本發明屬于基因工程和現代酶工程技術領域，涉及一種灰略紅鏈霉菌耐高溫中性蛋白酶及其編碼基因和應用，具體涉及一種耐高溫中性蛋白酶及其編碼基因序列、含有該編碼基因序列的重組表達載體和轉基因重組菌以及該耐高溫中性蛋白酶的應用。

背景技術：

蛋白酶作為催化蛋白質多肽鏈中的肽腱水解的一類酶，廣泛存在于植物莖葉果實、人和動物內臟及微生物(主要是細菌、真菌和放線菌)。細菌作為微生物蛋白酶的主要來源之一，其合成的蛋白酶具有較強的水解能力，因而在工業生產中具有更加廣泛的應用。目前，產蛋白酶細菌研究最深入的是芽孢桿菌，主要有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus lichniformis)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumillus)等；枯草芽孢桿菌作為一種被美國食品藥物管理局認可的安全菌種(無致病性、環境友好及抗逆性強)，是蛋白酶制劑大規模產業化的主要菌種，其能夠產生酸性、中性及堿性蛋白酶，但以中性及堿性蛋白酶居多。一般而言，真菌合成分泌的蛋白酶種類多于細菌，然而真菌合成分泌的蛋白酶水解能力相對較低，并且穩定性及耐熱性較差，產蛋白酶真菌主要有曲霉屬和毛霉屬，另外還有酵母菌，如嗜熱圓酵母、解脂假絲酵母。

相對而言，產蛋白酶的放線菌種類較少，針對其展開的研究和獲得的成果也較少，產蛋白酶的放線菌主要有灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)、氟氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)以及變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)。經證實，鏈霉菌蛋白酶具有較強的熱穩定性，能夠耐受50℃以上的高溫，且對多種金屬離子及酶活抑制劑有較強的耐受能力。因此，鏈霉菌對于新型蛋白酶的研發具有重要意義。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種耐高溫中性蛋白酶。

本發明的另一目的在于提供一種耐高溫中性蛋白酶的編碼基因。

本發明的另一目的在于提供一種含有上述的耐高溫中性蛋白酶編碼基因的重組表達載體或轉基因重組菌。

本發明的另一目的在于提供一種上述的耐高溫中性蛋白酶編碼基因在表達耐高溫中性蛋白酶中的應用。

本發明的另一目的在于提供一種上述的耐高溫中性蛋白酶在降解蛋白質中的應用。

本發明的目的是通過以下技術方案實現：

一種灰略紅鏈霉菌耐高溫中性蛋白酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2。

本發明提供的耐高溫中性蛋白酶及其編碼基因克隆自灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)，命名為JSD-1，現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2012.01.09，保藏編號為CGMCC No.5706，具有下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

(2)編碼序列表中的SEQ ID NO.2氨基酸序列的多核苷酸。

本發明的一種灰略紅鏈霉菌耐高溫中性蛋白酶編碼基因序列是通過全基因組測序和PCR擴增的方式克隆獲得，所涉及的實驗技術包括鏈霉菌基因組及大腸桿菌質粒DNA的提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠回收、連接、質粒酶切、轉化、蛋白誘導表達及純化、聚丙烯酰胺凝膠電泳及蛋白酶活性的測定等；具體步驟為：以灰略紅鏈霉菌基因組為模板，通過PCR擴增獲得該蛋白酶編碼基因序列，隨后將該基因序列連接到表達載體pET-22b(+)上，并將重組質粒導入到特定的大腸桿菌表達菌株內，進而獲得蛋白酶過表達重組菌株，最終通過IPTG誘導實現蛋白酶的體外高效表達，并收集菌體、破碎菌體，離心后獲得粗酶液，之后進行蛋白純化并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表達情況， 最后，測定該蛋白酶相關的酶學特征。

