一種通過(guò)共混改性的細(xì)胞培養(yǎng)材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)共混改性的細(xì)胞培養(yǎng)材料及其制備方法。該細(xì)胞培養(yǎng)材料的原料是聚苯乙烯與羧基丁苯橡膠的共混物，并且所述細(xì)胞培養(yǎng)材料聚苯乙烯表面偶聯(lián)RGD多肽。本發(fā)明通過(guò)共混的方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)材料進(jìn)行摻雜改性，將聚苯乙烯和離子交換樹脂或者聚苯乙烯和羧基丁腈橡膠摻雜在一起，使得細(xì)胞培養(yǎng)板表面富含羧基，達(dá)到增大培養(yǎng)板的親水能力，從而增加細(xì)胞的貼壁能力。由于本發(fā)明是利用共混的方法，提供羧基的摻雜物不會(huì)在培養(yǎng)板材表面溶出，因此該細(xì)胞培養(yǎng)材料較傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)材料具備了保存時(shí)間更長(zhǎng)，性能更穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種通過(guò)共混改性的細(xì)胞培養(yǎng)材料及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過(guò)共混改性的細(xì)胞培養(yǎng)材料及其制備方法，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 所謂共混改性是指將兩種或兩種以上聚合物材料、無(wú)機(jī)材料以及助劑在一定溫 度下進(jìn)行機(jī)械摻混，最終形成一種宏觀上均勻，而且力學(xué)、熱學(xué)、光學(xué)及其他性能得到改善 的新材料的過(guò)程。聚合物的共混不僅是聚合物改性的一種重要手段，更是開(kāi)發(fā)具有嶄新性 能新型材料的重要途徑。聚苯乙烯是由苯乙烯單體通過(guò)自由基聚合而成的，英文名稱為 polystyrene,簡(jiǎn)稱PS，是一種應(yīng)用廣泛性僅次于聚烯經(jīng)和PVC的熱塑性材料。聚苯乙烯 由于其透光性能好，具有較好的強(qiáng)度和易塑形，并且沒(méi)有毒性，所以已被大量用作細(xì)胞培養(yǎng) 板。但聚苯乙烯表面呈疏水性，不利于細(xì)胞的黏附。隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)板 的性能要求也越來(lái)越高，普通的細(xì)胞培養(yǎng)板對(duì)一些原代細(xì)胞及貼壁困難，易成團(tuán)，易脫落， 生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞擴(kuò)增的效果不佳。由于大部分細(xì)胞需要黏附在一個(gè)固相界面才能生長(zhǎng)。使 用對(duì)細(xì)胞黏附能力更強(qiáng)的培養(yǎng)板，能夠減少培養(yǎng)時(shí)間、縮短實(shí)驗(yàn)周期、高效增殖特定細(xì)胞， 在細(xì)胞生物學(xué)中具有重大意義。
[0003] 國(guó)內(nèi)外也有相關(guān)的研究來(lái)改性聚苯乙烯的性能，例如專利號(hào)：CN 103087916 A發(fā) 明了一種涂覆有Matrigel的細(xì)胞培養(yǎng)板及其制備方法和應(yīng)用，其是采用等離子噴涂技術(shù) 在細(xì)胞培養(yǎng)板表面形成羧基表面，然后采用化學(xué)鉚釘技術(shù)將Matrigel通過(guò)共價(jià)鍵的形成 連接到聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板活培養(yǎng)皿表面，形成涂覆有Matrigel的細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿。 由于該培養(yǎng)板的基材表面采用化學(xué)相結(jié)合的表面處理方式，其表面的Matrigel不會(huì)溶出。 該培養(yǎng)板比通過(guò)物理包被的細(xì)胞培養(yǎng)板，該培養(yǎng)板的保存時(shí)間更長(zhǎng)。該培養(yǎng)板（皿）適用于 原代細(xì)胞及少數(shù)貼壁困難，易成團(tuán)，易脫落，生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞培養(yǎng)，入神經(jīng)元、LNCap、PC-12 等，可使細(xì)胞貼壁更加牢固，細(xì)胞伸展充分，獲得更穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)。這種技術(shù)存在制備成本 高，操作繁瑣等問(wèn)題，因而無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)。
