本發明涉及藥物化學領域，具體涉及一種水飛薊賓23-取代衍生物及其注射劑的制備方法和抗腫瘤的用途。

背景技術：

惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的重大疾病之一。腫瘤的防治已成為世界范圍內廣泛重視的課題，抗腫瘤藥物的研制與開發也具有極其迫切的需要。各種腫瘤的發病率和死亡率持續攀升，腫瘤的治療面臨著極大的挑戰(CA-Cancer.J.Clin.2016,66,115-132)。居高不下的腫瘤發病率和死亡率，也為腫瘤治療藥物提供了廣闊的市場空間，2014年全球的抗腫瘤藥物市場規模已經達到了600億美元。

植物是新的生物活性分子的寶貴來源，從植物來源中尋找新的具有抗腫瘤活性的藥物越來越受到醫藥工作者的重視。從植物中已分離出許多抗癌藥物，如長春新堿、表鬼臼毒素葡萄糖苷和紫杉醇等。相對于人工合成的化學藥物，這些天然來源的有效成分以其毒性較低的優點在腫瘤治療中得到了大量的應用。

水飛薊賓(Silybin，SLB)是從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取所得的一種黃酮木脂素類化合物，呈黃色粉末，味苦。

現有技術中僅報道水飛薊賓具有明顯的抗自由基活性、促進肝細胞的再生和修復以及保護、穩定肝細胞膜等作用，被稱為“天然的保肝藥”。臨床上用于慢性遷延性肝炎、慢性活動性肝炎，初期肝硬化、肝中毒等病的治療。少有報道水飛薊賓這類黃酮木脂素類化合物對腫瘤具有抑制作用。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一種全新的具有抗腫瘤作用的水飛薊賓衍生物。

令人驚奇的是，對水飛薊賓進行修飾進行酯化反應，得到的水飛薊賓衍生物具有非常好的抗腫瘤作用，特別是對胃癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌和膀胱癌有非常好的效果。

本發明的一個目的是提供具有式(1)所示結構的水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)及其藥學上可接受的鹽：

其中，R為氫、鈉、鉀、鎂，式(1)中2,3位和10,11位的立體構型分別是或同時是R構型或S構型。

本發明的另一個目的為提供一種根據權利要求1所述的式(1)所示結構的水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)及其藥學上可接受的鹽的制備方法，其特征在于：水飛薊賓在催化劑存在下，與1,2-苯二甲酸酐反應，分別得到式(1)所示結構的水飛薊賓23-取代衍生物和水飛薊賓3,23-取代衍生物，經分離后，得到R為氫的式(1)化合物；根據需要，與適當的堿反應生成藥學上可接受的鹽。

優選地，催化劑為N,N-二異丙基乙胺或三乙胺。

優選地，水飛薊賓與1,2-苯二甲酸酐的摩爾比為1:1至1:3。

本發明的另一個目的為提供一種組合物，包括權利要求1中的具有式(1)所示結構的水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)及其藥學上可接受的鹽、抗氧化劑、金屬離子螯合劑和pH調節劑。

優選地，抗氧化劑為無水亞硫酸鈉。

優選地，金屬離子螯合劑為依地酸二鈉。

優選地，pH調節劑為氫氧化鈉。

優選地，該組合物劑型為注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、包合物、固體分散體、緩控釋劑型，優選為注射劑。

優選地，該注射劑pH值在4.0～9.0之間，優選6.8～7.0之間。

優選地，該注射劑由如下質量配比原輔料組成：

所述的pH調節劑適量是指將上述式(1)所示結構的水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)及其藥學上可接受的鹽、無水亞硫酸鈉和依地酸二鈉溶于注射用水待完全溶解后，調節溶液pH值至4.0～9.0之間時所需要的pH調節劑的用量。

進一步地，每天給予用者1次。

進一步地，每天給予用者50mg或100mg。

進一步地，給藥方式為靜脈滴注。

本發明的另一個目的為提供一種所述的組合物的制備方法，其特征在于：所述組合物的劑型為注射劑，包括以下步驟：

稱取處方量的無水亞硫酸鈉和依地酸鈉，溶于注射用水中。另稱取處方量的式(1)所示結構的水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)及其藥學上可接受的鹽，分次加入攪拌使溶解。待全溶后，加處方量的注射用活性炭攪拌后，冷卻至室溫并定容。減壓過濾除去活性炭至澄清，用氫氧化鈉調節pH，然后用微孔濾膜過濾，灌于2mL安剖中，通氮氣，熔封，滅菌，即得。