從灰略紅鏈霉菌得到的耐高溫中性蛋白酶具有以下特征：

1、該耐高溫中性蛋白酶的編碼基因長度為519bp，共編碼172個氨基酸。

2、該耐高溫中性蛋白酶的適合反應溫度為40～65℃，優選為45～60℃。

3、該耐高溫中性蛋白酶的適合反應的pH為5.0～11.0，優選pH為6.0～9.0。

4、該耐高溫中性蛋白酶分別在1mM金屬離子和1mM酶活性抑制劑下，對多種金屬離子(Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺和Fe²⁺)及酶活性抑制劑(EDTA、DTT、SDS和NaN₃)均有較強的耐受能力，Zn²⁺可提高蛋白酶的活性，而EDTA可較大程度抑制該蛋白酶的活性。

上述的耐高溫中性蛋白酶編碼基因的重組表達載體或轉基因重組菌株。所述的重組表達載體為將上述的耐高溫中性蛋白酶編碼基因插入到大腸桿菌表達載體中得到的表達耐高溫中性蛋白酶的重組表達載體，所述的大腸桿菌重組表達載體為pET-22b(+)載體。

所述的轉基因重組菌為將上述的重組表達載體導入到大腸桿菌中，篩選得到表達耐高溫中性蛋白酶的轉基因重組菌，所述的大腸桿菌為Transetta(DE3)。

上述的耐高溫中性蛋白酶編碼基因在表達耐高溫中性蛋白酶中的應用。

上述的耐高溫中性蛋白酶及其編碼基因在降解蛋白質中的應用。

一種表達耐高溫中性蛋白酶的方法，是培養上述的轉基因重組菌得到耐高溫中性蛋白酶。

本發明所述的耐高溫中性蛋白酶在天然的灰略紅鏈霉菌內表達量和酶活性均較低，因此嚴重限制了其使用范圍和效果。本發明利用基因工程技術，構建了該蛋白酶表達工程菌株，大幅度提高了目的蛋白酶的表達量，為該蛋白酶的高效表達與應用奠定了基礎，可用于蛋白質的降解。

與現有技術相比，本發明的有益效果如下：

第一.本發明通過構建外源表達載體，實現了該蛋白酶的體外過表達，并在重組蛋白C端添加聚組氨酸標簽(HIS₆·Tag)的方法，保證蛋白生物學活性的同時也方便后續蛋白的純化；

第二.本發明通過載體信號肽實現了目的蛋白的周質空間表達，保證了蛋白酶的活性和穩定性；

第三.本發明的耐高溫中性蛋白酶的適用反應溫度范圍廣，在35～65℃下都能保持較好的活性，特別是相比現有的蛋白酶，本發明的蛋白酶在較高溫度55℃下，表現出很好的酶活性；同時本發明的蛋白酶的適用pH范圍廣，在pH為5～11下都能保持較好的活性；

第四.本發明的耐高溫中性蛋白酶對多種金屬離子(Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺和Fe²⁺)及酶活性抑制劑(EDTA、DTT、SDS和NaN₃)均有較強的耐受能力，這可降低酶在生產過程中對水和蛋白原料的純度要求，避免了生產過程中的金屬離子對酶活性的影響，提高了實際應用時的穩定性。

附圖說明

圖1為本發明的耐高溫中性蛋白酶的基因序列片段PCR擴增圖；

圖2為本發明的耐高溫中性蛋白酶編碼基因的重組表達載體的酶切片段的示意圖；

圖3為本發明的重組蛋白酶外源表達的驗證圖；

圖4為本發明的耐高溫中性蛋白酶在不同溫度(30～70℃)下蛋白酶活性的示意圖；

圖5為本發明的耐高溫中性蛋白酶在不同pH值(3.0～11.0)溶液下蛋白酶活性的示意圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應該理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不用于限定本發明的保護范圍。在實際應用中本領域技術人員根據本發明做出的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。

