本發明屬于生物技術領域，涉及藥品和生物制品(包括基因工程制品)中熱原的檢測，具體一種用于檢測熱原的細胞模型的構建方法及細胞模型及檢測熱原的方法及試劑盒。

背景技術：

1.1熱原概述

眾所周知，在臨床治療中使用注射類藥物或醫療器材時往往導致患者出現發冷、寒戰、惡心、發熱、嘔吐、頭痛、白細胞下降、血管通透性增強、昏迷、休克等不良反應而加重病情，不僅增加了患者的痛苦，影響搶救和治療的效果，甚至可能危及病人生命。1875年，Burdon-Sanderson(李增宏，王瑞東.佛山科學技術學院學報,2007,25(3):43-45)研究表明，在腐敗的肉中分離出不帶活菌的物質，其能引起上述一系列不良反應的，稱其為熱原(Pyrogen)，并將上述一系列癥狀定義為熱原反應。此后，隨著科學研究的深入發展，熱原也有了更為確切的定義，指由微生物產生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質。1923年，Seibert肯定了熱原由微生物所產生，具有耐熱性、不揮發性、水溶性、濾過性和吸附性的特點，不易被截留，熱穩定性強，雖然經過嚴格滅菌，但仍不能排除熱原反應的發生。熱原可分為外源性熱原與內源性熱原兩類，外源性熱原主要革蘭氏陰性菌的內毒素和革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸，內源性熱原主要包括機體內細胞因子(如TNF-α，INF-β，IL-1，生長因子)，及激素(如類固醇、前列腺素)等。而通常我們通常所指的“熱原”，主要指細菌性熱原，它是某些細菌的代謝產物、細菌尸體及內毒素。其中致熱能力最強的是革蘭陰性G^-桿菌桿菌的產物，其次是革蘭陽性G⁺桿菌類，革蘭陽性G⁺球菌則較弱，霉菌、酵母菌甚至病毒也能產生熱原(Charles A,Dinarello.Endotoxin Research,2004,10:201)。

細菌內毒素(Endotoxin)屬于外源性熱原，是革蘭氏陰性G^-菌細胞壁外壁層上的特有結構，是磷脂、脂多糖(Lipopolysaceharide,LPS)與蛋白質結合而成的復合物。LPS是復合物的主要成分及活性中心，致熱作用最強，但其化學組成因菌種不同而有所差異，分子量為5×10⁴～5×10⁵，分子量越大致熱作用則越強。細菌內毒素不是細菌本身或細菌的代謝產物，而是細菌死亡或解體后才 釋放出來的一種具有生物活性的毒性物質，并且不能用普通滅菌方法清除，是迄今發現生物活性最為廣泛的物質之一(劉宣亞.明膠科學與技術,2013,33(1):45-48)。當細菌內毒素通過消化系統進入人體時，并不產生危害，但細菌內毒素通過注射等方式進入血液時，則會引起不同的疾病，最為典型的是熱原反應。進入人機體的細菌內毒素不僅可直接對細胞生物膜產生毒性，而且可通過單核巨噬細胞介導的免疫炎癥反應，誘導多種細胞因子及炎癥因子合成和釋放，過度表達的炎癥遞質以自分泌、旁分泌或內分泌方式作用于單核-巨噬細胞膜上的受體，進一步激活炎癥遞質的表達(Guha M,Mackman N.Cell Signal,2001,13(2):85-94.)。這些炎癥因子的失控性釋放影響細胞功能的完整性，造成機體代謝紊亂，血液凝固性升高，組織血液灌注不足，嚴重時造成多器官功能衰竭而死亡(Hotchkiss RS,Karl IE.N Engl J Med,2003,348(2):138-150.)。隨著藥品與醫療管理部門對臨床熱原反應的重視程度日益加強，由于革蘭氏陰性菌的分布范圍極為廣泛，故對藥品及醫療器械中致熱原的檢測也成為了人們近期研究的焦點。

1.2現有主要熱原檢測方法及其局限性

對于熱原的檢測，目前我國藥典收錄的方法有家兔熱原試驗法和鱟試劑內毒素檢測法，第七版歐洲藥典(2011版)還收錄了熱原檢查的第三種新方法--單核細胞激活檢查法。

家兔熱原試驗法。由于家兔對熱原的反應與人基本相似，家兔法為各國藥典規定的檢查熱原的法定方法。將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規定時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規定。

家兔法仍然存在著許多局限性。首先，家兔法不能定量，無法標準化，靈敏性和重復性差，而且家兔對熱原的敏感性存在著個體差異，不同個體對熱原的敏感性相差10倍以上。其次，某些類型的藥品會干擾檢測結果，如一些解熱鎮痛藥、細胞毒性藥物或一些容易影響體溫中樞的藥品，不能夠使用家兔法。另外，許多已經通過家兔熱原檢測的制品在臨床上仍然會發生熱原反應。在細胞工程技術、新生物材料以及中藥制品發展迅猛、日新月異的今天，家兔法已不能完全代表人體的發熱反應，其操作繁瑣費時，不能用于注射劑生產過程中的質量監控，且有些藥物不適用。

鱟試劑內毒素檢測法。美洲鱟血液遇革蘭氏陰性菌時會產生凝膠，美國、英國、歐洲、日本和中國藥典目前均收載了這一檢查法。鱟試劑內毒素檢測法 系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。細菌內毒素的量用內毒素單位(EU)表示。鱟試劑法檢查內毒素的靈敏度為0.015EU/mL，比家兔法靈敏，操作簡單易行，試驗費用低，結果迅速可靠，適用于注射劑生產過程中的熱原控制和家兔法不能檢測的某些細胞毒性藥物制劑。