優選地，該注射劑滅菌方式為100-130℃流通蒸汽滅菌20–60min。

本發明的另一個目的為提供一種所述組合物的質控方法，其特征在于：所述組合物的劑型為該注射劑，包括如下步驟：

(1)式(1)所示結構的水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)及其藥學上可接受的鹽的鑒別：

稱取樣品適量，加甲醇制成濃度為1mg/mL的溶液，加新配制的1mol/L鹽酸羥胺甲醇液0.5ml、6mol/L氫氧化鉀甲醇液0.2mL，加熱至沸，冷卻后加5％鹽酸酸化，最后加1％三氯化鐵溶液1～2滴，溶液應顯紫紅色。

(2)式(1)所示結構的水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)及其藥學上可接受的鹽的HPLC含量測定：

稱取樣品適量，加甲醇溶解，制成0.12mg/mL的溶液，作為供試品溶液；另取水飛薊賓對照品適量，加甲醇制成0.12mg/mL的溶液作為對照品溶液。

色譜條件ODS C₁₈柱，流動相：甲醇：水：冰醋酸45：55：1，波長：287nm；流速：1.0mL/min；進樣量：5μL。

本發明的另一個目的為提供具有式(1)所示結構的水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)及其藥學上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應用。

優選地，所述腫瘤為胃癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌和膀胱癌。

本發明通過化學修飾的方法，設計并合成出與水飛薊賓結構有所差異的一種全新結構的黃酮木脂素衍生物，即通過在水飛薊賓3，23位連接1,2-苯二甲酸基，經過大量多次實驗并對合成工藝進行優化，分離、純化，并多次重結晶得到高純度化合物，即水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)和水飛薊賓3,23-取代衍生物(SLB-3,23)，之后對兩個化合物進行初步藥效學篩選，結果發現水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)具有非常好的抗腫瘤特性。上述全新結構的目標化合物不僅延長整個分子共軛范圍和共軛強度，而且在疏水性、芳香性、電性等方面與水飛薊賓具有諸多差異化特征，正是由于上述特征的改變，經改造后全新結構的水飛薊賓23-取代衍生物及其鹽的水溶性和生物利用度不僅顯著提高，而且將其制成注射劑后，溶液的穩定性增強，通過藥動學和藥效學實驗測試，發現水飛薊賓23-取代衍生物注射劑在大鼠體內血藥濃度顯著增加，生物利用度明顯提高，且水飛薊賓23-取代衍生物注射劑對抗腫瘤的效果與水飛薊賓相比較，有顯著性差異，藥效學結果表明其在治療腫瘤疾病方面也有著意想不到的治療效果。

本發明的有益之處在于：通過化學修飾的方法，設計并合成出與水飛薊賓結構有所差異的一種全新結構的黃酮木脂素衍生物，目標化合物的水溶性和生物利用度顯著增加，而且目標化合物的注射劑具有明顯的抗腫瘤，對多種腫瘤細胞有顯著的抑制作用；再者，本發明是對天然藥物的結構改造，原料來源方便，污染少，合成路線簡便，成本低，能夠進行大規模生產，具有潛在的社會效益和經濟效益。

附圖說明

圖1為水飛薊賓23-取代衍生物注射劑在大鼠體內的藥-時曲線。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應該理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明的講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

實施例1：水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)和水飛薊賓3,23-取代衍生物(SLB-3,23)的制備：

水飛薊賓4.82g(10mmoL)、1,2-苯二甲酸酐1.48g(10mmoL)、N,N-二異丙基乙胺3.0g(10mmoL)，加入到盛有40mL二氯甲烷的干燥圓底燒瓶中，室溫攪拌反應過夜，G254薄層檢測跟蹤(展開劑為二氯甲烷：甲醇：甲酸＝15：1：0.1)，反應結束后以1M鹽酸洗滌有機層，用二氯甲烷提取3次，有機層用無水硫酸鈉干燥后濃縮，得到淡黃色固體，以甲醇和乙酸乙酯多次重結晶，分別得到水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)5.61g和水飛薊賓3,23-取代衍生物(SLB-3,23)0.56g，收率分別為88.9％和7.20％。