1、灰略紅鏈霉菌基因組提取和測序

將灰略紅鏈霉菌孢子懸浮液接種于LB液體培養基中，于37℃、150rpm條件下培養3天，然后收集2.0mL菌液，12000rpm離心2min，并棄上清，收集菌體沉淀，之后加入180μL溶菌酶(20mg/mL)和20μL EDTA溶液(0.5M,pH 8.0)，37℃處理45min，加入4μL RNase A(100mg/mL)，震蕩混勻15s，室溫放置5min，隨后按照細菌DNA提取試劑盒操作說明完成剩余操作，得到高純度基因組DNA，最后通過瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質量，確保無明顯RNA條帶，基因組條帶清晰、完整、無降解、無污染。

采用第二代測序技術，構建不同插入片段長度的文庫，采用Illumina Miseq(2×250bp)平臺進行測序，收集測序的原始數據，對帶接頭、低質量的數據進行過濾，隨后采用Newbler version 2.8對去除接頭的測序數據進行從頭拼接，構建Contigs及Scaffolds，最后使用GapCloser程序進行缺口填補得到鏈霉菌基因組草圖。

2、蛋白編碼基因功能和膜定位預測

采用Glimmer 3.0軟件對全基因組序列進行基因預測，并采用SignalP 4.1分別對蛋白酶氨基酸序列進行信號肽模擬預測；結果表明蛋白酶N端存在明顯的信號肽序列，推測該酶為胞外酶；以下所述的蛋白酶為切除信號肽后的成熟蛋白酶。

3、蛋白酶表達載體構建

根據蛋白酶基因序列，設計含有酶切位點的引物，序列如下：

SG-M-His-Nde I-F：

GGAATTCCATATGCGGGGGTGATGAGGGTGGCGGTG

SG-M-His-EcoR I-F：

GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGGGGCGCG TCGACCAGGGTCC

以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，用含有Nde I和EcoR I酶切位點引物進行PCR擴增，獲得蛋白酶基因序列，如圖1所示，然后連接到PMD^TM 19-T載體，并將連接產物轉入大腸桿菌DH5α內，挑選陽性克隆，搖菌提取質粒測序，并在37℃雙酶切，回收蛋白酶基因片段，用相同內切酶酶切表達載體pET-22b(+)并回收載體DNA片段，將蛋白酶基因片段與載體片段混合，在16℃下，用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產物轉入DH5α感受態細胞內，通過藍白斑篩選獲得含有表達載體的陽性克隆，最后挑取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB液體培養基中，180rpm、37℃培養16h后提取質粒，雙酶切驗證，如圖2所示。

上述PCR擴增條件為：98℃預變性3min；98℃變性10s；68℃延伸45s；30個循環后，68℃終延伸3min。

4、蛋白酶過表達轉基因菌株的構建

將上述蛋白酶表達載體轉入到Transetta(DE3)大腸桿菌，在含有氨芐青霉素(100μg/mL)和氯霉素(25μg/mL)的LB固體培養基上篩選，獲得重組表達菌株。

上述的Transetta(DE3)具有以下特征：該菌株是攜帶氯霉素抗性質粒BL21的衍生菌，補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)對應的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系統中的表達水平。

5、重組蛋白酶體外誘導表達與驗證

挑取陽性克隆于含有氨芐青霉素(100μg/mL)和氯霉素(25μg/mL)的LB液體培養基中，在28℃震蕩培養，當OD₆₀₀達到0.8-1.0時，加入IPTG和ZnSO₄溶液使其在發酵液中的濃度分別達到25μM和25mM，20℃繼續培養20h進行誘導表達，然后將誘導表達培養好的發酵液離心收集菌體，利用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再利用1/10發酵液體積的磷酸鹽緩沖液重懸菌體后，在冰浴條件下利用超聲波破胞至菌液澄清，13000rpm離心15min收集上清，上清液即為蛋白酶的粗酶液。

