本發明涉及一種新型磷脂酶及其編碼基因。還涉及包含所述基因的載體以及宿主細胞。

背景技術：

磷脂酶是水解磷脂的酶，根據水解位置不同分為幾種大類。磷脂酶A1(PLA1)水解游離出sn-1位的脂肪酸；磷脂酶A2(PLA2)水解釋放出sn-2位的脂肪酸；磷脂酶B(PLB)水解釋放出sn-1及sn-2位的脂肪酸；磷脂酶C(PLC)水解甘油-磷酸酯鍵，釋放出二酰基甘油和磷酸酯；磷脂酶D(PLD)水解磷酸-堿酯鍵，釋放出磷脂酸和堿(膽堿、乙醇胺或肌醇)。磷脂酶廣泛使用在磷脂去除、磷脂改性等方面。

卵磷脂(磷脂酰膽堿，Phosphatidyl choline，PC)是使用最普遍的磷脂。它是天然的表面活性劑，具有多種重要的生理功能，在乳化機、潤濕劑、分散劑、穩定劑、藥物載體以及直接用于治療心血管疾病方面使用廣泛。卵磷脂主要來自大豆和蛋黃。工業級卵磷脂大部分來自毛油脫膠后產生的油腳，大豆產量豐富而且大豆卵磷脂中不飽和脂肪酸含量比蛋黃卵磷脂高。但油腳中除了卵磷脂外，還存在腦磷脂(磷脂酰乙醇胺，Phosphatidyl ethanolamine，PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸、脂肪酸鹽、中性油、蛋白質及其他雜質。治療、精細化工、藥物載體甚至高級食品都需要純度很高的卵磷脂，但卵磷脂一般都與其他磷脂共同存在，并有類似的溶解性質，分離困難。從大豆制備卵磷脂，一般先制得粗磷脂，然后按需要進行純化。目前卵磷脂的純化有⑴溶劑法；⑵金屬鹽沉淀法；⑶超臨界萃取法；⑷薄層色譜法；⑸柱層析法；⑹膜分離法。[磷脂酰膽堿的提取、純化和分析研究，羅珍，碩士論文]。其中工業上最常用是乙醇浸提法[高純卵磷脂的分離提純方法,張秀青、于才淵，糧油加工與食品機械，2006,4期，45-48]，PC溶于乙醇，PE溶于熱乙醇[磷脂算的提取純化與生理活性分析，論文]，但乙醇富集也僅能將PC含量濃縮到45.3％[大豆磷脂酰膽堿的提取純 化研究，葛玉卿，論文]需要再經過柱層析才能達到95％的純度。如果有能水解腦磷脂但不水解卵磷脂的酶，顯然可以使得卵磷脂的純化更加簡單、低耗、低污染。

甘油磷酸乙醇胺(GPE)是體內天然存在的水溶性磷脂代謝產物，主要存在于大腦及肝臟中，是生物體內PC、PE、PS等磷脂成分生物合成的重要前體。在實驗室的動物試驗中，GPE表現出了顯著地提高記憶力以及學習模仿能力的作用，在人體的臨床試驗中，它對心理智能測試的結果、常用的神經尺度測量結果以及神經生理學參數均產生了一定的影響。它能治療人體的各種神經和心理功能缺陷方面的疾病，如心理活動緩慢、記憶力隨著年齡增長而下降，以及情緒不穩、心理比較脆弱等方面的疾病。因此，GPE常用作藥物的主要有效成分，與適當的載體相互輔助，用于治療由于大腦退化或腦血管功能不全引起的慢性腦部神經組織綜合癥。目前磷脂中PC、PE混雜，很難區分，因此制備純的GPE很難，一般通過甲醇鈉催化PC、PE混合物醇解，然后通過離子交換樹脂分離出GPE，效率很低。如果有轉一性水解腦磷脂的酶，即可利用它來水解混合磷脂，釋放出GPE來。制備工作更加簡單高效。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種新的磷脂酶，該酶具有磷脂酰乙醇胺酰基酯水解活力但不具備磷脂酰膽堿的水解活力。其包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成：(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列經過取代、缺失或添加至少一個氨基酸后得到的序列，所述取代優選為氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO:2的功能。