水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)核磁共振氫譜：¹H NMR(500MHz,d₆-DMSO):δ＝11.90(s,1H,Ar-OH),10.85(s,1H,Ar-OH),9.16(s,1H,Ar-OH),8.05(d,1H,J＝5.0Hz,Ar-H),7.91(d,1H,J＝5.5Hz,Ar-H),7.47(m,1H,Ar-H),7.26(m,1H,Ar-H),6.99-7.12(m,5H,Ar-H),6.88(d,1H,J＝5.0Hz,Ar-H),5.95(s,1H,Ar-H),5.90(s,1H,Ar-H),5.01(m,2H,CH,CH),4.81(d,1H,J＝1.5Hz,CH₂),4.67(d,1H,J＝1.5Hz,CH₂),4.55(m,1H,CH),4.48(m,1H,CH),3.90(s,3H,CH₃)；ESI-MS:m/z＝631.5[M+H]⁺.

水飛薊賓3,23-取代衍生物(SLB-3,23)核磁共振氫譜：¹H NMR(500MHz,d₆-DMSO):δ＝9.06(s,1H,Ar-OH),8.16(m,2H,Ar-H),8.05(m,1H,Ar-H),7.92(m,1H,Ar-H),7.78-7.81(m,4H,Ar-H),7.20(d,1H,J＝1.5Hz,Ar-H),6.99-7.01(dd,1H,J＝7.5,1.5Hz,Ar-H),6.95-6.97(d,1H,J＝7.5Hz,Ar-H),6.91-6.93(dd,1H,J＝7.5,1.5Hz,Ar-H),6.89-6.90(d,1H,J＝3.5Hz,Ar-H),6.71-6.72(d,1H,J＝7.5Hz,Ar-H),6.47-6.48(d,1H,J＝2.5Hz,CH),6.35(s,1H,Ar-OH),6.26(d,1H,J＝1.5Hz,Ar-H),6.12(d,J＝1.5Hz,Ar-H),6.02-6.04(d,1H,J＝9Hz,CH),5.87(s,1H,Ar-OH),5.16-5.18(td,1H,J＝5,2.5Hz,CH),4.73-4.76(dd,1H,J＝12.5,5Hz,CH₂),4.45-4.49(dd,1H,J＝12.5,5Hz,CH₂),3.82(s,3H,CH₃)；ESI-MS:m/z＝779.2[M+H]⁺.

實施例2：水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)和水飛薊賓3,23-取代衍生物(SLB-3,23)的制備：

水飛薊賓4.82g(10mmoL)、1,2-苯二甲酸酐2.96g(20mmoL)、N,N-二異丙基乙胺3.0g(10mmoL)，加入到盛有40mL二氯甲烷的干燥圓底燒瓶中，室溫攪拌反應過夜，G254薄層檢測跟蹤(展開劑為二氯甲烷：甲醇：甲酸＝15：1：0.1)，反應結束后以1M鹽酸洗滌有機層，用二氯甲烷提取3次，有機層用無水硫酸鈉干燥后濃縮，得到淡黃色固體，以甲醇和乙酸乙酯多次重結晶，分別得到水飛薊賓23-取代的水飛薊賓衍生物5.76g和水飛薊賓3，23-取代的水飛薊賓衍生物0.61g，收率分別為91.2％和7.84％。

實施例3：水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)和水飛薊賓3,23-取代衍生物(SLB-3,23)的制備：

水飛薊賓4.82g(10mmoL)、1,2-苯二甲酸酐4.44g(30mmoL)、N,N-二異丙基乙胺3.0g(10mmoL)，加入到盛有40mL二氯甲烷的干燥圓底燒瓶中，室溫攪拌反應過夜，G254薄層檢測跟蹤(展開劑為二氯甲烷：甲醇：甲酸＝15：1：0.1)，反應結束后以1M鹽酸洗滌有機層，用二氯甲烷提取3次，有機層用無水硫酸鈉干燥后濃縮，得到淡黃色固體，以甲醇和乙酸乙酯多次重結晶，分別得到水飛薊賓23-取代的水飛薊賓衍生物5.71g和水飛薊賓3，23-取代的水飛薊賓衍生物0.65g，收率分別為90.6％和8.35％。

