本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種β-胡蘿卜素單加氧酶的制備方法及其應用。

背景技術：

全反式視黃醛，又稱維生素A醛，是維生素A合成的重要前體，在抵抗肌膚衰老方面具有重要生理功能。全反式視黃醛通過生理作用可以轉化為活性維生素A，具有雙重抗衰老作用，不僅促進細胞代謝，還能提亮膚色。全反式視黃醛可被氧化為反式視黃酸，在免疫缺陷病及癌癥治療中具有重要作用。此外，全反式視黃醛是傳統的β-胡蘿卜素制備工藝的重要中間體。

全反式視黃醛一般通過視黃醇氧化反應獲得，由于視黃醇的分子結構中具有多個共軛雙鍵，對熱、光或氧氣等極不穩定，在氧化反應過程中容易形成多種氧化產物,同時氧化劑使用會產生大量污染物，因此很難適用于工業化生產（Helv.Chim.Acta 40, 265 (1957)；中國專利200710157075.0；中國專利93118128.3）。通過對β-紫羅蘭酮和環檸檬醛側鏈上進行增碳反應（Tetrahedron. Lett. 35,7383(1994); Chem. Lett. 1201 (1975)），也可以合成全反式視黃醛，但是由于該方法中β-紫羅蘭酮和環檸檬醛的價格昂貴，并且需要多個反應步驟，因此也不適用于工業生產。

鑒于目，提出一種利用β-胡蘿卜素單加氧酶制備全反式視黃醛方法。

技術實現要素：

本發明為解決前化學合成方法制備全反式視黃醛的不足的技術問題，提供了一種β-胡蘿卜素單加氧酶的制備方法及其應用。

為解決上述技術問題，采用以下技術方案：

一種β-胡蘿卜素單加氧酶的制備方法，構建β-胡蘿卜素單加氧酶基因的原核表達載體，將原核表達載體導入大腸桿菌中表達，經Ni-NTA柱親和層析和分子篩純化后，得到純化的普β-胡蘿卜素單加氧酶。

所述β-胡蘿卜素單加氧酶基因來源于弓形棲熱菌，保藏號為CGMCC NO.1.6992。

一種β-胡蘿卜素單加氧酶的應用，所述β-胡蘿卜素單加氧酶作為催化劑，在反應液中催化底物β-胡蘿卜素，反應溫度45-55℃，反應時間20-30 h，反式視黃醛的轉化率達89.5%。

所述反應液的成分為：50mmol/L NaCl、5 mmol/L FeSO₄·7H₂O、20 mmol/L TCEP、2%（w/v）OTG、1% （w/v）Tween 80、5 mmol/L DTT、50mmol/L pH 8.0的Tricine/KOH緩沖液。

所述催化劑的濃度為4U/mL，底物濃度為1000 mg/L。

本發明的有益效果在于：

（1）本發明得到了一種棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶的基因序列和氨基酸序列，該酶是在弓形棲熱菌Thermus arciformis中發現并制備獲得的第一個β-胡蘿卜素單加氧酶；

（2）本發明獲得了一種不同于已發現β-胡蘿卜素單加氧酶的新型酶資源，該β-胡蘿卜素單加氧酶具有不同的氨基酸序列和酶學特性；

（3）本發明建立了棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶制備全反式視黃醛的方法，并優化了反應條件，經優化后全反式視黃醛轉化率達到89.5%。

附圖說明

圖1為純化后的β-胡蘿卜素單加氧酶SDS-PAGE分析，其中M：蛋白Marker；1、2和3道為純化后棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶；

圖2為β-胡蘿卜素單加氧酶的最適反應溫度曲線圖；

圖3為β-胡蘿卜素單加氧酶的最適pH曲線圖；

圖4為β-胡蘿卜素單加氧酶具有轉化制備全反式視黃醛HPLC結果；

圖5為酶濃度對全反式視黃醛產量的影響；

圖6為底物濃度對全反式視黃醛產量的影響；

圖7為在最佳反應條件下全反式視黃醛產量。

具體實施方式

1. 一種弓形棲熱菌（Thermus arciformis）β-胡蘿卜素單加氧酶的制備方法，包括菌株、質粒、工具酶、培養基，引物設計，PCR擴增及重組質粒的構建，基因的誘導表達與蛋白質的純化。具體步驟如下：

（1）菌株、質粒、酶與培養基：

大腸桿菌Escherichia coli DH5α、限制性內切酶NdeI和BamHI、Pyrobest DNA聚合酶、DNA連接酶、細菌基因組DNA提取試劑盒kit ver.3.0購自TAKARA公司；大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）購自Novagen公司；LB培養基：每升含Tryptone 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 10 g；氨芐青霉素濃度為100 mg/L, 氯霉素濃度為34 mg/L；弓形棲熱菌（Thermus arciformis）保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1.6992；克隆與表達質粒載體pET22b購自Novagen公司。

