本發(fā)明涉及的是豬流行性腹瀉病毒(PEDV)抗體的基因工程制備，具體涉及一種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法。

二、

背景技術(shù)：

抗體是機(jī)體天然的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，毒性低，特異性高，可直接作用于靶點(diǎn)，在疾病治療中廣泛應(yīng)用，成為臨床應(yīng)用的一類重要的生物技術(shù)藥物。截至2010年，美國(guó)FDA已批準(zhǔn)25種抗體用于疾病治療，超過240種抗體應(yīng)用于臨床，治療的疾病包括自身免疫性疾病和炎癥、癌癥、器官移植、心血管疾病、傳染病及眼科疾病等。抗體藥物的臨床成功使用產(chǎn)生了巨大的商業(yè)利潤(rùn)，2007年的銷售額超過270億美元，占20個(gè)最暢銷生物技術(shù)藥物中的8個(gè)，生物醫(yī)藥20%的份額。

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是一種由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的高度傳染性腸道疾病。任何年齡的豬均可感染，對(duì)仔豬影響尤其嚴(yán)重，病死率非常高；對(duì)成年的懷孕母豬來說，感染后繁殖性能受到影響，如懷孕早期的母豬感染后會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)，受孕率降低；育肥豬感染后體重下降。目前，雖然商品化PEDV疫苗，PEDV與豬傳染性胃腸炎(TGEV)的二聯(lián)苗已普遍使用，但該病仍然很流行。2007年，泰國(guó)暴發(fā)了PED，大批的仔豬發(fā)生死亡，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，PEDV作為冠狀病毒的一員，病毒基因組大，突變率高，弱毒疫苗回復(fù)突變的可能性大。亞單位疫苗的研制也沒有從根本上解決PEDV的感染問題，仔豬常常由于母源抗體低、消失或者沒有母乳而失去被動(dòng)免疫；或者仔豬自身注射疫苗產(chǎn)生的抗體來不及起到保護(hù)作用，而傳統(tǒng)的PEDV治療方法又無法滿足人們對(duì)綠色食品需求。因此，研制一種有效防控豬流行性腹瀉的抗體藥物十分必要。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供了一種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法，這種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法用以解決傳統(tǒng)的鼠源PEDV抗體會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)、制備周期長(zhǎng)、抗體中和活性低的問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下：這種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法：選取抗原抗體共表達(dá)的方式，將PEDV抗原基因S1和anti-PEDV ScFv基因共同表達(dá)在大腸桿菌周質(zhì)腔內(nèi)，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行三輪淘選；用大腸桿菌表達(dá)ScFv基因后純化PEDV抗體，用ELISA方法檢測(cè)PEDV ScFv抗體特異性，命名為PEDV-ScFv；具體通過抗PEDV ScFv文庫(kù)的構(gòu)建、抗PEDV抗體的制備兩個(gè)步驟進(jìn)行。

上述方案中抗PEDV ScFv文庫(kù)的構(gòu)建的方法如下：

1. 動(dòng)物免疫及血清抗體效價(jià)的檢測(cè)：

3-6日齡仔豬先以PEDV弱毒疫苗免疫，之后以中等毒力毒株攻毒，前后共3次；每次免疫或攻毒前1天及最后一次免疫1周后采血，間接ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)；96孔酶標(biāo)板包被重組PEDV的S1蛋白，一抗為待測(cè)血清，每板設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各2孔，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG為二抗，TMB顯色，用酶標(biāo)儀讀取各孔OD值；最后一次免疫1周后，選用抗體效價(jià)高的陽(yáng)性血清，加入疊氮鈉至終濃度為0.2%，4 ^oC放置待用；

將抗體效價(jià)較高的三頭仔豬處死，取脾臟，將其置于300目尼龍網(wǎng)上研碎，取細(xì)胞懸液；脾細(xì)胞懸液加ACK lysing buffer，室溫放置5 min，2000 g離心10 min，收集白細(xì)胞沉淀；按10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的量加入Trizol，裂解細(xì)胞，提取總RNA；以提取的三頭豬脾臟的淋巴細(xì)胞混合后的總RNA為模板，Oligo(dT)-18為引物，參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書，進(jìn)行cDNA第一條鏈合成，并用1 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢查其質(zhì)量；