但鱟試劑法受環境因素影響較大，容易出現假陽性結果。且對于本身帶有顏色的制劑無法進行檢測。鱟試劑法實際能夠檢測到的僅僅是內毒素對鱟血細胞的凝集活性，而不是內毒素對人體的發熱活性或化學概念上的含量，而且無法檢測除內毒素以外的其他致熱源。該方法對一些酶抑制劑、鈣鎂離子鰲合劑也無法檢測，因此鱟試驗還無法完全取代家兔熱原試驗。我國制作鱟試劑的中華鱟是一種比恐龍還早的物種，近年由于填海造地，漁業活動，中華鱟面臨滅絕的危險。故根據實驗動物學的"3Rs原則"即減少(Reduction)、優化(Refinement)和替代(Replacement)，對鱟試劑替代方法的研究迫在眉睫。

單核細胞激活檢查法。除了家兔法和鱟試劑法，第七版歐洲藥典(2011版)已收錄了熱原檢查的第三種新方法--單核細胞激活檢查法(monocyte activation test，MAT)。其原理是將人的全血與供試品一同孵育培養，根據血液中單核細胞釋放出的IL-6、IL-1β、TNF-α等細胞因子的量來評價供試品中熱原的活性。MAT可以檢測出熱原和促炎癥因子污染物，包括革蘭氏陰性細菌的內毒素及非內毒素來源的污染物，包括來自于革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、病毒、真菌的病原相關分子模式(PAMPs)和制品相關的以及加工工藝相關的生物或者化學實體。而單核細胞激活檢查法也存在一定的局限性，不同來源的人血分離出的單核細胞反應性可能不太一樣，另外新鮮的人血不易大批量獲得。所以這個方法除了不容易普及外還具有穩定性差的缺陷。

由此可見應用新的基因工程制備的體外熱原檢測方法代替傳統方法是該領域發展的國際大趨勢。對于熱原檢測的研究，正向著細胞和分子水平層面發展。我國對于這方面的研究尚處于初級階段，還沒有用于熱原檢測的細胞模型收錄入藥典。但可以預見的是應用細胞模型檢測熱原已經成為研究者的主要關注焦點，方法的簡易性與高效性成為研究的必然趨勢。

1.3熱原相關受體及信號通路

近年來，對革蘭氏陰性菌G-菌引起內毒素反應的的機制已有更為深入的了解，同時也認識到LPS在激活機體免疫反應應答及導致熱原反應過程中起主導用。LPS在多種病原體存在某些高度保守的病原結構，這些保守的病原結構形 式被稱作病原相關分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMP)。Toll樣家族受體作為先天性免疫系統中的重要組成部分，其作用被認為與結構識別受體(Pattern-recognition receptors,PRRs)相似，主要通過識別病原微生物表面的PAMP來啟動免疫反應，進而清除外來抗原。

在LPS所致的炎癥信號傳導通路中，有以下四種起關鍵作用的受體：脂多糖結合蛋白(Lipopolysaccharide binding protein,LBP)、Toll樣受體4(Toll like receptor-4,TLR4)、髓樣分化蛋白2(Myeloid differentiation protein-2,MD2)及白細胞分化抗原14(Monocyte differentiation antigen 14,CD14)。

LBP是一種廣泛存在于人和動物血清中的糖蛋白，嚴格來說，LPS結合蛋白并不是LPS的結合受體，但LPS介導細胞激活需要血漿或細胞表面能夠和LPS結合的蛋白參與，是LPS發揮生物學作用的重要載體。它對于細菌內毒素及LPS中的類脂A具有很高的親和力。LBP與LPS結合，形成復合物并LPS傳遞給細胞膜上的CD14受體，結合TLR4-MD2復合物，通過一系列跨膜、胞內信號轉導過程使靶細胞活化并釋放炎癥前細胞因子和免疫調節因子。

TLR4屬于TLRs家族(Toll like receptors)成員，目前，人類相繼發現了10種TLRs家族的蛋白，分別命名為TLR1-10(Lemaitre B,Nicolas E,Miehaut L et a1.Cell,1996,86(6):973-983；HuangB.Zhao J.Unkeless J C et a1.Oneogene，2008,27(2)：218-224；劉興，馮文莉，康格非.國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊,2001,22(3):134-136；T Kawai,S Akira.Cell Death and Differentiation,2006,13:816-825)。不同的TLRs轉導信號由不同來源的微生物所刺激。所以不同TLR可以在一定程度上識別并區分入侵機體的病原體類型。在TLRs家族成員中，目前研究得最多的為TLR4、TLR2在機體先天免疫中的作用，其中又以TLR4在LPS信號轉導中的機制研究的最為廣泛深入(秦玉新，張慶柱.中國藥理學通報,2003,19(12):1336-1339；Li-Yun Huang,James L.DuMontelle,et al.Clinlcal Microbiology,2009,47:3427-3434)。TLR4是炎癥反應中最重要的一類模式識別受體，能夠特異性識別微生物進化過程中的一些保守序列(如LPS)。TLR4是LPS誘導細胞信號轉導的最主要受體，主要表達在參與宿主防御功能的細胞上，如外周血白細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核巨噬細胞、肥大細胞、朗罕氏細胞、樹突狀細胞等，其中以在骨髓單核細胞中表達最多(Medzhitov R,Preston Hurlburt P,Janeway Jr.CA.Nature,1997,388:394-79)。

MD2是一種分泌蛋白，利用表達TLR4和MD2的轉染子做免疫沉淀實驗證實，MD2伴隨TLR4表達，并分泌至細胞表面，通過物理作用于TLR4錨定 在細胞膜上。MD2有助于TLR4識別LPS，并將LPS鎖定在TLR4上的結合位點，對TLR4的向胞膜轉移和表達起到至關重要的作用；研究發現缺乏了MD2分子，TLR4對LPS的反應性極低(Miyake K，R.Shimazu,J.Kondo,et al.Immunol.1998,161:1348-1353；Pugin J,Stem Voeffray S,Daubeuf B.Blood.2004,104(13):4071-4079；劉亞偉，劉靖華，唐靖，等.南方醫科大學學報,2006,26(8):1101-1105；鐘田雨，劉靖華，姜勇.生物化學與生物物理進展,2007,34(5):460-464)。