在一個實施方案中，本發明的磷脂酶的序列如SEQ ID NO:2所示。此外，本發明的SEQ ID NO:2還可以具有氨基酸殘基的一個或幾個缺失、插入或取代，這些改動產生沉默變化或者產生功能上等效的酶。在保持酶活性的情況下，被設計的氨基酸取代可以根據殘基在極性、電荷、可溶性、親水性、疏水性和/或雙親性質上的相似性。例如，帶負電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和 精氨酸；具有相似的親水性的具有不帶電的極性頭部的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

保守取代可以根據下表來進行。在第二欄中屬于同一個分區的氨基酸可以相互取代，在優選的情況下第三欄中同一行的氨基酸可互相取代：

本發明包括通過對SEQ ID NO:2進行刪除、插入或保守取代得到的、仍然保留其活性的序列。其應該被視為SEQ ID NO:2的等同方案而得到保護。

本發明還涉及核酸分子，其選自：(1)編碼本發明的磷脂酶的核苷酸序列或與(1)所述的核苷酸序列互補的核苷酸序列。

在一個實施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

技術人員將會認為，由于遺傳密碼的簡并性，多種不同的核苷酸序列可以編碼同樣的酶。另外，可以認識到，技術人員能夠使用常規技術進行不影響本發明的核苷酸序列所編碼的酶活性的核苷酸取代，這樣可以反映表達本發明的酶所用的任何特定的宿主生物體的密碼子偏倚性。因此，本發明也包括與本文列出的SEQ ID NO:1和2具有至少90％的同一性，更為優選的情況下具有至少95％的同一性，尤為優選的情況下具有至少98％的同一性，并且仍然保留所需活性的序列。其應該被視為SEQ ID NO:1和2的等同方案而得到保護。氨基酸和核酸序列的同一性比較可以采用本領域常規的計算機程序進行。

本發明還提供了包含所述核酸分子的載體，以及包含所述核酸分子或所述載體的宿主細胞。所述宿主細胞可以是大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母、黑曲霉、米曲霉、破囊壺菌、裂殖壺菌 等。在另一實施方案中，所述細菌細胞是畢赤酵母細胞。

本發明還涉及前述多肽、多核苷酸、表達載體或宿主細胞在制備磷脂酶中的用途。

本發明還涉及增強本發明的磷脂酶的活性的方法，包括在所述酶的制劑中加入鎂離子、鈣離子、銅離子、錳離子或鋅離子，優選的，在酶的制劑中加入硫酸鎂、氯化鈣、硫酸銅、氯化錳或硫酸鋅。

附圖說明

圖1為磷脂酶基因PCR產物回收物電泳檢測照片。

圖2為含有磷脂酶基因的pPIC9k載體酶切檢驗電泳照片。

圖3為含有磷脂酶基因的pPIC9k載體結構示意圖。

圖4為重組畢赤酵母菌落PCR檢驗電泳照片，UD為磷脂酶基因的擴增產物，AOXAlf為整個表達框的擴增產物。

圖5為粗酶液水解混合磷脂、卵磷脂、腦磷脂后，正己烷提取液的薄層色譜照片。“鈣”、“鎂”、“鋅”指使用g1-9k菌株發酵所得粗酶液并且在反應體系中分別添加有鈣、鎂、或鋅離子。“鈣-”“鎂-”“鋅-”指使用9k-1#菌株發酵所得粗酶液并且在反應體系中分別添加鈣、鎂、或鋅離子。PLA1、PLA2分別指使用商品酶PLA1或PLA2水解腦磷脂；DAG為1,3-甘二酯標準品。FFA為油酸標準品。