實施例4：水飛薊賓23-取代衍生物鈉鹽(SLB-23-Na)和水飛薊賓3,23-取代衍生物鈉鹽(SLB-3,23-Na)的制備：

分別取水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)和水飛薊賓3,23-取代衍生物(SLB-3,23)10g溶于50mL乙酸乙酯中，室溫下和氫氧化鈉甲醇溶液進行反應，沉淀析出，過濾，得到不溶于乙酸乙酯的水飛薊賓23-取代衍生物鈉鹽(SLB-23-Na)9.8g和水飛薊賓3,23-取代衍生物鈉鹽(SLB-3,23-Na)9.6g，收率分別為98.2％和93.0％。

實施例5：水飛薊賓23-取代衍生物鉀鹽(SLB-23-K)的制備：

水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)10g，溶于50mL乙酸乙酯中，室溫下和氫氧化鉀的甲醇溶液進行反應，沉淀析出，過濾，得到不溶于乙酸乙酯的水飛薊賓23-取代衍生物鉀鹽(SLB-23-K)9.6g，收率為95.8％。

實施例6：水飛薊賓23-取代衍生物鎂鹽(SLB-23-Mg)的制備：

水飛薊賓23-取代衍生物(SLB-23)10g，溶于50mL乙酸乙酯中，室溫下和氫氧化鉀的甲醇溶液進行反應，沉淀析出，過濾，得到不溶于乙酸乙酯的水飛薊賓23-取代衍生物鎂鹽(SLB-23-Mg)9.8g，收率為97.4％。

實施例7：水飛薊賓23-取代衍生物鈉鹽(SLB-23-Na)注射劑的制備：

無水亞硫酸鈉2.0g，依地酸鈉0.5g，溶于800mL注射用水中。加熱至80℃，取水飛薊賓23-取代衍生物鈉鹽(SLB-23-Na)25.0g，分次加入攪拌使溶解。待全溶后，加2％(w/w)注射用活性炭于80℃攪拌十分鐘，冷卻至室溫并定容至刻度。減壓過濾除去活性炭至澄清，調節pH至6.8～7.0，然后用微孔濾膜過濾，灌于2mL安剖中，通氮氣，熔封，115℃流通蒸汽滅菌30min，即得。

實施例8：水飛薊賓23-取代衍生物鉀鹽(SLB-23-K)注射劑的制備：

無水亞硫酸鈉2.0g，依地酸鈉0.5g，溶于800mL注射用水中。加熱至80℃，取水飛薊賓23-取代衍生物鉀鹽(SLB-23-K)25.0g，分次加入攪拌使溶解。待全溶后，加2％(w/w)注射用活性炭于80℃攪拌十分鐘，冷卻至室溫并定容至刻度。減壓過濾除去活性炭至澄清，調節pH至6.8～7.0，然后用微孔濾膜過濾，灌于2mL安剖中，通氮氣，熔封，115℃流通蒸汽滅菌30分鐘，即得。

實施例9：水飛薊賓23-取代衍生物鎂鹽(SLB-23-Mg)注射劑的制備：

無水亞硫酸鈉2.0g，依地酸鈉0.5g，溶于800mL注射用水中。加熱至80℃，取水飛薊賓23-取代衍生物鎂鹽(SLB-23-Mg)25.0g，分次加入攪拌使溶解。待全溶后，加2％(w/w)注射用活性炭于80℃攪拌十分鐘，冷卻至室溫并定容至刻度。減壓過濾除去活性炭至澄清，調節pH至6.8～7.0，然后用微孔濾膜過濾，灌于2mL安剖中，通氮氣，熔封，115℃流通蒸汽滅菌30分鐘，即得。

實施例10：水飛薊賓23-取代衍生物注射劑與水飛薊賓葡甲胺的穩定性比較：

取實施例7、8、9樣品適量，參照中國藥典2015年版四部穩定性考察項目，我們對所制備的注射劑進行6個月的穩定性考察，結果見表1：

表1實施例7、8、9樣品穩定性考察結果

從以上結果可以看出，本發明制備的水飛薊賓23-取代衍生物注射劑分別在經過6個月的穩定性試驗后，其pH和含量與0月比較，無明顯差異，pH和含量均比較穩定；而水飛薊賓葡甲胺注射液在經過6個月的穩定性試驗考察后，其pH和含量明顯降低，6個月末含量已降至60％，表明水飛薊賓23-取代衍生物注射劑在6個月內穩定，且穩定性優于水飛薊賓葡甲胺注射劑，極具研發前景。