CD14是一種在胞漿和白細胞表面作為葡萄糖磷脂酞肌醇連接蛋白表達的蛋白質，與LPS具有較高的親和力，但CD14分子缺乏胞漿區段，不能直接向細胞內傳導LPS信號。LPS與CD14結合后，首先形成LPS-LBP-CD14配體和輔助因子復合物，然后再與TLR4結合，將信號傳遞進入細胞(Saitoh S,Akashi S,Yamada T,et al.Endotoxin Res,2004,10(4):257-260；Nagai Y,Akashi S,Nagafuku M,et al.Nat Immunol,2002,3(7):667-672；Zielger,Heitbrock HWL and Ulevitch RJ.Immunol Today,1993,14(3):121-125)。

當細菌侵入機體后，LPS由細菌裂解釋放入血，可以與血漿中游離的脂多糖結合蛋白LBP結合形成復合物，與CD14分子結合或直接與TLR4的附屬蛋白即髓樣分化蛋白MD2相結合，形成LPS-MD2/TLR4復合物，在這些分子的輔助下激活TLR4。

1.4CRISPR/CAS9系統的基本原理

CRISPR/Cas9(The Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)and CRISPR Associated(Cas)system)是一種能快速、方便有效地靶向人類基因組任何基因的新方法。CRISPRs是一類廣泛分布于細菌和古菌基因組中的重復結構，指的是成簇的、規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats)，這是細菌的適應性免疫保護機制，是為了對付噬菌體(bacteriophages)病毒而進化出的一種DNA片段。細菌表達Cas9蛋白，同時會轉錄出CRISPR RNA，這種RNA能夠與病毒的基因組互補配對。這種Cas9復合物就可以切割病毒的基因組，使病毒失活。研究表明，CRISPR與一系列相關蛋白、前導序列一起，能為原核生物提供對抗噬菌體等外源基因的獲得性免疫能力。CRISPR-Cas9技術是利用一段與靶序列相同的單導向RNA(sgRNA)來引導Cas9核酸酶對特異靶向DNA進行識別和切割，造成DNA的雙鏈或單鏈斷裂，然后，細胞會利用自身具備的兩種修復機制對斷裂的DNA進行修復，即非同源性末端接合(NHEJ)或同源介導修復(HDR)。

CRISPR/Cas系統的出現為基因工程提供了一個強有力的應用新工具，它將給基因組定向編輯的研究和應用領域帶來突破性的技術革命，特別是在基因功能解析、人類疾病靶向治療等應用中有巨大的潛力和廣闊的前景。更令人鼓舞的是，其操作簡單、實驗周期短、節約成本，有利于在普通實驗室推廣這一技術，因此，CRISPR/Cas系統的廣泛應用將對生物學研究產生深遠的影響。利用CRISPR/Cas系統對基因組進行定點編輯，將有助于人們更好地了解基因的功能。

內毒素是革蘭陰性菌引起熱原反應的主要成分，是嚴重威脅藥品安全的關鍵因素，因此建立一種更合理、更適宜的熱原檢測方法就顯得尤為迫切。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種用于檢測熱原的細胞模型，該細胞模型可用于藥品生物制品包括基因工程藥品的熱原檢測。

本發明的另一目的在于提供一種上述用于檢測熱原的細胞模型的構建方法。

本發明的第三個目的在于提供一種用于檢測熱原的試劑盒，該試劑盒中含有上述細胞模型。

本發明的第四個目的在于提供一種用于檢測熱原的方法，該方法使用上述試劑盒進行檢測。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明提供一種用于檢測熱原的細胞模型的構建方法，包括如下步驟：

1)將TLR4基因組裝到可表達綠色熒光的表達載體中，構建含有TLR4基因的重組質粒；

2)采用CRISPR/CAS9法將TLR4基因定點敲入細胞系一染色體上的一基因的內含子中，獲得一穩定表達TLR4基因的細胞系；

3)使用兩個不同的2A肽將CD14、MD2和紅色熒光RFP基因結構隔開構建含有CD14基因和MD2基因并可表達紅色熒光的重組質粒；

4)采用CRISPR/CAS9法將CD14基因和MD2基因定點敲入步驟2)所獲得的細胞系的敲入該TLR4基因的染色體以外的另一染色體上的一基因的內含子中，獲得一可穩定表達TLR4基因、CD14基因和MD2基因，并可同時表達綠色熒光和紅色熒光的細胞株，即為所述的細胞模型。

優選地，所述細胞系為HEK293T、HEK293或NIH3T3。

更進一步地，所述步驟2)中敲入TLR4基因的位置為第十九號染色體 PPR1R12C基因第一位內含子。

更進一步地，所述步驟4)中敲入CD14基因和MD2基因的位置為第三號染色體CCR5基因第一位內含子。

本發明還提供一種采用上述的構建方法構建的細胞模型，所述細胞模型是在細胞系HEK 293T的十九號染色體PPR1R12C基因第一位內含子內定點敲入TLR4基因，在三號染色體CCR5基因第一位內含子內定點敲入CD14基因和MD2基因。

其中，所述細胞模型的分類名稱為人源胚胎腎細胞(HEK)變種293T/TLR4/CD14/MD2，保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期：2016年05月19日，保藏編號：CGMCC No.12296。

本發明還提供一種用于檢測熱原的試劑盒，包括如下組成：1)如上述的構建方法構建的細胞模型，或上述的細胞模型，2)熱原標準品，3)IL6和/或TNFα對照品。

優選地，所述熱原標準品為LPS凍干粉，IL6對照品為IL6凍干粉，TNFα對照品為TNFα凍干粉。

本發明進一步提供一種用于檢測熱原的方法，包括如下步驟：

1)制備待測樣品溶液和熱原標準品溶液；

2)將上述待測樣品溶液加入到含有采用上述的構建方法構建的細胞模型，或上述的細胞模型的培養液中37℃培養5h；

3)收集培養后的上清液檢測其中IL-6和/或TNF-α的含量。

優選地：步驟3)所述檢測IL-6和/或TNF-α的含量的方法采用Western Blot、ELISA、金標法或質譜法。

本發明采用CRISPR/CAS9方法在細胞中敲入3個基因，其中有兩個基因定點敲入到一條染色體上，另外一個基因敲入另外一條染色體。敲入的TLR4基因以綠色熒光GFP示蹤；定點敲入的CD14-MD2以紅色熒光RFP示蹤。應用自我剪切2A肽多基因載體構建策略使用兩個不同的2A肽將CD14、MD2和紅色熒光RFP基因結構隔開，避免對蛋白表達產生影響。