圖6為g1-9k-1#及g1-9k-2#菌發酵粗酶液水解大豆混合磷脂、卵磷脂、腦磷脂的薄層中性展開色譜結果。“負”為9k-1#菌發酵所得粗酶液水解結果。

圖7為g1-9k-1#菌株發酵所得粗酶液水解卵磷脂、腦磷脂產物薄層極性展開色譜圖。負指9k-1#菌株發酵所得粗酶液。A1、A2分別指使用商品PLA1酶或PLA2酶水解腦磷脂的產物。PE為腦磷脂。

圖8為1-9k-1#菌株發酵所得粗酶液水解腦磷脂、卵磷脂、大豆混合磷脂后，薄層色譜中性展開色譜照片。

具體實施方式

本發明通過PCR方法擴增出裂殖壺菌的磷脂酶基因，連入表達載體，然后在畢赤酵母菌中使用甲醇誘導表達，收集并濃縮發酵上清液。分別使用大豆混合磷脂、卵磷脂、腦磷脂為底物，檢測了表達物磷脂 酶活力。

本發明的磷脂酶，在畢赤酵母菌中得到了較好的表達，檢測出了磷脂酶活力。

本發明的磷脂酶包含選自以下的序列或由選自以下的序列組成：(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列經過取代、缺失或添加至少一個氨基酸后得到的序列，所述取代優選為氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO:2的功能。

可以對SEQ ID NO:2進行1-20個氨基酸的取代、缺失或添加。優選地，進行1-15、1-10、1-5或1-3個氨基酸的取代、缺失或添加。

本發明還涉及核酸分子，其選自：(1)編碼本發明的磷脂酶的核苷酸序列或與(1)所述的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在一個實施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發明也包括與本文列出的SEQ ID NO:1和2具有一定的百分比同一性，并且仍然保留所需活性的序列。

百分比同一性是兩條或更多條多肽序列之間或兩條或更多條多核苷酸序列之間的關系，該關系通過對序列進行比較確定。本領域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關性程度，根據具體情況，通過此類線性序列的匹配情況進行測定。“同一性”能夠通過已知方法容易地計算，所述方法包括但不限于下述的那些方法：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.，Ed.)Oxford University Press，NY(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.，Ed.)Academic Press，NY(1993)；Computer Analysisof equence Data，Part I(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，Eds.)Humana Press，NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.，ed.)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.)Stockton Press，NY(1991)。確定同一性的方法在可公開獲得的計算機程序中編成了代碼。序列比對和同一性百分比計算可使用LASERGENE生物信息學計算軟件包的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)、或EMBOSS Open Software Suite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends in Genetics 16， (6):276-277(2000))。序列多重比對可使用Clustal比對方法進行(即CLUSTALW；例如1.83版)(Higgins和Sharp，CABIOS，5:151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.22:4673-4680(1994)；以及Chenna等人，Nucleic Acids Res 31(13):3497-500(2003))，它們得自European Molecular Biology Laboratory via the European Bioinformatics Institute)，使用默認參數。

合適的核苷酸或氨基酸序列與本文報道的序列具有至少約50％，優選至少60％，更優選至少70％，更優選至少80％，甚至更優選至少85％，甚至更優選至少90％，甚至更優選至少95％，最優選至少98％的同一性。

本發明還提供了包含所述核酸分子的載體，以及包含所述核酸分子或所述載體的宿主細胞。

“載體”是指通常攜帶有不屬于細胞中心代謝的部分的基因的染色體外元件，并且常常是環狀雙鏈DNA分子的形式。此類元件可為得自任何來源的自主復制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性或環狀的單鏈或雙鏈DNA或RNA，其中許多核苷酸序列已經被接合或重組到特定構建體中，該構建體能夠將所選基因產物的啟動子片段和DNA序列連同合適的3'非翻譯序列一起導入細胞。