[0004] 專利CN 102911387 A發(fā)明了一種具有高細(xì)胞黏附能力的改性聚苯乙烯材料以及 制備方法。該改性聚苯乙烯材料是按照包括下述步驟的方法制備得到的：先將聚苯乙烯材 料采用滅菌袋進(jìn)行密封包裝，然后用Y -射線或電子束輻照，輻射后的產(chǎn)物即為高細(xì)胞黏 附能力的改性聚苯乙烯。其采用高劑量Y射線改性的聚苯乙烯材料，能顯著提高細(xì)胞黏附 的效率，有助于生產(chǎn)性能更加優(yōu)異的聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板；高劑量Y射線處理聚苯乙烯培 養(yǎng)板，在改性材料增強(qiáng)細(xì)胞黏附的同時(shí)，對(duì)材料進(jìn)行了滅菌消毒處理，改性后的材料能直接 應(yīng)用與細(xì)胞培養(yǎng)。這種技術(shù)存在制備成本高，并且射線或電子束輻照存在概率性，因此 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)板的性能無(wú)法保證。本發(fā)明旨在公開(kāi)一種新型的方法來(lái)改性聚苯乙烯來(lái)提高細(xì) 胞培養(yǎng)板的親水能力。本發(fā)明主要通過(guò)混煉的辦法，將聚苯乙烯分別和羧基丁苯橡膠混煉 共混，以達(dá)到提高聚苯乙烯表面親水的能力。相比之前現(xiàn)有的專利發(fā)明，悠著成本低，操作 簡(jiǎn)單，產(chǎn)品性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用共混的方法改性的聚苯乙烯培養(yǎng)材料，其特征在 于利用共混的方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)材料進(jìn)行羧基丁苯橡膠摻雜改性，該細(xì)胞培養(yǎng)材料表面通過(guò) 化學(xué)健合偶聯(lián)RGD短肽。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的，一種細(xì)胞培養(yǎng)材料，通過(guò)共混改性，在細(xì) 胞培養(yǎng)材料表面通過(guò)化學(xué)健合偶聯(lián)RGD短肽。
[0007] 本發(fā)明所述的通過(guò)共混改性的細(xì)胞培養(yǎng)材料，制備該細(xì)胞培養(yǎng)材料的原料是聚苯 乙烯與羧基丁苯橡膠的共混物，并且所述所述細(xì)胞培養(yǎng)材料聚苯乙烯表面偶聯(lián)R⑶多肽。
[0008] 本發(fā)明還公開(kāi)了所述細(xì)胞培養(yǎng)材料的制備方法，使用EDC(碳化二亞胺）和 NHS (羥基琥珀酰亞胺）以及MES (2-嗎啉乙磺酸水合物）偶聯(lián)方法在培養(yǎng)材料表面接枝引 入多肽。所述多肽是RGD短肽，具體序列為RGDKKK。
[0009] 具體的制備步驟如下：
[0010] (1)將摻雜的粉料羧基丁苯橡膠和聚苯乙烯通過(guò)轉(zhuǎn)矩流變儀進(jìn)行共混；
[0011] (2)將（1)中共混的剪成小塊放入壓片模具的型腔里面；
[0012] (3)將液壓熱壓機(jī)升溫至210°C，等溫度到210°C之后，將（2)所述模具放入液壓熱 壓機(jī)中，啟動(dòng)油泵，壓制成型8分鐘；
[0013] (4)8分鐘之后，將（3)中所述模具取出，轉(zhuǎn)移到液壓冷壓機(jī)，冷壓8分鐘，取出制 品》備用；
[0014] (5)將⑷中的板材裁成直徑為15mm的圓片，放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，備用；
[0015] (6)用電子天平稱取7. 17g碳化二亞胺、4. 604g羥基琥珀酰亞胺以及 12. 1875g2-嗎啉乙磺酸水合物，用50ml蒸餾水將其溶解，放入4°C冰箱，備用；
[0016] (7)將（6)中所配的溶液滴加到步驟（5)的備用制品培養(yǎng)板中液面要完全覆蓋培 養(yǎng)板底部（約5滴），放入30°C烘箱2小時(shí)；
[0017] (8)將（7)中的培養(yǎng)板中的混合液體棄之，并將lg/L的蛋白溶液加入（7)中的細(xì) 胞培養(yǎng)板中，每孔2mL，并放在搖床上反應(yīng)24小時(shí)；
[0018] (9)24小時(shí)過(guò)后，將（8)中的細(xì)胞培養(yǎng)板中的液體棄置，并用大量的PH = 7. 35的 磷酸緩沖溶液沖洗，沖洗后烘干，封存。