在本發明的實施例中使用了F2A和T2A兩種2A肽結構，其中F2A為來源于口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease viruses，FMDV)的2A肽，T2A為來源于蒂勒氏鼠腦脊髓病毒(Theiler’s murine encephalitis virus，TMEV)的2A肽，避免了使用同一2A的基因序列在表達載體構建時出現交叉反應難以克隆進目 的位點。

熱源刺激該模型細胞后，可以通過ELISA、Western Blot、質譜、磁珠法等方法檢測到IL-6和/或TNF-α細胞因子的釋放。

本發明的特點在于：

1.使用CRISPR/CAS9技術定點敲入特定基因

本發明采用定點敲入的方式將外源基因轉入細胞，而非采用病毒、慢病毒等載體形式進行瞬時轉染，使得遺傳穩定。現有CRISPR/CAS9技術一般多應用于基因敲除或基因突變，而對于基因敲入，現有方法中要克服脫靶效應，同源重組效率低，敲入載體構建過程繁瑣等重重困難，尤其進行多個基因的敲入困難就更大。而本發明采用基因敲入，將多基因成功敲入細胞系，如HEK293T細胞，解決了CRISPR/CAS9技術基因敲入困難的問題。

2.將基因敲入不同染色體

本發明將TLR4基因、CD14基因和MD2基因這三個基因定點敲入兩條不同染色體，插入的位置為確保基因敲入后不會影響細胞本身的生理功能，保證細胞的正常存活和穩定傳代的位點。如本發明實施例中TLR4基因插入HEK293T的十九號染色體PPR1R12C基因第一位內含子內，CD14基因和MD2基因插入HEK 293T的三號染色體CCR5基因第一位內含子內，這兩個位置都是可以確保基因敲入后不會影響細胞本身的生理功能，保證細胞的正常存活和穩定傳代。同時，不將三個基因插入到同一染色體是由于插入同一染色體，會由于位阻效應影響表達，同時三個基因的融合蛋白過大，會影響染色體上基因表達。在插入染色體的基因后面加入綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白，可以示蹤蛋白是否表達。在細胞傳代中也可以示蹤蛋白的表達。

3.檢測靈敏度高

本發明構建的細胞模型，屬于工具細胞，在沒有LPS刺激的情況下無IL-6、TNF-α等細胞因子的表達。其他來源的細胞，如人單核細胞，在沒有LPS刺激時會有一定量的IL-6、TNF-α等細胞因子的本底表達，而本底表達會對后續的檢測產生影響，而本細胞模型在沒有LPS刺激時沒有細胞因子的表達，沒有本底的存在。同時，某些基因工程產品可能含有刺激細胞增殖的物質，不同程度的細胞增殖，將對檢測的不確定性造成影響，而本發明的細胞模型不存在這種風險。本發明細胞對于LPS的最低檢測限可達0.005EU/mL，而鱟試劑法的最低檢測限為0.025EU/mL，可以表明本發明的靈敏度遠高于鱟試劑法。

4.解決現有熱原檢測中的不足

鱟是國家二級保護動物，其血液來源有限，使用鱟試劑會影響鱟的保護，不利于生物資源的可持續發展，并且不同廠家生產鱟試劑的方法不同，對同一產品的熱原檢測易產生不一致的結果。單核細胞激活檢查法由于需要使用人血，而不同人血來源的單核細胞反應性不穩定，造成該方法的穩定性差。本發明提供的細胞模型通過將檢測基因插入染色體，使之可以穩定傳代，對熱原檢測重復性好，反應性好，模型穩定，克服了傳統方法和新型人單核細胞激活檢查法的缺點。

本發明的有益效果在于：

本發明提供一種可以用于藥品生物制品包括基因工程藥品的熱原檢測的細胞學模型，其構建方法及熱原檢測方法和試劑盒。該細胞模型利用CRISPR/CAS9誘導基因組特定位置形成雙鍵斷裂，并利用同源重組修復的原理在細胞系的兩個染色體分別定點敲入TLR4及CD14-MD2并以綠色熒光GFP和紅色熒光RFP分別示蹤最終我們成功構建TLR4/CD14/MD2定點敲入熒光示蹤細胞模型，LPS刺激細胞模型可通過ELISA、Western Blot、質譜及磁珠法檢測到IL-6、TNF-a細胞因子的釋放，該細胞模型穩定性好，靈敏性高，最低檢測限可達0.005EU/mL，遠遠低于鱟試劑法的0.025EU/mL。