制備12.0％SDS-PAGE膠，將粗酶液與5×SDS-PAGE Loading Buffer比例混合，與沸水浴5min，每個點樣孔上樣20μL，在160V電壓下電泳60-70min，直至溴酚藍指示條帶完全跑出膠。停止電泳，用考馬斯亮藍R-250溶液染色20min，然后用脫色液進行洗滌，直至背景色完全脫去，條帶清晰可見，如圖3所示，結果顯示，該蛋白酶在第12h表達量最高。

所述的12％SDS-PAGE是由濃縮膠與分離膠構成的，其組分分別為：

分離膠：蒸餾水1.6mL，30％丙烯酰胺溶液2.0mL，1.5M Tris-HCl(pH 8.8)1.3mL，10％過硫酸銨(APS)0.05mL，10％SDS溶液0.05mL，TEMED 0.002mL；

濃縮膠：蒸餾水0.68mL，30％丙烯酰胺溶液0.17mL，1.0M Tris-HCl(pH6.8)0.13mL，10％過硫酸銨(APS)0.01mL，10％SDS溶液0.01mL，TEMED0.001mL；

所述的5×SDS-PAGE Loading Buffer組分：1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，溴酚藍25mg，甘油2.5mL，去離子水定容至5mL。小份分裝(500μL)后與室溫保存，使用前每小份加入β-巰基乙醇25μL。

所述的考馬斯亮藍R-250溶液組分為：考馬斯亮藍R-250 1.0g，異丙醇250mL，冰醋酸100mL，去離子水650mL。

所述的脫色液組分為：冰醋酸100mL，無水乙醇50mL，去離子水850mL。

6、重組蛋白酶的純化及其在不同條件下酶學活性測定

收集細胞破碎后的上清液，經0.45μm醋酸纖維素膜過濾，之后通過Ni-NTA Resin與聚組氨酸標簽(His₆·Tag)間的親和吸附進行蛋白純化，隨后使用濃度為10mM-300mM的咪唑洗脫液對粗蛋白溶液進行洗脫，結果表明，當咪唑濃度為50mM-100mM時，蛋白純化效果最佳。

采用福林酚法分別測定在不同溫度(30℃～70℃)下孵育12h、不同pH值(3.0～11.0)下孵育7d、1mM金屬離子(Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺和Fe²⁺)及1mM酶活性抑制劑(DTT、EDTA、SDS和NaN₃)處理1h，該蛋白酶酶液的殘存活性；測定結果表明，當溫度為55℃時，該蛋白酶具有最高催化活性，證明該蛋白酶對高溫有很強的耐受力，如圖4所示；該 蛋白酶在pH為7.0時具有最高的催化活性，表明該蛋白酶為中性蛋白酶，如圖5所示。當pH為7.0且溫度為55℃時，粗酶液的蛋白酶活性可達215.3U/mL，遠遠高于該蛋白酶在天然灰略紅鏈霉菌的活性為48.2U/mL。

此外，本發明還確定了多種金屬離子(Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Fe²⁺)及酶活性抑制劑(EDTA、DTT、SDS和NaN₃)對該蛋白酶活性的影響，如表1所示，本發明的蛋白酶對上述的金屬離子和酶活性抑制劑均有較強的耐受能力，特別是由于該蛋白酶作為一種金屬(Zn²⁺)酶類，Zn²⁺可提高蛋白酶活性，而EDTA作為金屬離子螯合劑可較大程度的抑制該蛋白酶的活性。

附表1金屬離子及酶活性抑制劑對蛋白酶活性影響

以上公開的本發明優選實施例只是用于幫助闡述本發明。優選實施例并沒有詳盡敘述所有的細節，也不限制該發明僅為所述的具體實施方式。顯然，根據本說明書的內容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發明的原理和實際應用，從而使所屬技術領域技術人員能很好地理解和利用本發明。本發明僅受權利要求書及其全部范圍和等效物的限制。