本發明序列的基因和基因產物可在異源宿主細胞尤其是微生物宿主細胞中生產。用于表達本發明基因和核酸分子的優選異源宿主細胞是存在于真菌或細菌家族中并在寬溫度、pH值和溶劑耐受性范圍內生長的微生物宿主。例如，預期任何細菌、酵母和絲狀真菌可為表達本發明核酸分子的合適宿主。宿主菌株的實例包括但不限于細菌、真菌或酵母物種例如曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、糖酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、發夫酵母屬(Phaffia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、沙門氏菌屬(Salmonella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、發酵單胞菌屬(Zymomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、赤細菌屬(Erythrobacter)、綠菌屬(Chlorobium)、著色菌屬(Chromatium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、噬纖維菌屬(Cytophaga)、紅細菌屬(Rhodobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、 短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、異常球菌屬(Deinococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、甲基細菌屬(Methylobacter)、甲基球菌屬(Methylococcus)、甲基彎菌屬(Methylosinus)、甲基微菌屬(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌屬(Methylocystis)、產堿菌屬(Alcaligenes)、集胞藍細菌屬(Synechocystis)、聚球藍細菌屬(Synechococcus)、魚腥藍細菌屬(Anabaena)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和粘球菌屬(Myxococcus)物種。所述宿主細胞可以是大腸桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母、黑曲霉、米曲霉、破囊壺菌、裂殖壺菌等。在一個實施方案中，所述宿主細胞是畢赤酵母細胞。

可用于轉化上述宿主細胞的載體是本領域熟知的。通常，載體包含指導相關基因轉錄和翻譯的序列、可選標記和允許自主復制或染色體整合的序列。合適的載體包含含有轉錄起始控制的基因5'區域和控制轉錄終止的DNA片段3'區域。

可應用多種培養方法以制備本發明的酶。例如，從重組微生物宿主中大規模生產特定基因產物可通過分批、分批補料和連續培養方法進行。

分批和補料分批培養方法在本領域內是常用的且眾所周知，并且實例可見于如下文獻：Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook ofIndustrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989))，以及Deshpande，Mukund V.，(Appl.Biochem.Biotechnol.，36:227-234(1992)。

本發明的酶的商業生產也可通過連續培養進行。連續培養是一種開放式系統，其中將設定好的培養基連續加入生物反應器中，并同時移出等量條件培養基用于加工。連續培養一般使細胞維持在其中細胞主要處于對數生長期的恒定高液相密度。或者，連續培養可以用固定化細胞來進行，其中連續添加碳和營養素，且連續從細胞團塊中取出有價值的產物、副產物或廢棄物。細胞固定可使用范圍廣泛的固體載體進行，所述固體載體由天然材料和/或合成材料組成。

從分批發酵、分批補料發酵、或連續培養中回收期望的酶可通過本領域技術人員已知的任何方法完成。例如，當在細胞內生產酶時，通過離心或膜過濾從培養基中分離細胞漿液，任選地用水或期望pH的含水緩沖液洗滌，然后將期望pH的含水緩沖液中的細胞漿液懸浮使其勻化，生產出包含需要的酶的細胞提取物。

本發明的酶可以在甘油中保存。經實驗發現，甘油及低溫未抑制該酶活力。

本發明的酶也可以制成固體粉末形式進行保存。例如，細胞提取物可任選地濾過合適的助濾劑如硅藻土或二氧化硅以在熱處理步驟前除去細胞碎片，所述熱處理步驟用于從酶溶液中沉淀非期望的蛋白。包含期望的酶的溶液然后可通過膜過濾或離心與沉淀的細胞碎片和蛋白分離，并且所得部分純化的酶溶液通過附加地膜過濾進行富集，然后任選地與合適賦形劑混合(例如麥芽糖糊精、海藻糖、蔗糖、乳糖、山梨醇、甘露糖醇磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、或它們的混合物)并噴霧干燥的以制備包含期望酶的固體粉末。

發明人還發現，本發明的酶的活性可以通過加入一些離子得到提到。例如，為了增強其活性，可以在所述酶的制劑中加入鎂離子、鈣離子、銅離子、錳離子或鋅離子，優選的，在酶的制劑中加入硫酸鎂、氯化鈣、硫酸銅、氯化錳或硫酸鋅。