[0019] 將hela細(xì)胞以5X 103細(xì)胞的密度接種于24孔本發(fā)明制成的培養(yǎng)板培養(yǎng)7天并 測(cè)試細(xì)胞活力（MTT試驗(yàn)），通過(guò)細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活性來(lái)顯示細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果表明經(jīng) 過(guò)本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞（圖4)增殖平均值顯著高于未處理聚苯乙烯培養(yǎng)板。
[0020] 本發(fā)明通過(guò)共混的方法在細(xì)胞培養(yǎng)材料表面引入羧基并偶聯(lián)R⑶短肽。相比其 它復(fù)雜工藝方法而言，本工藝簡(jiǎn)單易行，采用羧基丁腈橡膠因其具備良好的親水性能，且具 有較好的生物相容性，對(duì)于在細(xì)胞培養(yǎng)材料表面偶聯(lián)RGD短肽來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞貼 壁能力，實(shí)驗(yàn)用Hela細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明，可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明通過(guò)共混改性細(xì)胞培 養(yǎng)材料，相對(duì)于之前現(xiàn)有的專利發(fā)明，有著成本低，操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品性能穩(wěn)定，易于保存等優(yōu) 點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為細(xì)胞培養(yǎng)材料的實(shí)體圖，其中圖a為細(xì)胞培養(yǎng)材料的樣胚，圖b為細(xì)胞培 養(yǎng)材料裁剪之后的形狀。
[0022] 圖2為細(xì)胞培養(yǎng)材料的紅外表征圖。
[0023] 圖3為細(xì)胞培養(yǎng)材料的掃描電鏡掃描圖。其中圖a細(xì)胞培養(yǎng)材料的比例尺為10 微米，圖b細(xì)胞培養(yǎng)材料的比例尺為20微米。
[0024] 圖4 Hela細(xì)胞在培養(yǎng)材料表面生長(zhǎng)的熒光顯微鏡掃描圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 為了更加完整的了解本發(fā)明的有點(diǎn)和特點(diǎn)，下面結(jié)合具體實(shí)施案例來(lái)進(jìn)一步介紹 本發(fā)明。
[0026] 實(shí)施例一：共混改性的細(xì)胞培養(yǎng)材料的制備
[0027] (1)將摻雜的粉料和聚苯乙烯通過(guò)轉(zhuǎn)矩流變儀進(jìn)行共混；
[0028] (2)將⑴中共混的剪成小塊放入壓片模具的型腔里面；
[0029] (3)將液壓熱壓機(jī)升溫至210°C，等溫度到210°C之后，將⑵所述模具放入液壓熱 壓機(jī)中，啟動(dòng)油泵，壓制成型8分鐘；
[0030] (4)8分鐘之后，將（3)中所述模具取出，轉(zhuǎn)移到液壓冷壓機(jī)，冷壓8分鐘，取出制品 (圖la)，備用；
[0031] (5)將⑷中的板材裁成直徑為15mm的圓片（圖lb)，放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 備用；圖2為細(xì)胞培養(yǎng)材料的紅外表征圖，圖中在1376CHT 1的鋒表明材料表面已引入羧基官 能團(tuán)。圖3為細(xì)胞培養(yǎng)材料的掃描電鏡掃描圖，掃描電鏡圖顯示兩相相容性良好。
[0032] (6)用電子天平稱取7. 17g碳化二亞胺、4. 604g羥基琥珀酰亞胺以及 12. 1875g2-嗎啉乙磺酸水合物，用50ml蒸餾水將其溶解，放入4°C冰箱，備用；
[0033] (7)將（6)中所配的溶液滴加到步驟（5)的備用制品培養(yǎng)板中液面要完全覆蓋培 養(yǎng)板底部（約5滴），放入30°C烘箱2小時(shí)；
[0034] (8)將（7)中的培養(yǎng)板中的混合液體棄之，并將lg/L的蛋白溶液加入（7)中的細(xì) 胞培養(yǎng)板中，每孔2mL，并放在搖床上反應(yīng)24小時(shí)；
[0035] (9)24小時(shí)過(guò)后，將（8)中的細(xì)胞培養(yǎng)板中的液體棄置，并用大量的PH = 7. 35的 磷酸緩沖溶液沖洗，沖洗后烘干，封存。
