一種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法與流程

文檔序號：11803408閱讀：來源：國知局

技術特征：

1.一種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法，其特征在于：這種重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法：選取抗原抗體共表達的方式，將PEDV抗原基因S1和anti-PEDV ScFv基因共同表達在大腸桿菌周質腔內，利用流式細胞術進行三輪淘選；用大腸桿菌表達ScFv基因后純化PEDV抗體，用ELISA方法檢測PEDV ScFv抗體特異性，命名為PEDV-ScFv；具體通過抗PEDV ScFv文庫的構建、抗PEDV抗體的制備兩個步驟進行。

2.根據權利要求1所述的重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法，其特征在于：所述的抗PEDV ScFv文庫的構建的方法如下：

一、動物免疫及血清抗體效價的檢測：

3-6日齡仔豬先以PEDV弱毒疫苗免疫，之后以中等毒力毒株攻毒，前后共3次；每次免疫或攻毒前1天及最后一次免疫1周后采血，間接ELISA檢測血清抗體效價；96孔酶標板包被重組PEDV的S1蛋白，一抗為待測血清，每板設空白對照、陰性對照和陽性對照各2孔，辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG為二抗，TMB顯色，用酶標儀讀取各孔OD值；最后一次免疫1周后，選用抗體效價高的陽性血清，加入疊氮鈉至終濃度為0.2%，4 ^oC放置待用；

將抗體效價較高的三頭仔豬處死，取脾臟，將其置于300目尼龍網上研碎，取細胞懸液；脾細胞懸液加ACK lysing buffer，室溫放置5 min，2000 g離心10 min，收集白細胞沉淀；按10⁶個細胞/ml的量加入Trizol，裂解細胞，提取總RNA；以提取的三頭豬脾臟的淋巴細胞混合后的總RNA為模板，Oligo(dT)-18為引物，參照M-MLV反轉錄酶說明書，進行cDNA第一條鏈合成，并用1 μl反轉錄產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢查其質量；

根據GenBank上已發表的豬抗體重鏈VH、輕鏈VL可變區基因的兩端恒定區序列，分別利用引物設計軟件Primer 5.0分析設計引物，并在重鏈上下游分別加入Nhe I、Nde I酶切位點，輕鏈下游分別加入Bam HI、Not I酶切位點；以免疫后豬脾cDNA為模板，分別以VH上游引物、VH下游引物和VL上游引物、VL下游引物進行梯度PCR擴增；對VH和VL擴增產物進行膠回收，并與pMD18-T載體連接，轉化DH5α，并隨機挑取1個單菌落進行測序，確定獲得的基因序列為豬源抗體；

二、ScFv細菌展示抗體庫的構建：

以免疫后豬脾cDNA為模板，以VH上游引物、VH下游引物擴增重鏈可變區基因，其中VH的5’端引入NheI酶切位點，3’引入NdeI酶切位點，PCR產物利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化；取VH PCR純化產物與pMD18-T載體連接，轉化DH5α，并隨機挑取1個單菌落進行測序；進行Nhe I、Nde I雙酶切，37^oC水浴3h，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并進行轉化構建VH抗體庫；次日，收集所有菌落并提取質粒，進行Bam HI、Not I雙酶切鑒定；然后用BamH I、Not I對VL PCR回收產物進行雙酶切；酶切后進行膠回收，連接并轉化DH5α，涂布平板，37^oC過夜培養，收集菌落并提取質粒，即為PEDV-ScFv抗體庫；

取構建的PEDV-ScFv抗體庫進行酶切鑒定和PCR鑒定，分別用Nhe I、Nde I和Bam HI、Not I對抗體庫進行雙酶切；取PEDV-ScFv抗體庫質粒為模板，分別使用VH和VL的上下游引物對其進行PCR鑒定。

3.根據權利要求2所述的重組豬流行性腹瀉病毒抗體的制備方法，其特征在于：所述的抗PEDV抗體的制備方法如下：

一、流式細胞術篩選大腸桿菌pBSD-PEDV ScFv展示文庫：

取上述收集的文庫所有菌落用LB液體培養基稀釋至OD₆₀₀≈0.2，37 ^oC培養2h，使之OD₆₀₀≈0.4，加入IPTG至終濃度為2.5 mmol/L，誘導4 h；在1.5 ml Eppendorf管中加入1.5 ml培養物，6000 rpm離心3 min，去掉上清；