附圖說明

圖1A為本發明一優選實施例中TLR4與pMD19-T連接的質粒圖譜。

圖1B為本發明一優選實施例中CD14與pMD19-T連接的質粒圖譜。

圖1C為本發明一優選實施例中MD2與pMD19-T連接的質粒圖譜。

圖2A為本發明一優選實施例中TLR4與pCAG-GFP構建的瞬時表達載體pCAG-TLR4-GFP的質粒圖譜。

圖2B為本發明一優選實施例中CD14與pCAG-GFP構建的瞬時表達載體pCAG-CD14-GFP的質粒圖譜。

圖2C為本發明一優選實施例中MD2與pCAG-GFP構建的瞬時表達載體pCAG-MD2-GFP的質粒圖譜。

圖3為本發明一優選實施例中TLR4定點敲入的載體構建策略。

圖4為本發明一優選實施例中TLR4定點敲入細胞的原理示意圖。

圖5A為本發明一優選實施例中TLR4定點敲入細胞后照射白光的照片。

圖5B為本發明一優選實施例中TLR4定點敲入細胞后經激發顯示綠色熒光的照片。

圖6為本發明一優選實施例中MD2-CD14定點敲入的載體構建策略。

圖7為本發明一優選實施例中MD2-CD14定點敲入細胞的原理示意圖。

圖8為本發明一優選實施例中MD2-CD14定點敲入細胞后的熒光檢測圖。

圖9為本發明一優選實施例中四種細胞熒光表達情況。

圖10為本發明一優選實施例中四種細胞通過共聚焦顯微鏡觀察到的表達情況。

圖11A為本發明一優選實施例中四種細胞PCR鑒定敲入TLR4的策略示意圖。

圖11B為圖11A的PCR結果電泳圖。

圖11C為本發明一優選實施例中四種細胞PCR鑒定敲入CD14/MD2的策略示意圖。

圖11D為圖11C的PCR結果電泳圖。

圖12為本發明一優選實施例中四種細胞Western blot檢測蛋白表達情況結果圖。

圖13A為本發明一優選實施例中使用ELISA檢測四種細胞系經LPS刺激細胞后IL-6釋放情況。

圖13B為本發明一優選實施例中使用ELISA檢測四種細胞系經LPS刺激細胞后TNFα釋放情況。

圖14為本發明一優選實施例中使用ELISA檢測293T/TLR4/CD14/MD2細胞系經LPS刺激后IL-6釋放情況與時間的關系圖。

圖15為本發明一優選實施例中使用ELISA檢測不同細胞數293T/TLR4/CD14/MD2經LPS刺激后IL-6釋放量。

圖16為本發明一優選實施例中使用ELISA檢測293T/TLR4/CD14/MD2細胞系經不同量LPS刺激后IL-6釋放敏感性。

圖17A為本發明一優選實施例中使用Western blot法鑒定293T/TLR4/CD14/MD2細胞對LPS刺激的TNF-α的反應性。

圖17B為本發明一優選實施例中使用Western blot法鑒定293T/TLR4/CD14/MD2細胞對LPS刺激的IL-6的反應性。

具體實施方式

下面通過具體實施例進一步說明本發明的技術方案，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。

儀器和材料：

1.限制性內切酶均購自加拿大Fermentas公司。

2.pMD19-T購買自寶生物工程(大連)有限公司(Takara)。

3.pCAG-GFP、pCAG-RFP、pX330、pMCS.DT-A和pAAV-CAG-RFP均購自Addgene公司。

4.人單核細胞分離液試劑盒購自天津灝洋生物制品公司。

5.RPMI1640培養基(無血清)和DMEM培養基(無血清)購自GIBCO公司，胎牛血清購自Hyclone公司。

6.HEK293T細胞購自中國科學院(上海)細胞庫。

7.測序：采用通用或特異引物，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

需要說明的是，本發明中未提供詳細步驟的部分均采用常規分子生物學的方法實現或按照相應試劑說明書實現。

實施例1細胞模型的構建

1.人外周血單核細胞cDNA的制備

1.1人外周血單核細胞的分離和培養

取5mL正常人新鮮抗凝全血，按照人單核細胞分離液試劑盒自帶說明書進行操作，提取人外周血單核細胞，再加入RPMI1640培養基洗滌離心1次，1500r/min離心10min，棄上清。按每毫升血液標本加3～4mL含10％胎牛血清的RPMI1640培養液重新混懸細胞，細胞計數，調整細胞密度達2×10⁷/mL培養于10cm²培養皿中，放置于37℃、5％CO₂細胞培養箱中培養2～3h后去除上清，得到貼壁的人單個核細胞。然后吸取10μL按需要稀釋比例稀釋后的細胞懸液與10μL臺盼藍染液(0.4％)混合，進行活細胞計數，將細胞濃度控制在2×10⁷/mL左右。

1.2人外周血單核細胞cDNA的制備

將步驟1.1制備的人外周血單核細胞的細胞培養液棄去，用PBS溶液沖洗3遍，在六孔板中每孔加入200μL TRIzol Reagent(Gibco BRL)，反復吹打裂解細胞。收獲裂解后的細胞于1.5mL離心管中，室溫放置5min。加入0.1mL氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫放置2～3min。經12,000g，4℃離心15min后，吸出水相轉移至另一1.5mL離心管中。加入250μL異丙醇，混勻，室溫放置10min。4℃，12,000g離心10min沉淀RNA，加入1mL 75％乙醇洗滌沉淀，空氣中干燥5～10min。加入適量不含RNase的DEPC水溶解RNA，55～60℃水浴10min以使RNA充分溶解。用紫外分光光度計測定RNA樣品的濃度(OD₂₆₀)和純度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)，然后將RNA濃度調整至1μg/μL待用。

RNA樣品70℃水浴變性5min后，于冰上放置5min。按照下列反應體系進 行逆轉錄反應，總反應體積為20μL。

表1RT反應體系

混勻，37℃60min，70℃10min滅活，加水至100μL，-20℃儲存待用。

2.TLR4，CD14，MD2基因的載體構建和鑒定

2.1TLR4，CD14，MD2原核表達載體的構建及鑒定

2.1.1TLR4，CD14，MD2基因DNA片段的獲得

利用NCBI檢索得到人類基因組TLR4、MD2和CD14的mRNA序列。使用Primer premier5.0軟件，參照相關文獻設計RT-PCR引物，分別在MD2和CD14上游引物的5’端引入限制性核酸內切酶識別序列EcoRI，在下游引物的5’端引入限制性核酸內切酶識別序列KpnI和及保護堿基，在TLR4上游引物的5’端引入限制性核酸內切酶識別序列KpnI，在下游引物的5’端引入限制性核酸內切酶識別序列SmaI及保護堿基引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。循環數則通過循環曲線圖來確定，以使PCR過程處于指數增長期。其中所使用的酶切位點均為相應基因不含的酶切位點。

表2.PCR引物序列和PCR產物長度

表3.PCR反應體系

表4PCR反應條件

反應后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定產物大小，經鑒定TLR4基因位于2500bp左右，CD14基因位于1100bp左右，MD2基因位于500bp左右，均與預期相符。將TLR4基因、CD14基因和MD2基因分別使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒或回收，于-20℃保存。