本發明的酶從裂壺藻基因組中分離得到，因而能在裂壺藻中良好表達。

當數量、濃度或其他數值或參數以范圍、優選范圍或優選上限數值和優選下限數值的列表形式給出時，其應理解為具體地公開由任何范圍上限或優選數值和任何范圍下限或優選數值的任何一對所構成的所有范圍，而不管所述范圍是否被單獨地公開。凡在本文中給出某一數值范圍之處，該范圍均旨在包含其端點，以及位于該范圍內的所有整數和分數，除非另行指出。當定義一個范圍時，不希望范圍限定于所列舉的具體數值。

提供以下實施例以展示優選實施方案。本領域的技術人員應認識到下文實施例中公開的技術代表本發明人發現的在本文公開方法的實施中功能良好的技術，因此可認為其構成實施的優選模式。然而，按照本公開，本領域的技術人員將認識到在公開的具體實施方案中能進 行不脫離本文公開方法的實質和范圍的許多改變，并且仍然獲得同樣的或類似的結果。

實施例中使用的試劑：

pPIC9k載體和表達宿主菌畢赤酵母SMD1168購自Invitrogen公司。

PLA1，Lecitase Ultra A1購自諾維信、PLA2購自Sigma公司貨號P8685。

純品卵磷脂、腦磷脂購自阿拉丁。

實施例一：

接種裂壺藻(Schizochytrium sp.ATCC 20888)到50ml YPD液體培養基(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中培養48h，4℃下4000rpm離心5min收集菌體并用去離子水洗滌2遍，將菌體在液氮中磨碎，然后使用Takara公司MiniBEST Universal Genomic DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

合成引物gU(SEQ ID NO:3)、gD(SEQ ID NO:4)，利用該對引物從裂壺藻基因組中擴增磷脂酶基因，并使之5’端帶有NdeI、3’端帶有Not I限制性酶切位點。PCR體系為50ul，組成為：水13.5ul、2×GC I buffer 25ul、dNTPs 6ul、引物各2ul(20μM母液)、LA-Tag(Takara公司)0.5ul，模板1ul。PCR擴增程序為：98℃變性5分鐘；12個循環的熱不對稱PCR：95℃30s、63℃30s、72℃1min、95℃30秒、63℃30s、72℃1min、95℃30s、44℃30s、72℃1min；72℃10min。

PCR產物使用Omega公司Cycle Pure試劑盒純化，純化物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗，結果如圖1所示。

在37℃水浴使用NEB公司EcoRI、NotI雙酶切PCR產物2h，酶切體系為：水20μl，4#buffer 10μl，PCR產物60μl，EcoRI 5μl，NotI 5μl。

在37℃水浴使用NEB公司EcoRI、NotI雙酶切pPIC9k載體2h，酶切體系為水60μl，4#buffer 10μl，質粒20μl，EcoRI 5μl，NotI 5μl。

將雙酶切后的PCR產物和雙酶切后的pPIC9k載體分別使用Omega公司Cycle Pure試劑盒純化，純化物用去離子水洗脫成30μl。

使用Fermentas公司T4DNA連接酶連接雙酶切后的PCR產物和雙酶切后的pPIC9k載體，連接體系為：水15.5μl，10×T4DNA連接酶緩沖液2μl，基因片段2μl，載體片段0.5μl。連接條件為16℃2h。

取10ul連接產物，加入到200ul大腸桿菌DH5α感受態(Takara公司D9057)中，輕柔混勻，冰浴30分鐘后42℃水浴熱激90秒，立即冰浴2分鐘并加入800ul新鮮LB培養液(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，pH7.0)，37℃搖床200rpm振蕩培養40分鐘，涂布50ul到LB平板(LB培養液加1.8％瓊脂粉，含氨芐青霉素50ug/ml)，置37℃培養箱培養過夜。次日挑選單克隆接種到5ml LB培養液中(含50ug/ml氨芐青霉素)，37℃搖床200rpm振蕩培養過夜。