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的豬抗體重鏈VH、輕鏈VL可變區(qū)基因的兩端恒定區(qū)序列，分別利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0分析設(shè)計(jì)引物，并在重鏈上下游分別加入Nhe I、Nde I酶切位點(diǎn)，輕鏈下游分別加入Bam HI、Not I酶切位點(diǎn)；以免疫后豬脾cDNA為模板，分別以VH上游引物、VH下游引物和VL上游引物、VL下游引物進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增；對(duì)VH和VL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，并與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，并隨機(jī)挑取1個(gè)單菌落進(jìn)行測(cè)序，確定獲得的基因序列為豬源抗體。

2. ScFv細(xì)菌展示抗體庫(kù)的構(gòu)建：

以免疫后豬脾cDNA為模板，以VH上游引物、VH下游引物擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因，其中VH的5’端引入NheI酶切位點(diǎn)，3’引入NdeI酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化；取VH PCR純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，并隨機(jī)挑取1個(gè)單菌落進(jìn)行測(cè)序；進(jìn)行Nhe I、Nde I雙酶切，37^oC水浴3h，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化構(gòu)建VH抗體庫(kù)；次日，收集所有菌落并提取質(zhì)粒，進(jìn)行Bam HI、Not I雙酶切鑒定；然后用BamH I、Not I對(duì)VL PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切；酶切后進(jìn)行膠回收，連接并轉(zhuǎn)化DH5α，涂布平板，37^oC過夜培養(yǎng)，收集菌落并提取質(zhì)粒，即為PEDV-ScFv抗體庫(kù)；

取構(gòu)建的PEDV-ScFv抗體庫(kù)進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，分別用Nhe I、Nde I和Bam HI、Not I對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行雙酶切；取PEDV-ScFv抗體庫(kù)質(zhì)粒為模板，分別使用VH和VL的上下游引物對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定。

上述方案中抗PEDV抗體的制備方法如下：

1. 流式細(xì)胞術(shù)篩選大腸桿菌pBSD-PEDV ScFv展示文庫(kù)：

取上述收集的文庫(kù)所有菌落用LB液體培養(yǎng)基稀釋至OD₆₀₀≈0.2，37 ^oC培養(yǎng)2h，使之OD₆₀₀≈0.4，加入IPTG至終濃度為2.5 mmol/L，誘導(dǎo)4 h。在1.5 ml Eppendorf管中加入1.5 ml培養(yǎng)物，6000 rpm離心3 min，去掉上清；

菌體沉淀用350μl Sucrose /Tris solution重懸，Sucrose 的濃度為0.75mmol/L，Tris的濃度為0.1mol/L；加入35 μl濃度為10 mg/ml新鮮配制的溶菌酶母液；逐滴加入700 μl 1 mmol/L EDTA溶液，同時(shí)渦旋混勻；冰上孵育15 min；加入50 μl 0.5mol/L MgCl₂溶液，并在冰上孵育10 min；4 ^oC，10000 rpm離心10 min；原生質(zhì)球沉淀用1 ml PBS溶液重懸洗滌，6000 rpm離心3 min，去上清；原生質(zhì)球沉淀用100 μl PBS重懸；

在100 μl PBS重懸的已誘導(dǎo)菌液中加入10 μl 質(zhì)量體積比為1% BSA貯存液、1.5 μg FITC標(biāo)記后的S1，冰上避光孵育1 h；8000 rpm，離心3 min，1 ml PBS重懸洗滌一次，沉淀用100 μl PBS重懸。設(shè)置陰性對(duì)照，將空白菌DH5α處理成為原生質(zhì)球，空白菌DH5α 中不含pBSD-IBDV ScFv重組質(zhì)粒，用標(biāo)記后的VP2抗原孵育；

