞容器中，充分振搖30min后，經離心機lOOOr/min離心5min，然后將水相與氯仿相分開。將水相再加入相當于其體積1/4的氯仿-正丁醇溶液，重復上述過程，共計重復二次。用硫酸-苯酚法對胞外多糖進行檢測。 純化出的胞外多糖成分用旋轉蒸發儀濃縮至10mL，透析(透析袋分子量8000-14000Da)除去NaCl，得精制云芝胞外多糖，真空冷凍干燥保存。以實施例5得到的精致云芝胞外多糖為分析樣品，進行下述分析研究。1、發酵產云芝胞外多糖組分分析稱取80mg云芝精制胞外多糖溶于4mL 0. 2mol/L的NaCl緩沖液溶解，離心，上清液過0. 45 μ m的濾膜；取2mL上Sepharose CL-6B凝膠柱，以0. 2mol/L NaCl緩沖液洗脫， 流速為0. 6mL/min，利用分步收集器收集，5mL/管；用硫酸-苯酚法對胞外多糖進行檢測。 分離出的胞外多糖組分用旋轉蒸發儀濃縮至10mL，透析(透析袋分子量8000-14000Da)除去NaCl，真空冷凍干燥保存。將精制云芝胞外多糖樣品過kpharose CL-6B柱，用硫酸-苯酚法測定多糖含量， 以管號為橫坐標以多糖吸光度為縱坐標用SigmaPlot軟件作圖，結果如下圖1所示。從結果圖1可以看出，精制云芝胞外多糖經過kpharose CL-6B柱分離出了一種主要多糖組分。 重復過柱5次，每次都對過柱后的溶液進行檢測，檢測結果相同，將5次所得到的組分收集起來進行濃縮、透析、冷凍干燥得到一個多糖組分。2、云芝胞外多糖組分紅外光譜分析稱取過柱得云芝胞外多糖組分lmg，用溴化鉀(KBr)壓片后進行紅外光譜(IR)分析，結果見圖2。從圖譜中特征吸收波峰分析可知，在3421. 4cm-l有一特征寬峰，屬O-H的伸縮振動，表明在該糖中應存在O-H ；在2926. Icm-I處有吸收峰，應為C-H伸縮振動，是糖類的特征吸收峰，在2361cm-l、2335. 8cm-l處有吸收峰，應為C = N或C = C伸縮振動，發生費米共振；在1645. 7cm-l、1071. 9cm-l處有吸收峰，說明該組分中有羧酸存在，推知該胞外多糖組分為酸性多糖。3、云芝EPS抗氧化性能的測定用鄰二氮菲法測定云芝EPS對· OH自由基的清除率，結果見表1。表1多糖對· OH自由基的清除效率
權利要求
1.一種發酵云芝高產EPS的發酵培養基配方，其特征在于培養基配方為多價胨4_7g/ L,麥芽糖50-55g/L,起始pH為5。
2.根據權利要求1所述的發酵云芝高產EPS的發酵培養基配方，其特征在于培養基配方為多價胨5. 870g/L，麥芽糖53. 120g/L，起始pH為5。
3.一種液體發酵云芝培養物的方法，其特征在于以4 %的接種量將種子培養液接種于優化培養基中培養，培養基配方為多價胨4-7g/L，麥芽糖50-55g/L，起始pH為5，在 28 0C，150r/min條件下培養7_9天。
4.根據權利要求2所述的液體發酵云芝培養物的方法，其特征在于以4%的接種量將種子培養液接種于優化培養基中培養，培養基配方為多價胨5. 870g/L，麥芽糖53. 120g/L, 起始pH為5，在，150r/min條件下培養8天。
5.根據權利要求3或4所述的液體發酵云芝培養物的方法，其特征在于所述的種子培養液為菌種Cfcc 87458的斜面培養物經一次平板培養和一次液體培養的產物，斜面培養基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；接種后培養4-6天；平板培養基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；接種后在培養6-8天；液體培養基配方為多價胨4-7g/L，麥芽糖50-55g/L，起始pH為5，以4%的接種量接種后在，150r/min條件下培養4_6天。
6.一種從云芝培養發酵液中分離純化胞外多糖的方法，其特征在于發酵液通過旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無水乙醇，4°C過夜； 10000r/min離心lOmin，得沉淀為粗多糖；將粗多糖樣品用蒸餾水溶解，加入1/4體積的氯仿-正丁醇溶液，氯仿與正丁醇的體積比為4 1，置于具塞容器中，充分振搖30min后，經離心機lOOOr/min離心5min，然后將水相與氯仿相分開；將水相再加入相當于其體積1/4的氯仿-正丁醇溶液，重復上述過程，共計重復二次；純化出的胞外多糖成分用旋轉蒸發儀濃縮，透析除去NaCl，得精制云芝胞外多糖，真空冷凍干燥保存。
7.云芝胞外多糖在卷煙中的應用，其特征在于將精制的云芝胞外多糖的噴入煙絲或注入煙卷中，胞外多糖含量為煙絲質量的0. 01 % -0. 04%，然后放入恒溫恒濕箱在溫度 22°C，濕度60%下平衡48h。
全文摘要
本發明公開了一種發酵云芝高產胞外多糖(EPS)的培養基配方及液體發酵云芝培養物的方法，發酵培養方法為以4％的接種量將種子培養液接種于基礎培養基中培養，培養基配方為多價胨4-7g/L，麥芽糖50-55g/L，起始pH為5，在28℃，150r/min條件下培養7-9天。采用該發明的培養基配方及培養方法，多糖得率為10.0982g/L。并對EPS在卷煙中的應用進行了探索，為大規模發酵生產云芝EPS及其在醫藥食品行業中的進一步應用做好了準備。
文檔編號C08B37/00GK102399840SQ20111036229
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者毛多斌, 王吉中, 耿盧婧, 許春平 申請人:鄭州輕工業學院