使用Axygen質粒提取試劑盒獲得提取質粒，并使用NEB公司NdeI、EcoRI限制性內切酶進行雙酶切檢驗，酶切體系20μl，質粒用量5μl，酶用量各1μl，4#緩沖液2μl，水11μl。37℃水浴酶切1h，并將酶切物經瓊脂糖凝膠電泳檢驗，結果如圖2所示。

根據圖2結果，在1.5k位置有符合基因大小的片段出現，表明基因已經插入pPIC9k載體中。將該質粒送上海生工測序檢驗，結果顯示插入序列如SEQ ID NO.:1所示，其對應編碼如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列，所得的基因命名為pld8，含有該基因的pPIC9k載體命名為g1-pPIC9k，其結構如圖3所示。

在GeneBanK上進行blastp分析,比對結果表明與本基因最接近的結果為Ricinus communis來源的phospholipase d beta,putative，相似度最高僅為41％。

37℃水浴下，使用NEB公司SalI-HF限制性內切酶分別線性化g1-pPIC9k以及pPIC9k載體2h，酶切體系為水55μl，質粒60μl，4#buffer 15μl，SalI-HF 10μl。使用Omega公司Cycle Pure試劑盒純化，去離子水洗脫成20μl。

從畢赤酵母SMD1168菌株的甘油保藏管中，用接種環沾取菌液劃線接種到YPD(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母粉，2％瓊脂粉，pH6.8)平板上，置28℃培養箱培養48h至出現明顯菌落，然后接種畢赤酵母SMD1168單菌落到YPD液體中，過夜培養。4℃4000rpm離心5min收集菌體，按照文獻[Shixuan Wu&Geoffrey J.Letchworth.High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol.Drug Discovery and Genomic Techinologies,2004,36(1):152-154]的方法，將經NEB公司SacI限制性內切酶線性化的g1-pPIC9k及pPIC9k空載體轉入畢赤酵母中，線性化酶切體系為水35μl，SacI酶5μl，1#緩沖液10μl，質粒50μl，酶切物于37℃酶切過夜，然后使用omega公司PCR cycle試劑盒回收，并使用去離子水洗脫成30μl。轉化后的酵母菌涂布MD平板(1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％葡萄糖)28℃培養箱培養2天。

從g1-pPIC9k篩選平板上挑選若干菌落，并從pPIC9k空載體轉化篩選平板上挑選菌，接種到YPD培養基中，于28℃搖床200rpm過夜培養。菌體冷凍保存備用。

取重組菌的菌體，液氮中速凍后轉到研磨中，加液氮磨碎，然后使用Takara公司MiniBEST Universal Genomic DNA提取試劑盒提取基因組DNA。使用該基因組為模板，進行PCR擴增驗證。PCR體系為25μl，組成為水17ul、10×buffer 2.5μl、dNTPs 2μl、引物各1μl(20μM母液)、rTag 0.3μl，模板1μl。PCR擴增程序為：98℃變性5分鐘；30個循環的PCR：95℃40s、50℃30s、72℃2min；72℃10m。其中，

以gU和gD為引物對，擴增外源基因磷脂酶pld8(UD)；

以alfac(如SEQ ID NO:5所示)及3’AOX(如SEQ ID NO:6所示)為引物對，擴增鑒定全表達框(AOXAlf)。

擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗，結果顯示共有5株重組菌擴增出目標條帶UD、AOXAlf，表明g1-pPIC9k載體已經插入到相應菌株的基因組中，分別命名為g1-9k-1#、g1-9k-2#、g1-9k-3#、g1-9k-5#和g1-9k-5#，其中，g1-9k-1#的電泳結果如圖4所示。空載體轉化所得的畢赤酵母命名為9k。