用流式細(xì)胞儀于488 nm波長(zhǎng)激光下，檢測(cè)樣品及陰性對(duì)照的熒光強(qiáng)度，收集樣品中熒光強(qiáng)度高于陰性對(duì)照的部分；將分選出來的細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒制備，電擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，構(gòu)建次級(jí)篩選庫(kù)，按上述的方法進(jìn)行第二輪篩選，將每個(gè)峰值范圍內(nèi)的細(xì)胞分選出來，制備質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建次級(jí)篩選庫(kù)，按上述的方法進(jìn)行第三輪篩選后，挑取單菌落20個(gè)，擴(kuò)培后逐個(gè)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，選出熒光信號(hào)比陰性對(duì)照強(qiáng)的克隆，進(jìn)行測(cè)序并分析；

2. 抗PEDV ScFv抗體在大腸桿菌中的表達(dá)純化及活性：

將質(zhì)粒測(cè)序后與網(wǎng)上的豬源抗體進(jìn)行序列比對(duì)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0分析設(shè)計(jì)PCR引物P1、P2，選取兩個(gè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、連接入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定后送去測(cè)序；測(cè)序結(jié)果正確后，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連入pET-27b載體，轉(zhuǎn)化入Rosetta中；

挑取含有表達(dá)載體pET-27b-ScFv的Rosetta單菌落，分別接種于含有100 μg/ml Amp⁺的LB液體培養(yǎng)基中，37 ^oC過夜培養(yǎng)；次日取上述過夜培養(yǎng)物以1%的比例分別接種于含100 μg/ml Amp⁺的LB液體培養(yǎng)基中，37 ^oC振蕩培養(yǎng)2h，加IPTG 37 ^oC繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)4h。取1ml培養(yǎng)物菌體；洗滌后加入預(yù)冷PBS重懸；加入5×SDS樣品緩沖液，煮沸5 min；取20μl樣品進(jìn)行SDS-PAGE；電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色，用甲醇-冰乙酸脫色液脫色，觀察結(jié)果；

挑取轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET-27b-ScFv單個(gè)菌落接種于含有100 μg/ml Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；取上述兩種過夜培養(yǎng)物以1%的比例接種于1L含有100 μg/ml Amp⁺的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ^oC振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀值達(dá)到0.3時(shí)，加IPTG至終濃度0.25 mmol/L，37 ^oC繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h；取出培養(yǎng)物于4 ^oC以12000 r/min離心5 min，收集菌體；棄上清，每20 ml菌液沉淀加入1ml Binding buffer重懸菌體，加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，在冰上高強(qiáng)度超聲破碎約40 min，每次10s，每次間隔10s；菌體經(jīng)超聲波破碎后12000 rpm 4 ^oC離心30 min，分別收集包涵體；洗滌后分別用變性液溶解4 ^oC過夜；將溶解后蛋白加入到10倍體積的復(fù)性液中，4 ^oC復(fù)性24 h，pH調(diào)至7.4左右；在經(jīng)pH 7.4的PBS 于4 ^oC透析3次，每次8 h；純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度；將抗原蛋白以濃度梯度包被96孔板，于4 ^oC包被過夜。PBST洗96孔板3次，每次2 min，用5%脫脂奶粉37 ^oC封閉2h，分別加封閉液稀釋的濃度梯度為100 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL陰性對(duì)照不加抗體的S1蛋白，37 ^oC孵育2 h，PBST洗96孔板3次，再加入二抗HRP-goat anti-porcine IgG，37 ^oC溫育1 h，PBS洗96孔板4次后，加入TMB底物液，于37 ^oC避光顯色5 min，每孔加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm下檢測(cè)其OD值。

上述方案中S1擴(kuò)增的引物：

上游引物5’- GGTCTCTAGGTGTTACTTTGCCATCATTTAA-3’（SEQ ID NO:1）

下游引物5’- ATGGATCCTTAAACGTCCGTGACACCTTCAA-3’（SEQ ID NO:2）。

上述方案中Binding buffer的組成為：8 mol/L Urea，0.1 mol/LNaH₂PO₄，0.01 mol/L Tris,，Binding buffer的 pH 8.0。

上述方案中變性液的組成為：8 mol/L尿素、0.1 mol/L Na₂HPO₄, 0.01 mol/L Tris-HCL, pH 8.0。

上述方案中復(fù)性液配方為還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽至終濃度為2 mmol/L和0.2 mmol/L、精氨酸鹽酸鹽至終濃度0.5 mol/L、甘油至終濃度10%、Tris至終濃度0.4 mol/L，復(fù)性液pH調(diào)至7.4左右。