2.1.2TLR4，CD14，MD2基因原核表達載體的構建和鑒定

將回收的DNA片段分別連接到pMD19-T克隆載體中，其中TLR4插入到Kpn I和Sma I之間，CD14插入到EcoR I和Kpn I之間，MD2插入到EcoR I和Kpn I之間，獲得三種克隆載體，并轉化到大腸桿菌DH5α中，擴增，提取質粒，酶切，電泳鑒定陽性克隆。

將挑選出的陽性克隆，命名為pMD19-T-TLR4(如圖1A所示)，pMD19-T-CD14(如圖1B所示)、pMD19-T-MD2(如圖1C所示)測序，并從Pubmed基因數據庫中檢索相匹配的基因克隆。

2.2TLR4，CD14，MD2真核表達載體的構建及鑒定

2.2.1TLR4，CD14，MD2真核表達載體的構建及鑒定

將測序正確的pMD19-T-TLR4陽性克隆質粒和pCAG-GFP真核表達載體質粒進行SmaI和KpnI雙酶切反應，酶切片段進行電泳分離，并回收目的片段和載體臂。

將TLR4片段與pCAG-GFP片段進行連接，轉化到大腸桿菌DH5α中，擴增，提取質粒，酶切，電泳鑒定陽性克隆。

將獲得的重組陽性質粒，命名為pCAG-TLR4-GFP(如圖2A所示)，測序，并從Pubmed基因數據庫中檢索相匹配的基因克隆。

MD2，CD14真核表達載體的構建方法基本同于TLR4基因表達載體，將測序正確的pMD19-T-MD2、pMD19-T-CD14陽性克隆質粒和pCAG-GFP真核表達載體質粒應用限制性核酸內切酶EcoRI和KpnI進行雙酶切并連接，轉化后挑 單克隆進行培養，質粒小量提取后再次進行雙酶切鑒定，經瓊脂糖凝膠電泳后觀察，選出目的片段插入且大小正確的陽性克隆，分別命名為pCAG-MD2-GFP(如圖2B所示)，pCAG-CD14-GFP(如圖2C所示)，測序，并在Pubmed基因數據庫中Blast，查看基因克隆是否相匹配。

3.CRISPR/Cas9技術構建TLR4定點敲入細胞模型

3.1敲入靶點的確定

利用NCBI中的Nucleotide數據庫搜索得到人類基因組第十九號染色體PPPR1R12C的基因組DNA序列。人PPP1R12C基因位于19q13.42，GeneID：54776。基因組DNA全長26688bp，第一位外顯子序列為1-378bp，第一位內含子序列為378-4806bp，將PPPR1R12C第一位內含子序列輸入到http://crispr.mit.edu/評估合適的CRISPR敲入靶點，根據上述網站給出的結果得到guideRNA合適靶點。sgRNA位點位于1849bp使用Primer premier5.0生物軟件設計引物擴增1849bp上游1000bp左右，下游1000bp左右的長短臂。

本實施例中選擇第十九號染色體PPPR1R12C的基因組DNA序列的第一內含子位置作為TLR4基因定點敲入部位，有報道證實位置插入的外源基因對于細胞本身的生理功能沒有影響。TLR4基因也可以插入到其他不影響細胞生理功能的染色體位點上，插入到不同基因中，其靶點引物的設計可進行相應調整變化。

3.2CRISPR/Cas 9質粒的設計及構建

3.2.1CRISPR/Cas 9質粒的構建

以pX330質粒為骨架，合成互補的靶點sgRNA序列，并在兩端引入BbsI酶切位點。sgRNA合成序列如表5。

表5PPPR1R12C靶向sgRNA合成序列

Bbs I酶切消化pX330，酶切片段的電泳分離，并回pX330單酶切片段。互補的兩段sgRNA片段退火并磷酸化，將sgRNA連入酶切好的線性化pX330中。連接反應產物轉化入大腸桿菌DH5α，擴增，提取質粒后用BbsI單酶切進行反應，酶切鑒定后經電泳檢查插入片段是否存在，獲得重組陽性質粒，命名為pPsg-Cas9，測序。

3.2.2打靶載體的構建

提取HEK 293T(簡稱293T)基因組DNA，在PPPR1R12C基因sgRNA位點上游、下游各選擇1000bp左右的序列，作為打靶載體的長短臂。用Primer premier5.0設計引物，如表6所示。PCR長臂、短臂、凝膠回收、連入pMD19-T載體，轉化、鑒定、測序，獲得pMD19-T-long arm質粒和pMD19-T-short arm質粒。

表6PPPR1R12C基因長短臂引物及產物長度

將長臂、短臂分別酶切并連入pMCS.DT-A打靶載體，具體方法為：將pMCS.DT-A質粒和測序正確的pMD19-T-long arm質粒進行Sal I和Hind III雙酶切反應，電泳、回收、用T4連接酶連接長臂片段和載體片段，連接反應產物轉化入大腸桿菌DH5α。進行重組質粒的酶切電泳鑒定和測序鑒定，得到DTA-long arm；將測序正確的DTA-long arm質粒和pMD19-T-short arm質粒進行Sal I和Hind III雙酶切反應，電泳、回收、用T4連接酶連接短臂片段和DTA-long arm酶切片段，連接反應產物轉化入大腸桿菌DH5α。進行重組質粒的酶切電泳鑒定和測序鑒定，得到DTA-long arm-short arm，測序。

將測序正確的DTA-long arm-short arm質粒(DONOR)和pCAG-TLR4-GFP質粒按進行Spe I和Not I雙酶切反應，電泳、回收、用T4連接酶連接CAG-GFP-TLR4片段和DTA-long arm-short arm酶切片段，連接反應產物轉化入大腸桿菌DH5α。進行重組質粒的酶切電泳鑒定和測序鑒定，得到DTA-short arm-CAG-TLR4-GFP-long arm打靶載體(TLR4-DONOR)，構建策略如圖3所示，TLR4定點敲入細胞的原理示意圖如圖4所示。