實施例2：活性分析

接種陽性重組菌g1-9k-1#及對照9k到50mlYPD培養液中，28℃200rpm搖床培養過夜。400rpm離心2min去上清，將菌體重懸到50ml BMMY培養液(1％酵母浸出物，2％蛋白胨，100mM磷酸鉀PH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)中，28℃搖床200rpm培養，每24h添加250μl無水甲醇進行誘導。甲醇誘導表達96h后，4℃ 12000rpm離心10min收集發酵上清液，0.22μm濾膜過濾處理后，使用Millipore公司10K超濾膜超濾置換緩沖液后，濃縮50ml發酵液到5ml。

1、水解磷脂實驗：

使用5％的大豆混合磷脂、卵磷脂、腦磷脂為底物，在1.5ml Eppendorf管中進行反應，反應體系為：200μl 5％磷脂+40μl 250mM鹽溶液+100μl酶液+200μl 200mM pH8.5Tris-HCl緩沖液+460μl水。反應條件為37℃200rpm搖床振蕩過夜，其中，陽性體系為g1-9k-1#菌發酵所得的酶液，陰性為9k菌發酵所得的酶液。反應結束后，向反應管中加入400μl正己烷，將管子置于顛倒混勻儀上混合1h，室溫下12000rpm離心1min。取頂層正己烷層用于薄層色譜分析。點樣量5μl，展開條件：氯仿：乙醚：冰醋酸＝82：18：2。將高效薄層板置層析缸中展開30min，取出，自然干燥后，放入碘缸熏染，結果如圖5所示。

根據圖5結果，含有目的基因的重組菌酶液能夠從混合磷脂、腦磷脂中釋放出游離脂肪酸(FFA)，鈣離子、鋅離子有助于酶活，鋅離子更佳。

2、pH實驗

選用g1-9k-1#及g1-9k-2#的酶液進行實驗。在2ml Eppendorf管中進行酶解反應，反應體系如下：200μl 5％磷脂+40μl 250mM鹽溶液+100μl酶液+200μl緩沖液+460μl水；pH5.5(醋酸鹽)下，兩株發酵所得酶液都做反應；pH8.5(Tris)下，僅1#做反應。其中，使用的磷脂分別為大豆混合磷脂、卵磷脂及腦磷脂。反應條件為28℃搖床振蕩過夜。反應結束后，向反應管中加入500μl正己烷，顛倒混勻1h后，于12000rpm離心2min，移取上層正己烷相，進行薄層色譜分析。每個樣品取5μl點樣，所用高效硅膠板展開劑為：氯仿：乙醚：乙酸＝82:18:2。

樣品展開后，取出薄層板，室溫干燥后置于碘蒸汽染缸中熏染10min，取出拍照。圖6為薄層展開的結果。其中51-鈣為pH5.5體系下含鈣的水解體系，使用混合磷脂為底物，使用1#菌的發酵上清液為酶液。52-鈣為pH5.5體系下含鈣的水解體系，使用混合磷脂為底物，使用2#菌的發酵上清液為酶液。81-鈣為pH8.0體系下含鈣的水解體系，使用混合磷脂為底物，使用1#菌的發酵上清液為酶液。51-卵鈣為pH5.5 體系下含鈣的水解體系，使用純品卵磷脂為底物，使用1#菌的發酵上清液為酶液。52-卵鈣為pH5.5體系下含鈣的水解體系，使用純品卵磷脂為底物，使用2#菌的發酵上清液為酶液。81-卵鈣為pH8體系下含鈣的水解體系，使用純品卵磷脂為底物，使用1#菌的發酵上清液為酶液。51-卵鈣為pH5.5體系下含鎂的水解體系，使用純品卵磷脂為底物，使用1#菌的發酵上清液為酶液。