上述方案中終止液為2 mol/L的H₂SO₄。

有益效果：

1、本發(fā)明提供的豬源PEDV抗體不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)、針對(duì)性強(qiáng)、更容易篩選到中和活性高的抗體、制備周期短、速度快。

2、本發(fā)明以大腸桿菌展示的方式，通過流式細(xì)胞術(shù)三輪的篩選，得到了anti-PEDV的豬源抗體，具有中和PEDV能力，可作為PEDV的臨床治療性抗體。

3、本發(fā)明提供的PEDV抗體為豬源抗體，在對(duì)仔豬腹瀉治療過程中可避免由鼠源抗體引起的豬抗鼠抗體產(chǎn)生。

4、本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單易行，適合擴(kuò)大中試生產(chǎn)，市場(chǎng)前景廣闊。

四、附圖說明

圖1是本發(fā)明中流式細(xì)胞術(shù)分選抗PEDV單鏈抗體的空白對(duì)照；

圖2是本發(fā)明中流式細(xì)胞術(shù)第一輪分選抗PEDV的單鏈抗體；

圖3是本發(fā)明中流式細(xì)胞術(shù)第二輪分選抗PEDV的單鏈抗體；

圖4是本發(fā)明中流式細(xì)胞術(shù)第三輪分選抗PEDV的單鏈抗體；

圖5是本發(fā)明中PEDV抗體的表達(dá)與純化；

圖6是本發(fā)明中PEDV抗體的親和性分析。

五、具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明：

這種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法：選取抗原抗體共表達(dá)的方式，將PEDV抗原基因S1和anti-PEDV ScFv基因共同表達(dá)在大腸桿菌周質(zhì)腔內(nèi)，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行三輪淘選。用大腸桿菌表達(dá)ScFv基因后純化PEDV抗體，用ELISA方法檢測(cè)PEDV ScFv抗體特異性，命名為PEDV-ScFv。

上述PEDV抗體的具體制備方法：

一、抗PEDV ScFv文庫(kù)的構(gòu)建

1. 動(dòng)物免疫及血清抗體效價(jià)的檢測(cè)

3-6日齡仔豬先以PEDV弱毒疫苗免疫，之后以中等毒力毒株攻毒，前后共3次。每次免疫或攻毒前1天及最后一次免疫1周后采血，間接ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)。96孔酶標(biāo)板包被重組PEDV的S1蛋白，一抗為待測(cè)血清，每板設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各2孔，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG為二抗，TMB顯色，用酶標(biāo)儀讀取各孔OD值。最后一次免疫1周后，選用抗體效價(jià)高的陽(yáng)性血清，加入疊氮鈉至終濃度為0.2%，4 ^oC放置待用。將抗體效價(jià)較高的三頭仔豬處死，取脾臟，將其置于300目尼龍網(wǎng)上研碎，取細(xì)胞懸液。脾細(xì)胞懸液加ACK lysing buffer，室溫放置5 min，2000 g離心10 min，收集白細(xì)胞沉淀。按10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的量加入Trizol，裂解細(xì)胞，提取總RNA。以提取的三頭豬脾臟的淋巴細(xì)胞混合后的總RNA為模板，Oligo(dT)-18為引物，參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書，進(jìn)行cDNA第一條鏈合成，并用1 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢查其質(zhì)量。根據(jù)GenBank上已發(fā)表的豬抗體重鏈(VH)、輕鏈(VL)可變區(qū)基因的兩端恒定區(qū)序列，分別利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0分析設(shè)計(jì)引物，并在重鏈上下游分別加入Nhe I、Nde I酶切位點(diǎn)，輕鏈下游分別加入Bam HI、Not I酶切位點(diǎn)。以免疫后豬脾cDNA為模板，分別以VH上游引物、VH下游引物和VL上游引物、VL下游引物進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增。對(duì)VH和VL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，并與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，并隨機(jī)挑取1個(gè)單菌落進(jìn)行測(cè)序，確定獲得的基因序列為豬源抗體。