菌體沉淀用350μl Sucrose /Tris solution重懸，Sucrose 的濃度為0.75mmol/L，Tris的濃度為0.1mol/L；加入35 μl濃度為10 mg/ml新鮮配制的溶菌酶母液；逐滴加入700 μl 1 mmol/L EDTA溶液，同時渦旋混勻；冰上孵育15 min；加入50 μl 0.5mol/L MgCl₂溶液，并在冰上孵育10 min；4 ^oC，10000 rpm離心10 min；原生質球沉淀用1 ml PBS溶液重懸洗滌，6000 rpm離心3 min，去上清；原生質球沉淀用100 μl PBS重懸；

在100 μl PBS重懸的已誘導菌液中加入10 μl 質量體積比為1% BSA貯存液、1.5 μg FITC標記后的S1，冰上避光孵育1 h；8000 rpm，離心3 min，1 ml PBS重懸洗滌一次，沉淀用100 μl PBS重懸；設置陰性對照，將空白菌DH5α處理成為原生質球，空白菌DH5α 中不含pBSD-IBDV ScFv重組質粒，用標記后的VP2抗原孵育；

用流式細胞儀于488 nm波長激光下，檢測樣品及陰性對照的熒光強度，收集樣品中熒光強度高于陰性對照的部分；將分選出來的細菌進行質粒制備，電擊轉化至大腸桿菌DH5α，構建次級篩選庫，按上述的方法進行第二輪篩選，將每個峰值范圍內的細胞分選出來，制備質粒后轉化大腸桿菌DH5α，構建次級篩選庫，按上述的方法進行第三輪篩選后，挑取單菌落20個，擴培后逐個用流式細胞儀進行檢測，選出熒光信號比陰性對照強的克隆，進行測序并分析；

二、抗PEDV ScFv抗體在大腸桿菌中的表達純化及活性：

將質粒測序后與網上的豬源抗體進行序列比對，利用引物設計軟件Primer Premier 5.0分析設計PCR引物P1、P2，選取兩個進行PCR擴增、純化、連接入pMD18-T載體，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆，接種于LB液體培養基中過夜培養，提取質粒，PCR和酶切鑒定后送去測序；測序結果正確后，對質粒進行雙酶切，連入pET-27b載體，轉化入Rosetta中；

挑取含有表達載體pET-27b-ScFv的Rosetta單菌落，分別接種于含有100 μg/ml Amp⁺的LB液體培養基中，37 ^oC過夜培養；次日取上述過夜培養物以1%的比例分別接種于含100 μg/ml Amp⁺的LB液體培養基中，37 ^oC振蕩培養2h，加IPTG 37 ^oC繼續培養，誘導4h；取1ml培養物菌體；洗滌后加入預冷PBS重懸；加入5×SDS樣品緩沖液，煮沸5 min；取20μl樣品進行SDS-PAGE；電泳后，經考馬斯亮藍R-250染色，用甲醇-冰乙酸脫色液脫色，觀察結果；

挑取轉化重組質粒pET-27b-ScFv單個菌落接種于含有100 μg/ml Amp+的LB液體培養基中，培養過夜；取上述兩種過夜培養物以1%的比例接種于1L含有100 μg/ml Amp⁺的新鮮LB液體培養基中，37 ^oC振蕩培養至OD₆₀₀值達到0.3時，加IPTG至終濃度0.25 mmol/L，37 ^oC繼續誘導培養4 h；取出培養物于4 ^oC以12000 r/min離心5 min，收集菌體；棄上清，每20 ml菌液沉淀加入1ml Binding buffer重懸菌體，加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，在冰上高強度超聲破碎約40 min，每次10s，每次間隔10s；菌體經超聲波破碎后12000 rpm 4 ^oC離心30 min，分別收集包涵體；洗滌后分別用變性液溶解4 ^oC過夜；將溶解后蛋白加入到10倍體積的復性液中，4 ^oC復性24 h，pH調至7.4左右；在經pH 7.4的PBS 于4 ^oC透析3次，每次8 h；純化后的蛋白進行SDS-PAGE，并用紫外分光光度計檢測其濃度；將抗原蛋白以濃度梯度包被96孔板，于4 ^oC包被過夜；PBST洗96孔板3次，每次2 min，用5%脫脂奶粉37 ^oC封閉2h，分別加封閉液稀釋的濃度梯度為100 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL陰性對照不加抗體的S1蛋白，37 ^oC孵育2 h，PBST洗96孔板3次，再加入二抗HRP-goat anti-porcine IgG (H+L)，37 ^oC溫育1 h，PBS洗96孔板4次后，加入TMB底物液，于37 ^oC避光顯色5 min，每孔加入50 μL終止液，用酶標儀于波長450 nm下檢測其OD值。