DAG為純品1,3-甘油二酯。

51-鎂為pH5.5體系下含鎂的水解體系，使用混合磷脂為底物，使用1#菌的發酵上清液為酶液。52-鎂為pH5.5體系下含鎂的水解體系，使用混合磷脂為底物，使用2#菌的發酵上清液為酶液。81-鎂為pH8.0體系下含鎂的水解體系，使用混合磷脂為底物，使用1#菌的發酵上清液為酶液。51-腦鋅為pH5.5體系下含鋅的水解體系，使用純品腦磷脂為底物，使用1#菌的發酵上清液為酶液。52-腦鋅為pH5.5體系下含鈣的水解體系，使用純品腦磷脂為底物，使用2#菌的發酵上清液為酶液。81-腦鋅為pH8體系下含鈣的水解體系，使用純品腦磷脂為底物，使用1#菌的發酵上清液為酶液。51-腦鈣為pH5.5體系下含鈣的水解體系，使用純品腦磷脂為底物，使用1#菌的發酵上清液為酶液。52-腦鈣為pH5.5體系下含鈣的水解體系，使用純品腦磷脂為底物，使用2#菌的發酵上清液為酶液。81-腦鈣為pH8體系下含鈣的水解體系，使用純品腦磷脂為底物，使用1#菌的發酵上清液為酶液。5負為pH5.5體系下含鋅的水解體系，使用大豆混合磷脂為底物，使用9k菌發酵所得酶液。8負為pH8體系下含鋅的水解體系，使用大豆混合磷脂為底物，使用9k菌發酵所得酶液。薄層最前端的條帶為游離脂肪酸。

根據圖6結果，水解混合磷脂，81-鈣體系釋放出的游離脂肪酸的量明顯超過51-鈣，表明pH8的條件更合適：81-鈣的水解效果好于51-鈣、52-鈣、51-鎂、52-鎂。水解腦磷脂，81-腦鋅的效果好于51-腦鋅、52-腦鋅、51-腦鈣、52-腦鈣、81-腦鈣。1#及2#菌所得酶液都無法降解卵磷脂。5負、8負為9k菌發酵所得酶液處理混合磷脂的結果。

以pH8.5條件進行1.5ml管的反應，使用重組酶液、對照酶液、PLA1及PLA2四種酶進行對比。將反應后提取物薄層在極性條件下展開，展開體系為氯仿：甲醇：氨水＝65：35：8，結果如圖7所示。

根據圖7的極性展開結果，g1-9k-1#發酵所得酶液無法處理卵磷脂，但可以水解腦磷脂。水解結果中，PLA2還殘留有溶血磷脂酰乙醇胺，但本酶及PLA1沒有。

上述結果顯示，本發明的重組酵母，可以在甲醇誘導后，產生能作用磷脂的酶，該酶的活力需要鈣離子或鋅離子，在酸性和堿性條件下都可以發生反應。該酶為PLA1或PLB。

3、滴定

采用滴定法檢測酶活。反應為g1-9k菌表達所得酶液，負對照為9k重組菌所得酶液。反應過夜后用0.05M NaOH滴定到pH7.5。反應體系為4ml 5％混合磷脂+800μl 250mM鈣或鋅鹽+酶液5ml+水9.8ml+400μl 1M pH7.5Tris-HCl緩沖液。反應條件為溫度40℃搖床100rpm振蕩16h。

該酶液釋放游離脂肪酸的速度為，鈣體系：1.5μm/h·ml；鋅體系:1.1μm/h·ml

4、其他離子的作用

在圖8所示的各離子條件下使用g1-9k-1#菌發酵所得粗酶液水解底物，通過TLC檢測酶活力，其中，水解體系為：水610μl，金屬10mM，5％的PC 100μl或2.5％的PE200μl，酶液200μl，1M pH7.5Tris 50μl。中性展開體系：氯仿：乙醚：乙酸體積比＝82:18:2。所用離子分別來自氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨、氯化鈣、硫酸鋅、硫酸銅、氯化錳、硫酸鎳、氯化鈷、氯化鐵。

根據圖8結果，無論在哪種鹽離子存在下，酶液都不具備水解卵磷脂的活力。以腦磷脂為底物，重組菌生產的酶在鈣、鎂、鋅、銅、錳體系下，有活力。混合磷脂做底物，在鈣、鋅體系下有活力。