一種鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的分子標記方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于甘蔗分子生物學及甘蔗抗性鑒定技術領域。更具體涉及一個與甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的分子標記鑒定方法，同時還涉及該分子標記在甘蔗抗褐銹病育種中的應用。
【背景技術】
[0002]甘蔗是世界上最重要的糖料作物和重要的低碳經濟作物，蔗糖長期占世界食糖總產72%以上，其光合效率為C4作物之首，具有高光效特性、生長巨型性、可多年宿根栽培和大量固定CO2等特性，在適宜條件下畝產糖可高達I噸以上，也是迄今生物量最高的栽培作物。我國為世界第三產糖國和第二食糖消費國，蔗糖占我國食糖總產92%以上，甘蔗對保證我國食糖安全和發展低碳經濟有不可替代的作用。根據ISSCT統計，甘蔗品種改良的科技貢獻率高達60%。但是，隨著甘蔗褐銹病的爆發和流行，致使一些豐產高糖當家品種如Co475、T34362和CP78-1247被淘汰，極大地影響了蔗糖產業的持續穩定發展。
[0003]由黑頂柄銹菌(Puccinamelanocephala H.Sydow & P.Sydow)引起的甘鹿褐銹病是一種重要的世界性甘蔗病害，嚴重危害甘蔗生長，對蔗農造成巨大的經濟損失。該病自1890年在爪哇首次被發現以來，隨后迅速擴散到世界上多數植蔗國家和地區，在古巴、牙買加、澳大利亞、美國、墨西哥、印度、泰國和毛里求斯等植蔗國家和地區普遍發生，并多次暴發流行。我國臺灣1977年首次發生甘蔗銹病，1982年首次在中國大陸云南甘蔗種植區發現該病害，之后在福建、廣東、四川、江西和廣西等蔗區先后報道。目前，該病在國內蔗區普遍發生和蔓延危害，造成甘蔗種質退化、產量降低。發病田塊一般減產15%?30%，嚴重地塊減產幅度可達40%以上，蔗糖含量降低10%?36%。尤其近年，我國蔗區主栽的一批豐產高糖品種如“桂糖15”、“桂糖17”、“桂引9號”和主推品種“粵糖60號”和“德蔗03-83”等也因高度感染銹病而面臨淘汰。
[0004]甘蔗銹病的流行與品種抗病性密切相關，大面積種植感病品種是病害流行的重要原因，選育和種植抗病品種是防治該病最經濟有效的措施。而抗病種質資源的發掘利用是抗病育種的基礎和關鍵。目前，我國對甘蔗銹病抗病資源的篩選鑒定和評價還停留在人工接種表型觀察選擇，尚未開展抗銹病基因標記選擇研究。傳統的人工接種表型選擇抗病性的方法耗時、低效，鑒定結果易受病原和環境因素影響，難以滿足育種家對抗病育種要求。因此，為了保證國家的甘蔗產業可持續健康發展的進行，提高我國甘蔗生產技術水平，迫切需要建立一種簡便、快速、準確、靈敏的鑒定甘蔗抗褐銹病方法，是甘蔗抗褐銹病分子育種最關鍵的技術。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的分子標記方法，鑒定或輔助鑒定甘蔗抗褐銹病的方法及其在甘蔗抗褐銹病育種中的應用。
[0006]本發明所提供的鑒定或輔助鑒定甘蔗抗褐銹病的方法，包括如下步驟:分別以待鑒定甘蔗和P0J2878的基因組DNA為模板，用由序列表中序列I和序列表中序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對進行PCR擴增，將擴增的PCR產物利用限制性核酸內切酶HaeIII進行酶切，通過電泳檢測擴增產物，按照如下方法確定待鑒定甘蔗對褐銹病的抗性:
如果待鑒定甘蔗的PCR擴增產物電泳條帶有與P0J2878帶型相同的條帶，且大小為389 bp則待鑒定甘蔗為抗褐銹病甘蔗或候選為抗褐銹病甘蔗，如果待鑒定甘蔗的PCR擴增產物電泳條帶沒有與P0J2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為非抗褐銹病甘蔗為或為候選非抗褐銹病甘蔗;所述待鑒定甘蔗為桂糖35和科5的雜交后代，上述方法中，所述待鑒定甘蔗具體選自桂糖35(抗褐銹病)和科5(感褐銹病)的雜種后代中的Fl單株。在本發明的一個實施例中，所述待鑒定甘蔗具體選自桂糖35和科5的雜種后代中的Fl單株。
[0007]具體為:
包括如下步驟:分別以待鑒定甘蔗和“P0J2878”的基因組DNA為模板，PCR擴增體系:2XPremix Ex TaqMix PCR Buffer 12.5yL，lOymol/L引物I和引物2各0.5yL，25 ng/yL模板DNA 2yL，加滅菌雙蒸水使總體積為25yL;擴增程序如下:94 °C 5 min ；94 °C 30 S，56 °C30 S，72 °C 40 S，34個循環;72 °C 7 min。
[0008]將擴增的PCR產物利用限制性核酸內切酶HaeIII進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，按照如下方法確定待鑒定甘蔗對褐銹病的抗性:如果待鑒定甘蔗的酶切產物電泳條帶有與P0J2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為抗褐銹病甘蔗，如果待鑒定甘蔗的酶切產物電泳條帶沒有與P0J2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為非抗褐銹病甘蔗。酶切產物經過膠回收及測序，該抗性片段大小為389 bp，其余條帶為非特異性擴增。
[0009]所述引物I為:29-5’ -TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3 ’ ；所述引物2為:417-5 ’ -CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。