3.2.3電轉打靶載體和CRISPR/Cas9質粒

電轉前24hr，在6孔板中接種293T細胞0.5-1.0×10⁵細胞，至轉染時細胞匯合度達到90-95％；打靶載體DTA-shortarm-CAG-TLR4-GFP-longarm在同源重組臂的短臂5’端用BstBI單酶切線性化；用PBS清洗細胞，胰酶消化，800rpm離心3min收集細胞；用電轉緩沖液(無血清DMEM)重懸293T細胞，調整濃度為1×10⁷/mL。選用4mm的電擊杯，每次電擊細胞300μL，25ng打靶載體，25ng pPsg-Cas質粒。室溫操作，電擊，260v、30ms，后將細胞種與6孔板內， 補加2mL培養液于37℃培養；細胞電轉后48hr，觀察熒光。

3.2.4有限稀釋法挑選綠色熒光單克隆

收集長勢良好的細胞，制成懸液；按細胞計數方法準確計得細胞懸液的細胞數；梯度稀釋法將細胞制成10/mL細胞懸液，即每0.1毫升1個細胞；細胞懸液種于96孔板，每孔0.1毫升；96孔板置于37℃、5％CO₂培養箱，4天后取出觀察，做好記錄并統計結果；選擇單克隆生長孔，生長良好，綠色熒光陽性強者，轉移到24孔板再做克隆經培養或擴大培養，經多次傳代，可穩定表達綠色熒光的細胞克隆，命名為293T/TLR4細胞克隆，從圖5A和圖5B中可以看出，當293T/TLR4用白光照射時不顯示熒光，當用激發光照射時顯出綠色熒光。

4CRISPR/Cas9技術構建CD14-MD2定點敲入細胞模型

4.1構建pCAG-MD2-2A-CD14-2A-RFP質粒

以pAAV-CAG-RFP為模板，PCR擴增RFP片段，并在5’端設計引物時引入F2A序列(如表7所示)，ageI酶切位點，在3’端引入Not I酶切位點。用AgeI和Not I酶消化pCAG-CD14-GFP質粒切掉綠色熒光GFP片段，并連入F2A-RFP片段，引物序列如表8；酶切測序鑒定得到pCAG-CD14-F2A-RFP質粒，瞬時轉染入293T細胞看熒光表達；PCR擴增MD2片段，在3’端T2A序列(如表7所示)引入Age I酶切位點，用Kpn I酶消化pCAG-CD14-F2A-RFP質粒，并用abm必克隆試劑盒使用同源重組的方法連入MD2-T2A片段，引物序列如表8；酶切測序鑒定得到pCAG-MD2-T2A-CD14-F2A-RFP質粒。

表7F2A和T2A的序列

表8F2A-RFP和MD2-T2A引物及產物長度

4.2敲入靶點的確定

利用NCBI中的Nucleotide數據庫搜索得到人類基因組第三號染色體CCR5的基因組DNA序列。將CCR5基因第一位內含子序列輸入到http://crispr.mit.edu/評估合適的CRISPR敲入靶點，根據上述網站給出的結果得到guideRNA合適靶點。

本實施例中選擇第三號染色體CCR5的基因組DNA序列的第一內含子位置作為CD14基因和MD2基因定點敲入部位，有報道證實該位置插入的外源基因對于細胞本身的生理功能沒有影響。CD14基因和MD2基因也可以插入到其他不影響細胞生理功能的染色體位點上，插入到不同基因中，其靶點引物的設計可進行相應調整變化。

4.3CRISPR/Cas 9質粒的設計及構建

4.3.1CRISPR/Cas 9質粒的構建

以pX330質粒為骨架，合成互補的靶點sgRNA序列，并在兩端引入BbsI酶切位點。sgRNA合成序列如表9。

表9CCR5靶向sgRNA合成序列

Bbs I酶切消化pX330，酶切片段的電泳分離，并回pX330單酶切片段。互補的兩段sgRNA片段退火并磷酸化，將sgRNA連入酶切好的線性化pX330中。連接反應產物轉化入大腸桿菌DH5α，擴增，提取質粒后用BbsI單酶切進行反應，酶切鑒定后經電泳檢查插入片段是否存在，獲得重組陽性質粒，命名為pCsg-Cas，測序。

4.3.2CCR5基因打靶載體的構建

在CCR5基因sgRNA位點上游、下游各選擇1000bp左右的序列，作為打靶載體的長短臂。用Primer premier5.0設計引物，如表10所示。PCR長臂、短 臂、凝膠回收、連入pM19-T載體，轉化、鑒定、測序。

表10PCR長短臂序列

將長臂、短臂分別酶切并連入pMCS.DT-A打靶載體，具體方法參照步驟3.2.2，其中在pMCS.DT-A載體Sal I和HindIII中間連入短臂，Sac II和Sac I之間連入長臂，最終得到DTA-long arm-short arm。

然后將pCAG-MD2-T2A-CD14-F2A-RFP質粒酶切并連入DTA-long arm-short arm載體，具體方法參照步驟3.2.2，最終獲得DTA-short arm-CAG-MD2-T2A-CD14-F2A-RFP-long arm打靶載體，構建策略如圖6所示，MD2和CD14定點敲入細胞的原理示意圖如圖7所示。

4.3.3電轉打靶載體和CRISPR/Cas9質粒

參考步驟3.2.3的方法將打靶載體和pCsg-Cas電轉到293T和293T/TLR4中，并用步驟3.2.4的方法篩選單克隆，得到兩種紅色熒光克隆細胞，293T/CD14/MD2細胞和293T/TLR4/CD14/MD2細胞，如圖8所示，可以看出兩個細胞克隆都可以發出紅色熒光。其中293T/CD14/MD2細胞作為對照，293T/TLR4/CD14/MD2細胞為目的細胞系。

5細胞模型鑒定

5.1熒光鑒定和共聚焦顯微鏡鑒定

5.1.1熒光鑒定

將293T，293T/TLR4，293T/CD14/MD2，293T/TLR4/CD14/MD2四種細胞系都傳代3次后照熒光，如圖9所示。結果顯示293T無綠色熒光及紅色熒光表達，293T/TLR4有穩定綠色熒光表達，293T/CD14/MD2有穩定紅色熒光表達，293T/TLR4/CD14/MD2既有穩定綠色熒光，又有穩定紅色熒光表達。