（2）弓形棲熱菌T. arciformis菌株培養：

弓形棲熱菌T. arciformis培養基成分(1 L): Tryptone 1 g, Yeast extract 1 g, 安三乙酸0.1 g，CaSO₄ 0.05 g, MgSO₄·7H₂O 0.1 g, NaNO₃ 0.8 g, KNO₃ 0.1 g, K₂HPO₄ 0.2 g,微量元素溶液1 mL。

微量元素溶液成分(1 L):NaCl 8 g, FeCl₃·6H₂O 0.5 g, MnSO₄·H₂O 2.5 g,ZnSO₄·7H₂O 0.5 g, H₃BO₃ 0.5 g, CuSO₄·5H₂O 0.025 g, Na₂MoO₄·2H₂O 0.025 g, CoCl₂·6H₂O 0.5 g。

以1mol/L NaOH調pH為7.2,121℃滅菌30min后加入適量無菌的0.5 mol/L Na₂CO₃/NaHCO₃溶液調pH為9.0。

培養條件：70℃、轉速200 r/min震蕩培養24 h至OD_600nm為0.5左右。將菌液轉至滅菌的50 mL離心管，4℃下4,000 g離心10 min，棄上清，收集菌體。

（3）PCR擴增及重組質粒的構建：

利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取弓形棲熱菌T. arciformis基因組DNA（提取方法見試劑盒說明書）。按照目前已經報道β-胡蘿卜素單加氧酶保守氨基酸序列，設計引物，上游引物如SEQ ID NO：1所示，其中CATATG為NdeI酶切位點；下游引物如SEQ ID NO：2所示。其中GGATCC為BamHI酶切位點。以弓形棲熱菌T. arciformis基因DNA為模板，PCR技術擴增β-胡蘿卜素單加氧酶基因片段,PCR反應體系（100μL）如下：模板1 μL（50 ng）, dNTP (25 mmol/L) 2μL，引物（100 μmol/L）各1μL，MgCl₂(25 mmol/L) 2μL，10×緩沖液10μL，Probest^TM DNA 聚合酶 (5U/μL) 1μL，超純水82 μL。PCR反應條件：95℃4 min；95℃30s，56℃30s，72℃ 2 min，35個循環。

將質粒pET22b及經瓊脂糖凝膠回收β-胡蘿卜素單加氧酶基因片段，使用限制性內切酶NdeI和BamHI分別進行雙酶切，雙酶切液進行回收。雙酶切反應體系（20 μL）如下：PCR產物/pET22b 16μL（400 ng），NdeI 內切酶（15 U/μL）1μL，BamHI內切酶（15 U/μL）1μL，10×緩沖液 2 μL。雙酶切反應混合液30℃反應6h。

進一步通過目的基因與載體pET22b的連接，獲得重組質粒，并進行雙酶切（如圖1所示）及測序驗證。經測序分析鑒定得到β-胡蘿卜素單加氧酶基因的序列，如SEQ ID NO：3所示；β-胡蘿卜素單加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

（4）基因的誘導表達與蛋白質的純化：

將測序正確的重組質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)中。挑取平板上的單菌落于20 mL含氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養基中，培養12-16 h。按2%接種量轉接入1 L含氨芐青霉素和氯霉素LB液體培養基中，培養2.5h，使OD₆₀₀nm在0.4-0.6。加入終濃度0.5mmol/L IPTG于30℃繼續培養8h，4℃4,000 rpm/min離心20 min。收集的菌體懸浮在30 mL破壁buffer（50mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 100mmol/LNaCl）中，超聲波破碎菌體（功率300w，超聲時間5秒，間隔時間5秒，超聲次數150次）。超聲波破碎菌體,12, 000×g離心15min，得到粗酶液。將得到的粗酶液用0.22 μm濾膜過濾，Ni-NTA瓊脂糖親和層析進行蛋白純化，步驟如下：分別用3 mL水和5 mLCharge buffer（50 mmol/L NiSO₄）洗 1 ml 瓊脂糖樹脂，然后3 mL Binding buffer（20mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 500 mmol/L NaCl, 5 mmol/L咪唑）平衡柱子。過濾過的蛋白溶液加入柱子中，結合 Ni-NTA樹脂上。用6 mL Wash buffer （20mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 500 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑）去除非特異結合的蛋白，然后用6 mLElute buffer（20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 500 mmol/L NaCl, 1 mol/L咪唑）洗脫結合在樹脂上的蛋白。將過鎳柱后蛋白溶液透析在平衡buffer（50mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 200 mmol/L NaCl）中，然后用AKTA FPLC蛋白純化系統分子篩柱純化蛋白。分子篩條件為Sephacryl TM S-100 HR column層析柱用50 mmol/L Tris-HCl, 200 mmol/L NaCl 緩沖液(pH 7.5) 平衡，流速為1 ml/min。SDS-PAGE蛋白電泳檢測收集下來的蛋白。