S1擴(kuò)增的引物：

上游引物5’- GGTCTCTAGGTGTTACTTTGCCATCATTTAA-3’（SEQ ID NO:1）

下游引物5’- ATGGATCCTTAAACGTCCGTGACACCTTCAA-3’（SEQ ID NO:2）

2. ScFv細(xì)菌展示抗體庫(kù)的構(gòu)建

以豬脾cDNA為模板，以VH上游引物、VH下游引物擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因，其中VH的5’端引入NheI酶切位點(diǎn)，3’引入NdeI酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化。取VH PCR純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，并隨機(jī)挑取1個(gè)單菌落進(jìn)行測(cè)序。進(jìn)行Nhe I、Nde I雙酶切，37^oC水浴3 h，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化構(gòu)建VH抗體庫(kù)。次日，收集所有菌落并提取質(zhì)粒，進(jìn)行Bam HI、Not I雙酶切鑒定。然后用BamH I、Not I對(duì)VL PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系同上。酶切后進(jìn)行膠回收，連接并轉(zhuǎn)化DH5α，涂布平板，37^oC過夜培養(yǎng)，收集菌落并提取質(zhì)粒，即為PEDV-ScFv抗體庫(kù)。取構(gòu)建的PEDV-ScFv抗體庫(kù)進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，分別用Nhe I、Nde I和Bam HI、Not I對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行雙酶切。取PEDV-ScFv抗體庫(kù)質(zhì)粒為模板，分別使用VH和VL的上下游引物對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定。

PEDV抗體的ScFV基因序列如序列表中的序列3表示。

二、抗PEDV抗體的制備

1. 流式細(xì)胞術(shù)篩選大腸桿菌(pBSD-PEDV ScFv)展示文庫(kù)

取上述收集的文庫(kù)所有菌落用LB液體培養(yǎng)基稀釋至OD₆₀₀≈0.2，37 ^oC培養(yǎng)2h，使之OD₆₀₀≈0.4，加入IPTG至終濃度為2.5 mmol/L，誘導(dǎo)4 h。在1.5 ml Eppendorf管中加入1.5 ml培養(yǎng)物，6000 rpm離心3 min，去掉上清。菌體沉淀用350 μl Sucrose (0.75mmol/L)/Tris (0.1mol/L) solution重懸；加入35 μl濃度為10 mg/ml新鮮配制的溶菌酶母液；逐滴加入700 μl 1 mmol/L EDTA溶液，同時(shí)渦旋混勻；冰上孵育15 min；加入50 μl 0.5mol/L MgCl₂溶液，并在冰上孵育10 min；4 ^oC，10000 rpm離心10 min；原生質(zhì)球沉淀用1 ml PBS溶液重懸洗滌，6000 rpm離心3 min，去上清；原生質(zhì)球沉淀用100 μl PBS重懸。在100 μl PBS重懸的菌液(已誘導(dǎo))中加入10 μl 1% (質(zhì)量體積比) BSA貯存液、1.5 μg FITC標(biāo)記后的S1，冰上避光孵育1 h；8000 rpm，離心3 min，1 ml PBS重懸洗滌一次，沉淀用100 μl PBS重懸。設(shè)置陰性對(duì)照，將空白菌DH5α (不含pBSD-IBDV ScFv重組質(zhì)粒)處理成為原生質(zhì)球，用標(biāo)記后的VP2抗原孵育。用流式細(xì)胞儀于488 nm波長(zhǎng)激光下，檢測(cè)樣品及陰性對(duì)照的熒光強(qiáng)度，收集樣品中熒光強(qiáng)度高于陰性對(duì)照的部分。將分選出來的細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒制備，電擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，構(gòu)建次級(jí)篩選庫(kù)，按上述的方法進(jìn)行第二輪篩選，將每個(gè)峰值范圍內(nèi)的細(xì)胞分選出來，制備質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建次級(jí)篩選庫(kù)，按上述的方法進(jìn)行第三輪篩選后，挑取單菌落20個(gè)，擴(kuò)培后逐個(gè)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，選出熒光信號(hào)比陰性對(duì)照強(qiáng)的克隆，進(jìn)行測(cè)序并分析。