5.1.2共聚焦顯微鏡鑒定

將上述四種細胞系進一步進行共聚焦顯微鏡鑒定，如圖10所示，可以看出293T無綠色熒光及紅色熒光表達，293T/TLR4有穩定綠色熒光表達，293T/CD14/MD2有穩定紅色熒光表達，293T/TLR4/CD14/MD2既有穩定綠色熒光，又有穩定紅色熒光表達。將上述兩圖重合時293T/TLR4/CD14/MD2(Merge 模式)可顯現出綠色熒光和紅色熒光的重合，而293T/TLR4和293T/CD14/MD2在重合時分別顯現綠色熒光和紅色熒光，其結果與熒光鑒定一致。并且可以看出，TLR4的綠光聚集于細胞膜和胞漿，而CD14-MD2紅光聚集于胞漿。

5.2PCR鑒定

對293T，293T/TLR4，293T/CD14/MD2，293T/TLR4/CD14/MD2四種細胞系提取基因組DNA，在基因組不同位點設計引物，看敲入是否正確，引物序列如表11所示。其中，野生型用primer 1+primer2以及primer4+primer5可以擴增出片段，而用primer 1+primer 3，primer 4+primer 6不能擴增片段。TLR4敲入的細胞用primer 1+primer 3可擴增出片段，CD14-MD2敲入的細胞用primer 4+primer 6可擴增出片段。如圖11A至圖11D所示，通過PCR鑒定，293T/TLR4，293T/CD14/MD2，293T/TLR4/CD14/MD2敲入位點正確。

表11PCR鑒定的引物序列

5.3Western blot鑒定蛋白表達情況

對293T，293T/TLR4，293T/CD14/MD2，293T/TLR4/CD14/MD2四種細胞系裂解細胞提取總蛋白。以Actin作為內標Western blot鑒定TLR4、CD14、MD2三種蛋白表達情況。如圖12所示，293T細胞無TLR4、CD14、MD2表達，293T/TLR4有TLR4表達、無CD14、MD2表達，293T/CD14/MD2有TLR4、CD14、MD2表達，293T/TLR4/CD14/MD2有TLR4、CD14、MD2表達。

根據分析，293T/CD14/MD2由于CD14/MD2的存在可能激活了細胞內源性的TLR4使得有少量的有TLR4表達。

實施例2使用細胞模型檢測熱原標志物LPS

1ELISA鑒定細胞對LPS刺激的反應性，檢測IL-6和TNFα的表達

對293T，293T/TLR4，293T/CD14/MD2，293T/TLR4/CD14/MD2四種細胞系用LPS進行刺激，ELISA檢測上清中IL-6和TNFα細胞因子的釋放情況，293T，293T/TLR4對LPS刺激無反應，293T/CD14/MD2，293T/TLR4/CD14/MD2經LPS 刺激后釋放IL-6或TNFα但293T/CD14/MD2釋放的量不如293T/TLR4/CD14/MD2多，如圖13A和圖13B所示。

繼續選用293T/TLR4/CD14/MD2細胞系進行后續試驗。檢測LPS刺激后不同時間點IL-6的釋放情況。發現5～6h左右IL-6釋放達到高峰，如圖14所示。檢測不同細胞數293T/TLR4/CD14/MD2用5EU/mL LPS刺激后6h IL-6釋放量，如圖15所示，可以看出，10⁴的細胞量即可對5EU/mL LPS產生反應釋放IL-6。檢測293T/TLR4/CD14/MD2細胞對LPS刺激的檢測最低限，從圖16可以看出，0.005EU/mL LPS即可刺激293T/TLR4/CD14/MD2細胞釋放IL-6，優于鱟試劑的最低檢測限。

2.Western blot法鑒定293T/TLR4/CD14/MD2細胞對LPS刺激的反應性，檢測IL-6和TNFα的表達

使用高濃度(4EU/mL)，中濃度(1EU/mL)，低濃度(0.5EU/mL)的LPS刺激1×10⁶個293T/TLR4/CD14/MD2細胞，6h后取1mL培養上清，濃縮至200μL，Western blot法鑒定結果表明培養上清中IL-6，TNF-a有釋放，如圖17A和圖17B所示。

3.質譜法鑒定293T/TLR4/CD14/MD2細胞對LPS刺激的反應性，檢測IL-6和TNFα的表達

293T/TLR4/CD14/MD2細胞系LPS刺激5小時后，取1000μL培養液上清，純化后，采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI.TOF-MS)分析、校正，將獲得每個蛋白質點的肽質量指紋，圖譜用Mascot Distiller軟件識別單同位素信號峰，將獲得的肽片段質荷比(m/z)數值導入Mas—cot查詢系統，檢索IPI.HUMAN.v3.53蛋白質數據庫，Mascot分數>61分(P<0.05)判定為陽性。

4.膠體金試紙法(金標法)鑒定293T/TLR4/CD14/MD2細胞對LPS刺激的反應性，檢測IL-6和TNFα的表達

膠體金試紙檢測法是利用納米級的膠體金作為示蹤物和檢測劑，應用抗原抗體反應的檢測方法，檢測時將293T/TLR4/CD14/MD2細胞系LPS刺激5小時后，待測樣品與模型細胞共培養5小時后(與Western Blot，和ELISA法使用的樣品及培養方法相同)，取培養液的上清50μL分別加入IL-6和TNFα的膠體金試紙條(該試紙條為市售或定制)，根據檢測帶的反應判定是否為IL-6和TNFα的表達陽性。

從上述實施例可以看出，本發明提供的細胞模型，對熱原刺激可實現反應，不僅可以檢出革蘭氏陰性細菌的內毒素及非內毒素來源的污染物，包括來自于革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、病毒、真菌的病原相關分子模式(PAMPs) 和制品相關的以及加工工藝相關的生物或者化學實體，并且其最低檢測限低于鱟試劑，其敏感性更強，其穩定性又比利用人全血檢測更高。