[0010]本發明具有以下優點:
本發明的引物對是與Brul基因位點緊密連鎖的標記，是基于PCR和酶切技術產生的共顯性標記，因而可靠且使用方便，與以往的抗褐銹病標記相比，具有與目標基因Brul緊密連鎖、準確性高、檢測效率高、成本低廉等優點。
[0011]1.緊密連鎖:實驗證明，利用本方法對甘蔗育種材料輔助鑒定的結果與抗性鑒定結果完全一致，表明該方法用于甘蔗抗褐銹病育種的分子標記輔助選擇。
[0012]2.準確性高:與以往的抗褐銹病標記相比，該檢測方法克服假陽性高、穩定性差等問題。
[0013]3.成本低廉:本研究使用限制性內切酶HaeIII屬于廉價的四堿基內切酶，而其他方法使用是昂貴的六堿基核酸內切酶RsaI。
[0014]本發明通過對甘蔗抗褐銹病基因的定位，開發與其緊密連鎖的分子標記方法，該方法可用于抗病基因的圖位克隆和分子標記輔助選擇，通過檢測抗褐銹病基因位點來預測甘蔗對褐銹病的抗性，可以在甘蔗的實生苗階段進行淘汰選擇，不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率，進而加速甘蔗抗褐銹病育種進程。
【附圖說明】
[0015]圖1PCR擴增后直接進行電泳分析結果。M: Marker, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.分別代表甘蔗樣品編號為甘蔗品種P0J2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05-136，粵甘35號，崖城05-179和割手密福建89-1-1，云南合慶割手密，云南83-215，貴州78-2-04。
[0016]圖2PCR產物利用RsaI酶切后進行電泳分析結果。M: Marker, 1,2,3,4,5,6,7,8,9，10.分別代表甘鹿樣品編號為甘鹿品種P0J2878，云鹿91-510，云鹿03-194，柳城05-136，粵甘35號，崖城05-179和割手密福建89-1-1，云南合慶割手密，云南83-215，貴州78-2-04。
[0017]圖3PCR產物利用HaeIII酶切后進行電泳分析結果。M: Marker, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.分別代表甘蔗樣品編號為甘蔗品種P0J2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05-136，粵甘35號，崖城05-179和割手密福建89-1-1，云南合慶割手密，云南83-215，貴州78-2-04ο
[0018]圖424個Fl單株經過PCR擴增后利用HaeIII酶切的電泳結果。其中1-24是桂糖35(抗褐銹病)和科5 (感褐銹病)的雜交后代。
【具體實施方式】
[0019]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0020]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0021]實施例中所有的甘蔗和割手密材料均從云南省農科院(國家甘蔗種質資源圃資源)提供。
[0022]實施例1利用RBS引物對上述10種不同甘蔗品種進行PCR擴增，分別通過不同核酸內切酶比較，驗證本發明方法的準確性和特異性。
[0023]提取甘蔗的核酸DNA，利用RBS標記引物進行PCR擴增，采用EppendorfMastercycler EP PCR熱循環儀5333型基因擴增儀。25 yL PCR反應體系組成:10XPCRBuffer(Mg2+) 2.5 yL，dNTP(2.5 mmol/L)2 yL，引物I和引物2(10 ymol/L)各0.5 pL,ExTaq酶(5UAiL)0.125 yL，模板DNA(25 ng/yL)2 yL，加滅菌雙蒸水使總體積為25 yLJCR擴增條件:94 0C 5 min;94 °C 30 S，56 °C 30 S，72 °C 40 S，34個循環;最后72 °C延伸7 min后4 °(:保存備用。反應結束后將所得PCR產物用于1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余部分PCR產物進行酶切驗證。
[0024]酶切體系:取RBS的PCR 產物 10 yL、10XM 緩沖液2.5 yL、HaeIII (10 000 U)1.0 yL、加ddH20 6.5 yL補足25 yL進行酶切，酶切反應程序為37°C 2 h、65°C 10 min,酶切結束取酶切反應產物10 yL，&1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證。
[0025]所述引物I 為:29-5 ’ -TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3 ’ ；所述引物2為:417-5 ’ -CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。
[0026]電泳結果表明:從圖1所示結果表明，利用RBS引物對上述10種甘蔗材料進行PCR擴增，所有材料都得到擴增，沒有假陰性結果出現，表明本研究所驗證的PCR反應體系完全正常，符合檢測要求。圖2和圖3分別為PCR產物利用RsaI酶與HaeIII酶酶切后進行電泳比較分析，從圖2和圖3中可以看出，泳道1、泳道2、泳道3、泳道4分別在191 bp和389 bp的位置出現目標條帶，且圖3所示HaeIII酶酶切產物亮度顯著高于RsaI酶產物亮度，結果表明上述4種甘蔗品種均為抗褐銹病材料，且本研究建立的HaeIII酶酶切體系優于RsaI酶酶切體系。但是從圖2的泳道8、泳道9、泳道10的191 bp的位置也出現了目標條帶，但是經過測序分析，發現該條帶并非目標條帶，為假陽性條帶。但是通過圖3可以得出，PCR產物利用HaeIII酶切后發現目標位置沒有出現陽性條帶，說明本研究建立的甘蔗抗褐銹病檢測方法克服了以前的酶切鑒定中存在假陽性問題，具有很高的特異性。