2. 抗PEDV ScFv抗體在大腸桿菌中的表達(dá)純化及活性

將質(zhì)粒測(cè)序后與網(wǎng)上的豬源抗體進(jìn)行序列比對(duì)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0分析設(shè)計(jì)PCR引物P1、P2，選取兩個(gè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、連接入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定后送去測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確后，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連入pET-27b載體，轉(zhuǎn)化入Rosetta中。挑取含有表達(dá)載體pET-27b-ScFv的Rosetta單菌落，分別接種于含有100 μg/ml Amp⁺的LB液體培養(yǎng)基中，37 ^oC過夜培養(yǎng)。次日取上述過夜培養(yǎng)物以1%的比例分別接種于含100 μg/ml Amp⁺的LB液體培養(yǎng)基中，37 ^oC振蕩培養(yǎng)2 h，加IPTG 37 ^oC繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)4 h。取1 ml培養(yǎng)物菌體。洗滌后加入預(yù)冷PBS重懸。加入5×SDS樣品緩沖液(含DTT)，煮沸5 min。取20 μl樣品進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色，用甲醇-冰乙酸脫色液脫色，觀察結(jié)果。挑取轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET-27b-ScFv單個(gè)菌落接種于含有100 μg/ml Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。取上述兩種過夜培養(yǎng)物以1%的比例接種于1 L含有100 μg/ml Amp⁺的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ^oC振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀值達(dá)到0.3時(shí)，加IPTG至終濃度0.25 mmol/L，37 ^oC繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)物于4 ^oC以12000 r/min離心5 min，收集菌體。棄上清，每20 ml菌液沉淀加入1 ml Binding buffer (8 mol/L Urea, 0.1 mol/LNaH₂PO₄, 0.01 mol/L Tris, pH 8.0)重懸菌體，加入溶菌酶至終濃度1 mg/ml，在冰上高強(qiáng)度超聲破碎約40 min，每次10 s，每次間隔10 s。菌體經(jīng)超聲波破碎后12000 rpm 4 ^oC離心30 min，分別收集包涵體。洗滌后分別用變性液(8 mol/L尿素、0.1 mol/L Na₂HPO₄, 0.01 mol/L Tris-HCL, pH 8.0)溶解4 ^oC過夜。將溶解后蛋白加入到10倍體積的復(fù)性液中，4 ^oC復(fù)性24 h，復(fù)性液配方為還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽至終濃度為2 mmol/L和0.2 mmol/L、精氨酸鹽酸鹽至終濃度0.5 mol/L、甘油至終濃度10%、Tris至終濃度0.4 mol/L，pH調(diào)至7.4左右。在經(jīng)PBS (pH 7.4) 4 ^oC透析3次，每次8 h。純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。將抗原蛋白以濃度梯度包被96孔板，于4 ^oC包被過夜。PBST洗96孔板3次，每次2 min，用5%脫脂奶粉37 ^oC封閉2 h，分別加封閉液稀釋的濃度梯度為100 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL的S1蛋白(陰性對(duì)照不加抗體)，37 ^oC孵育2 h，PBST洗96孔板3次，再加入二抗HRP-goat anti-porcine IgG (H+L) (陽(yáng)性對(duì)照孔加HRP-goat anti-mouse antibody購(gòu)自R&D公司)，37 ^oC溫育1 h，PBS洗96孔板4次后，加入TMB底物液，于37 ^oC避光顯色5 min，每孔加入50 μL終止液(2 mol/L的H₂SO₄)，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm下檢測(cè)其OD值。