實施例11：水飛薊賓23-取代衍生物注射劑與水飛薊賓葡甲胺有關物質的比較：

色譜條件ODS C₁₈柱，流動相：甲醇：水：冰醋酸45：55：1，波長：287nm；流速：1.0mL/min；稱取樣品適量，加甲醇溶解，制成0.12mg/mL的溶液，作為供試品溶液；另取水飛薊賓對照品適量，加甲醇制成0.12mg/mL的溶液作為對照品溶液。分別取供試品溶液和對照品溶液進樣5μL，記錄色譜圖，按外標法以峰面積進行雜質含量計算。結果見表2。

表2實施例7、8、9樣品穩定性考察結果

試驗表明，本發明制備的水飛薊賓23-取代衍生物注射劑在室溫條件放置6個月后，雜質含量小于0.5％，6個月內無明顯變化，穩定性良好，而水飛薊賓葡甲胺注射劑在室溫6個月后，雜質含量明顯增加，且大于5％，說明本發明制備的水飛薊賓23-取代衍生物注射劑穩定，而且雜質含量小，結果優于水飛薊賓葡甲胺注射劑。

實施例12：水飛薊賓23-取代衍生物抗腫瘤作用研究：

體外分別培養胃癌細胞系MGC803、人結腸癌細胞HCT116、肺癌細胞SPC-A-1、前列腺癌細胞PC-3M以及膀胱癌細胞5637等不同腫瘤細胞，采用不同濃度(0～400μmol/L)的水飛薊賓23-取代衍生物分別處理以上腫瘤細胞后，MTT法檢測水飛薊賓23-取代衍生物對不同腫瘤細胞的增殖作用，并計算水飛薊賓23-取代衍生物對各腫瘤細胞的半數抑制濃度(IC₅₀)，評價水飛薊賓23-取代衍生物抗腫瘤活性，結果見表3。

表3水飛薊賓23-取代衍生物對腫瘤細胞的增殖抑制活性結果

注：與水飛薊賓對照組比較，¹⁾p<0.01；與水飛薊賓葡甲胺組比較，²⁾p<0.01。

實驗結果可以看出，在0～400μmol/L濃度范圍內，水飛薊賓對各腫瘤細胞的IC₅₀值均在100μmol/L左右，水飛薊賓葡甲胺對照組的IC₅₀值均大于50μmol/L，而本發明制備的水飛薊賓23-取代衍生物對各腫瘤細胞的IC₅₀值均小于50μmol/L，尤其是實施例9，其IC₅₀值均在20μmol/L以下，且結果具有顯著性差異(p<0.01)，說明本發明制備的水飛薊賓23-取代衍生物對胃癌細胞MGC803、人結腸癌細胞HCT116、肺癌細胞SPC-A-1、前列腺癌細胞PC-3M以及膀胱癌細胞5637等腫瘤細胞有明顯的抑制作用。

實施例13：水飛薊賓23-取代衍生物與水飛薊賓葡甲胺的藥代動力學比較：

15只SD大鼠隨機分為五組，每組3只，給藥前12hr禁食，將水飛薊賓、水飛薊賓葡甲胺溶液和水飛薊賓23-取代衍生物(按水飛薊賓)以50mg/Kg的劑量分別尾靜脈注射，給藥后0.083，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0和8.0hr采血，測定大鼠體內水飛薊賓的濃度，結果見表4，并繪制藥時曲線，結果見圖1。水飛薊賓葡甲胺溶液和水飛薊賓23-取代衍生物注射劑在大鼠體內的血藥濃度經時變化過程為二房室模型，且血藥濃度有明顯差異，本發明制備的水飛薊賓23-取代衍生物注射劑再大鼠體內的濃度要遠高于水飛薊賓和水飛薊賓葡甲胺，本發明制備的注射劑生物利用度明顯提高，為臨床上的使用提供理論依據。

表4水飛薊賓23-取代衍生物藥代動力學結果(n＝3)

注：與水飛薊賓對照組比較，¹⁾p<0.01；與水飛薊賓葡甲胺組比較，²⁾p<0.01。