[0027]實施例2利用RBS引物對桂糖35(抗褐銹病)和科5(感褐銹病)的雜種后代中的Fl單株進行驗證
分別提取24種雜交群體Fl單株DNA樣品，按照傳統的核酸提取方法CTAB法，以純化后的基因組DNA作為模板，利用上述引物對進行PCR擴增，采用Eppendorf Mastercycler EPPCR熱循環儀5333型基因擴增儀。25yL PCR反應體系組成:1XPCR Buffer(Mg2+) 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 yL，正反向引物(10 ymol/L)各0.5 yL，ExTaq酶(5U/yL)0.125 yL,模板DNA(25 ng/yL)2 yL，加滅菌雙蒸水使總體積為25 yl^PCR擴增條件:94 °C 5 min；94°C 30 S，56 °C 30 S，72 °C 40 S，34個循環;最后72 °C延伸7 min后4 °(:保存備用。反應結束后將所得PCR產物用于1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余部分進行酶切驗證。酶切體系:取9020-F4 標記PCR 產物 10 yL、10 XM緩沖液2.5 yL、HaeIII (10 000 U)1.0 yL、加ddH206.5 yL補足25 yL進行酶切，酶切反應程序為37°C 2 h、65°C 10 min，酶切結束取酶切反應產物1 yL，&1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0028]所述引物I 為:29-5 ’ -TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3 ’ ；所述引物2為:417-5 ’ -CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。
[0029]申請人采用本方法檢測雜交后代Fl的24個單株DNA樣品，結果發現該方法檢測結果穩定可靠、條帶亮度高、檢測準確性極高，沒有出現假陽性結果。
[0030]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種用于鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的引物，其特征在于:所述引物序列為弓I 物 l:29-5’-TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3’ ；弓I 物 2:417-5’-CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。2.—種利用權利要求1所述的引物用于鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的分子標記方法，其特征在于:包括如下步驟:分別以待鑒定甘蔗和“P0J2878”的基因組DNA為模板，PCR 擴增體系:2 XPremix Ex TaqMix PCR Buffer 12.5yL，lOymol/L引物I和引物2各0.5μL，25 ng/yL模板DNA 2yL，加滅菌雙蒸水使總體積為25yL;擴增程序如下:94 °C 5 min ；940C 30 S，56 0C 30 S，72 °C 40 5，34個循環;721: 7 min。3.根據權利要求2所述的一種鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的分子標記方法，其特征在于:將擴增的PCR產物利用限制性核酸內切酶HaeIII進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，確定待鑒定甘蔗對褐銹病的抗性:如果待鑒定甘蔗的酶切產物電泳條帶有與P0J2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為抗褐銹病甘蔗，如果待鑒定甘蔗的酶切產物電泳條帶沒有與P0J2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為非抗褐銹病甘蔗，酶切產物經過膠回收及測序，該抗性片段大小為389 bp，其余條帶為非特異性擴增。
【專利摘要】本發明提供了一種鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的分子標記方法，分別以待鑒定甘蔗和“POJ2878”的基因組DNA為模板，利用引物1和引物2進行擴增，將擴增的PCR產物利用限制性核酸內切酶HaeIII進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，與抗褐銹病甘蔗品種POJ2878的酶切產物進行比較，來判斷所待鑒定甘蔗的抗病性。本發明方法可用于甘蔗抗褐銹病基因的圖位克隆和分子標記輔助選擇，通過檢測抗褐銹病基因位點來預測待鑒定甘蔗對褐銹病的抗性，不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率，進而加速甘蔗抗褐銹病育種進程。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105713989
【申請號】CN201610271692
【發明人】郭晉隆, 盧運海, 許莉萍, 王恒波, 闕友雄, 劉迪, 肖乃衍, 陳平華
【申請人】福建農林大學