2.棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶的酶學性質分析鑒定

檢測棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶酶活性，采用以下反應體系：2 mg/mLβ-胡蘿卜素、50mmol/L NaCl、5 mmol/L FeSO₄·7H₂O、20 mmol/L三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽（TCEP）、2%（w/v）辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（OTG）、1% （w/v）Tween 80、5 mmol/L DTT、50mmol/LTricine/KOH緩沖液（pH 8.0）和0.5U/mLβ-胡蘿卜素單加氧酶酶液,50℃酶解120 min，加入5%的甲醛終止反應。以不含有酶液的上述反應體系作為對照組。酶活力單位定義為：在一定條件下，每分鐘生成1 微摩爾的全反式視黃醛所需要的酶量為一個活力單位(U)。

高效液相色譜HPLC檢測反應產物，所用色譜柱為Alltech PrevailC18柱(美國奧泰公司，25 cm × 4.6 cm)，采用日本島津SPD-M10A二極管陣列檢測器。檢測β-胡蘿卜素，流動相為正己烷：甲基叔丁基醚（95:5,v/v），洗脫速度為1.0 mL/min，在波長460 nm檢測；檢測全反式視黃醛，流動相為乙腈：水（90:10,v/v），洗脫速度為0.4 mL/min，在波長370 nm檢測。

通過對棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶進行分析鑒定，得到該酶的主要以下酶學性質如下：

（1）得到編碼棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶的基因序列，共960堿基，基因序列如SEQ ID NO：1所示。

（2）得到編碼棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶的氨基酸序列，共319氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

（3）得到純化的棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶蛋白電泳圖如圖2所示。重組質粒在大腸桿菌BL21(DE3)表達后，經超聲波破壁、50℃ 熱處理、鎳柱親和層析和分子篩Sephacryl TM S-100，得到純化重組β-胡蘿卜素單加氧酶，分子量大小為35KDa，結果如圖1所示。

（4）棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶最適反應溫度和pH分別為50℃和8.0（如圖2和3所示）。

3. 棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶轉化β-胡蘿卜素制備全反式視黃醛

HPLC檢測結果如圖4所示，棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶具有轉化β-胡蘿卜素制備全反式視黃醛的活性。在β-胡蘿卜素單加氧酶的酶活性標準反應體系中，優化催化合成全反式視黃醛產量。

酶的濃度：分別在反應體系中添加棲熱β-胡蘿卜素單加氧酶0—6 U/mL，檢測全反式視黃醛產量。結果表明，4U/mL的酶液作用下，全反式視黃醛的產量最高，達到400mg/mL（如圖5所示）。

底物濃度：分別在反應體系中添加不同濃度底物β-胡蘿卜素（0-1000 mg/L），檢測全反式視黃醛產量。結果表明，在底物β-胡蘿卜素濃度為600 mg/l，β-紫羅蘭酮的相對產量最高，達到562.3400 mg/mL（如圖6所示）。

在以上實驗結果的基礎上，建立棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶轉化β-胡蘿卜素制備全反式視黃醛的最佳反應條件，酶濃度4U/mL，β-胡蘿卜素濃度1000mg/L，反應溫度50℃，反應pH 8.0，其它反應條件為標準反應體系。結果如圖6所示，反應25h后，產生569.3mg/L全反式視黃醛，同時消耗600mg/Lβ-胡蘿卜素，根據催化反應式，計算生成全反式視黃醛的轉化率達到89.5％。以上實驗結果表明棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶可以高效催化合成全反式視黃醛，具有較好的工業應用價值。

4、棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶的應用

全反式視黃醛，不僅可以作為維生素A合成的重要前體，在抵抗肌膚衰老、免疫缺陷病及癌癥治療中也具有重要作用。本發明在弓形棲熱菌T. arciformis中發現了一個能夠高效催化裂解β-胡蘿卜素的β-胡蘿卜素單加氧酶。采用分子生物學方法構建了棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶的原核表達載體，并將重組質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)。經Ni-NTA柱親和層析和分子篩純化后，得到純化的普β-胡蘿卜素單加氧酶。經SDS-PAGE電泳檢測，分子質量是35KD。酶學性質研究表明，該酶的最適溫度50℃，最適pH8.0。經優化最佳反應條件：底物β-胡蘿卜素濃度1000 mg/L，棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶4.0U/mL，反應溫度50℃，水解反應25 h，50mmol/L NaCl、5 mmol/L FeSO₄·7H₂O、20 mmol/L三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽（TCEP）、2%（w/v）辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（OTG）、1% （w/v）Tween 80、5 mmol/L DTT、50mmol/LTricine/KOH緩沖液（pH 8.0）。在此條件下，生成569.3mg/L全反式視黃醛，轉化率達到89.5%。到目前為止，還未見采用生物酶法制備全反式視黃醛。綜上所述，棲熱菌β-胡蘿卜素單加氧酶具有良好的催化活性，可以高效催化降解β-胡蘿卜素，制備高純度的全反式視黃醛，適用于全反式視黃醛生物酶法制備，具有較好的工業應用前景。