[0036] 性能對(duì)比實(shí)驗(yàn)：
[0037] 在24孔板每個(gè)板中加入0.5毫升含10%小牛血清RPMI 1640(美國(guó)Gibco)培養(yǎng)液 中（內(nèi)含0.1 %青霉素、鏈霉素）培養(yǎng)基的HeLa細(xì)胞株。將細(xì)胞懸浮液稀釋至5 X103個(gè)細(xì) 胞/毫升，然后用lml的槍吸取0. 5ml細(xì)胞緩慢的逐滴滴入孔中。將接種好的24孔板放入 37°C，5% C02飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)，加入噻唑藍(lán)（MTT) 200毫升/孔，置C02培養(yǎng) 箱內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)，去上清，每孔加入200微升DM S0,輕度振蕩后，測(cè)定570nm處光吸收 值。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)MTT代謝產(chǎn)物結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)上述處理的細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞（圖4)增殖平均值 高于未處理聚苯乙烯培養(yǎng)板（上海禾汽玻璃儀器有限公司）10. 3%，在顯微鏡下觀測(cè)，細(xì) 胞貼壁生長(zhǎng)良好，形態(tài)保持穩(wěn)定。
[0038] 實(shí)施例二：共混改性的細(xì)胞培養(yǎng)材料的制備
[0039] (1)將摻雜的粉料和聚苯乙烯通過(guò)轉(zhuǎn)矩流變儀進(jìn)行共混；
[0040] (2)將⑴中共混的剪成小塊放入壓片模具的型腔里面；
[0041] (3)將液壓熱壓機(jī)升溫至210°C，等溫度到210°C之后，將（2)所述模具放入液壓熱 壓機(jī)中，啟動(dòng)油泵，壓制成型5-8分鐘；
[0042] (4) 5-8分鐘之后，將（3)中所述模具取出，轉(zhuǎn)移到液壓冷壓機(jī)，冷壓5-8分鐘，取出 制品，備用；
[0043] (5)將⑷中的板材裁成直徑為15mm的圓片，放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，備用；
[0044] (6)用電子天平稱取2. 39g碳化二亞胺、1. 53g輕基琥拍酰亞胺以及4. 06g2_嗎啉 乙磺酸水合物，用50ml蒸餾水將其溶解，放入4°C冰箱，備用；
[0045] (7)將（6)中所配的溶液滴加到步驟（5)的備用制品培養(yǎng)板中液面要完全覆蓋培 養(yǎng)板底部（約5滴），放入30°C烘箱3小時(shí)；
[0046] (8)將（7)中的培養(yǎng)板中的混合液體棄之，并將0· 5g/L的蛋白溶液加入（7)中的 細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔3mL，并放在搖床上反應(yīng)36小時(shí)；
[0047] (9)36小時(shí)過(guò)后，將（8)中的細(xì)胞培養(yǎng)板中的液體棄置，并用大量的PH = 7. 35的 磷酸緩沖溶液沖洗，沖洗后烘干，封存。
[0048] 在24孔板每個(gè)板中加入0.5毫升含10%小牛血清RPMI 1640(美國(guó)Gibco)培養(yǎng)液 中（內(nèi)含0.1 %青霉素、鏈霉素）培養(yǎng)基的HeLa細(xì)胞株。將細(xì)胞懸浮液稀釋至5 X103個(gè)細(xì) 胞/毫升，然后用lml的槍吸取0. 5ml細(xì)胞緩慢的逐滴滴入孔中。將接種好的24孔板放入 37°C，5% C02飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)，加入噻唑藍(lán)（MTT) 200毫升/孔，置C02培養(yǎng) 箱內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)，去上清，每孔加入200微升DM S0,輕度振蕩后，測(cè)定570nm處光吸收 值。
[0049] 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)MTT代謝產(chǎn)物結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)上述處理的細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞增殖平均值高 于未處理聚苯乙烯培養(yǎng)板（上海禾汽玻璃儀器有限公司）6.8%。在顯微鏡下觀測(cè)，細(xì)胞貼 壁生長(zhǎng)良好，形態(tài)保持穩(wěn)定。