實(shí)施例1：

首先選用中等毒力的毒株對(duì)仔豬進(jìn)行攻毒，檢測(cè)仔豬的抗體效價(jià)，之后對(duì)提取的仔豬脾臟的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建抗體庫(kù)。在制備抗原之前，對(duì)PEDV S基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其糖基化位點(diǎn)較多，表達(dá)難度大，產(chǎn)量低，因而后期實(shí)驗(yàn)選取了抗原抗體共表達(dá)的方式，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了ScFv抗體庫(kù)三輪篩選。然后提取質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增后、克隆到T載體上，送上海生工測(cè)序。采用Primer5.0和DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析，將質(zhì)粒測(cè)序后與網(wǎng)上的豬源抗體進(jìn)行序列比對(duì)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0分析設(shè)計(jì)PCR引物P1、P2，選取兩個(gè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、連接入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定后送去測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確后，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，之后連入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入Rosetta中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。取1 ml培養(yǎng)物菌體，洗滌后加入預(yù)冷PBS重懸，加入SDS樣品緩沖液(含DTT)，煮沸。取20 μl樣品進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色，用甲醇-冰乙酸脫色液脫色，可以看到ScFv在大腸桿菌中表達(dá)。挑取轉(zhuǎn)化陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-27b-ScFv單個(gè)菌落接種于含有Amp⁺的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過連續(xù)培養(yǎng)過夜，加IPTG誘導(dǎo)，離心收集菌體。加入溶菌酶，在冰上高強(qiáng)度超聲破碎。菌體經(jīng)超聲波破碎后離心，分別收集包涵體。洗滌后進(jìn)行變性和復(fù)性，獲得純化的蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，用ELISA檢測(cè)抗PEDV ScFv，證實(shí)PEDV ScFv具有特意中和病毒的能力。

序列表1

<110> 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)

<120> 一種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法

<160> 3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGTCTCTAGGTGTTACTTTGCCATCATTTAA 31

序列表2

<110> 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)

<120> 一種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法

<160> 3

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ATGGATCCTTAAACGTCCGTGACACCTTCAA 31

序列表3

<110> 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)

<120> 一種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法

<160> 3

<210> 3

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

1 GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTG

55 AGACTCTCCTGTGTCGGCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGCAATGAGCTGG

109 GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTCGCATCTATTTATAGTAGT

163 GGTTGTAGCACCTACTACACAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACGTTCTCCATC

217 CACGACTCCCAGAACAAGGTGTATCTGCAAATCAACAGCCTCAGAACCGAAGAT

271 ACGGCCCGGTATTACTGTGCGATAGGCCCAGCGGTTGCTATAGCGGTTACTGTG

325 CAAGAGGCCGAATTCGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGC

379 GGATCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCACTC

433 GAGGCCATCGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTCTAGGAGAC

487 ACGGTCTCCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTAGGAGTTATTTAGCCTGG

541 TATCAACAACAACCAGGGAAGGCTCCGAAACTCGTGATCTATGCTACATCCAAT

595 TTAGAAAGTGGGGTCCCATCCCGCTTCAAGGGCAGTGGATCTGGCACCGATTTC

649 ACCCTCACCATCAGTGGCCTGCAGGCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTTTG

703 CAGTGGAGCGGTGTATATGGTTTCGGCGCGGGGACCAAACTGGAGCTCAAA

序列表1

<110> 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)

<120> 一種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法

<160> 3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GGTCTCTAGGTGTTACTTTGCCATCATTTAA 31

序列表2

<110> 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)

<120> 一種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法

<160> 3

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ATGGATCCTTAAACGTCCGTGACACCTTCAA 31

序列表3

<110> 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)

<120> 一種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法

<160> 3

<210> 3

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

1 GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTG

55 AGACTCTCCTGTGTCGGCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGCAATGAGCTGG

109 GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTCGCATCTATTTATAGTAGT

163 GGTTGTAGCACCTACTACACAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACGTTCTCCATC

217 CACGACTCCCAGAACAAGGTGTATCTGCAAATCAACAGCCTCAGAACCGAAGAT

271 ACGGCCCGGTATTACTGTGCGATAGGCCCAGCGGTTGCTATAGCGGTTACTGTG

325 CAAGAGGCCGAATTCGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGC

379 GGATCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCACTC

433 GAGGCCATCGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTCTAGGAGAC

487 ACGGTCTCCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTGTTAGGAGTTATTTAGCCTGG

541 TATCAACAACAACCAGGGAAGGCTCCGAAACTCGTGATCTATGCTACATCCAAT

595 TTAGAAAGTGGGGTCCCATCCCGCTTCAAGGGCAGTGGATCTGGCACCGATTTC

649 ACCCTCACCATCAGTGGCCTGCAGGCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTTTG

703 CAGTGGAGCGGTGTATATGGTTTCGGCGCGGGGACCAAACTGGAGCTCAAA