【權(quán)利要求】
1. 一種通過(guò)共混改性的細(xì)胞培養(yǎng)材料，其特征在于，制備該細(xì)胞培養(yǎng)材料的原料是聚 苯乙烯與羧基丁苯橡膠的共混物，并且所述細(xì)胞培養(yǎng)材料聚苯乙烯表面偶聯(lián)R⑶多肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的通過(guò)共混改性的細(xì)胞培養(yǎng)材料，其特征在于按照以下方法制備 得到： (1) 將摻雜的羧基丁苯橡膠粉料和聚苯乙烯通過(guò)轉(zhuǎn)矩流變儀進(jìn)行共混； (2) 將（1)中共混物的剪成小塊放入細(xì)胞培養(yǎng)板壓片模具的型腔里面； (3) 將液壓熱壓機(jī)升溫至210°C，等溫度到210°C之后，將（2)所述模具放入液壓熱壓機(jī) 中，啟動(dòng)油泵，壓制成型5-8分鐘； (4) 5-8分鐘之后，將（3)中所述模具取出，轉(zhuǎn)移到液壓冷壓機(jī)，冷壓5-8分鐘，取出制 品》備用； (5) 將（4)中的板材裁成直徑為15mm的圓片，放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，備用； (6) 用電子天平稱取2. 39g-7. 17g碳化二亞胺、1. 53g-6. 906g羥基琥珀酰亞胺以及 4. 06g-18. 28g2-嗎啉乙磺酸水合物，用50ml蒸餾水將其溶解，放入4°C冰箱，備用； (7) 將￠)中所配的溶液滴加到步驟（5)的備用制品培養(yǎng)板中液面要完全覆蓋培養(yǎng)板 底部（約5-8滴），放入30°C烘箱2-4小時(shí)； (8) 將（7)中的培養(yǎng)板中的混合液體棄之，并將0. 5-2g/L的RGD多肽溶液加入（7)中 的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2-4mL，并放在搖床上反應(yīng)24-48小時(shí)； (9) 24-48小時(shí)過(guò)后，將（8)中的細(xì)胞培養(yǎng)板中的液體棄置，并用大量的PH= 7. 35的磷 酸緩沖溶液沖洗，沖洗后烘干，封存。
3. 如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞培養(yǎng)材料，其特征在于RGD多肽序列為RGDKKK。
4. 一種制備權(quán)利要求1所述的通過(guò)共混改性的細(xì)胞培養(yǎng)材料的方法，其特征在于包括 以下步驟： (1) 將摻雜的羧基丁苯橡膠粉料和聚苯乙烯通過(guò)轉(zhuǎn)矩流變儀進(jìn)行共混； (2) 將（1)中共混物剪成小塊放入細(xì)胞培養(yǎng)板壓片模具的型腔里面； (3) 將液壓熱壓機(jī)升溫至210°C，等溫度到210°C之后，將（2)所述模具放入液壓熱壓機(jī) 中，啟動(dòng)油泵，壓制成型5-8分鐘； (4) 5-8分鐘之后，將（3)中所述模具取出，轉(zhuǎn)移到液壓冷壓機(jī)，冷壓5-8分鐘，取出制 品》備用； (5) 將（4)中的板材裁成直徑為15mm的圓片，放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，備用； (6) 用電子天平稱取2. 39g-7. 17g碳化二亞胺、1. 53g-6. 906g羥基琥珀酰亞胺以及 4. 06g-18. 28g2-嗎啉乙磺酸水合物，用50ml蒸餾水將其溶解，放入4°C冰箱，備用； (7) 將￠)中所配的溶液滴加到步驟（5)的備用制品培養(yǎng)板中液面要完全覆蓋培養(yǎng)板 底部（約5-8滴），放入30°C烘箱2-4小時(shí)； (8) 將（7)中的培養(yǎng)板中的混合液體棄之，并將0. 5-2g/L的RGD多肽溶液加入（7)中 的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2-4mL，并放在搖床上反應(yīng)24-48小時(shí)； (9) 24-48小時(shí)過(guò)后，將（8)中的細(xì)胞培養(yǎng)板中的液體棄置，并用大量的PH = 7. 35的磷 酸緩沖溶液沖洗，沖洗后烘干，封存。
【文檔編號(hào)】C08L25/06GK104151591SQ201410366792
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】朱沛志, 陳金帥 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)