本發明屬于分子生物學和生物技術領域的重組病毒載體疫苗，具體涉及一種能夠表達具H7N9亞型禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)血凝素HA蛋白的重組火雞皰疹病毒(HVT)，該重組病毒可用于免疫家禽預防H7N9亞型禽流感病毒中的用途。

背景技術：

感染人的H7N9亞型禽流感于2013年首次爆發我國華東的長三角地區，是一株三源重組的新型禽流感病毒，對家禽不致病或低致病性。截止目前已經擴散至全國除西藏和內蒙古自治區外的所有地區，珠江三角區是繼長三角地區后的又一新的爆發疫源地。根據WHO的統計顯示，截止到2016年6月13日，一共有781例人感染H7N9的案例，其中死亡313人，死亡率在40％左右。根據flutracters的追蹤報道，截止到2016年7月，H7N9感染人的案例已經突破800。其增長速度直逼自從2003年以來人感染H5亞型禽流感數量已經高達851例，由此可見人感染H7N9的數量增長勢頭迅猛，對公共衛生的危害不容小覷。由于家禽感染不發病，感染的病例多有與活期接觸的流行病史，因此，活禽市場的家禽的H7N9疫情狀態具有直接對公共衛生健康的影響巨大。并且人感染H7N9的高峰季節也與家禽的流行規律息息相關。然而目前臨床尚無針對H7N9的家禽疫苗用于防控此類疾病，因此亟需研制新型的疫苗來保護家禽，降低疫情對公共的危害。

火雞皰疹病毒(Herpesvirus of Turkey,HVT)是一種典型無致病性的α皰疹病毒。因HVT與雞馬立克病毒(Marek's disease virus，MDV)在遺傳學和血清學上具有相關性，自1970年以來，HVT Fc-126株作為MD疫苗被廣泛使用。該疫苗具有不會引發致瘤發生、保護效果良好、在體內持續存在、可以凍干、便于儲存和運輸等諸多優點，在MD的防控過程中發揮了重要的作用。近年來，HVT作為病毒載體方面的研究取得了許多進展，因HVT與其它禽病毒載體相比具有許多獨特優勢，包括：HVT對雞及其他動物無致病性，安全性好；可以在動物體內持續存在、有利于外源基因的持續表達、刺激機體產生較高的抗體水平；HVT可引起高強度的細胞介導的免疫反應、免疫出現早、持續時間長、接種一次可達到終生免疫；HVT重組疫苗具有生產成本低、可以凍干、易于貯存和運輸；HVT具有很強的細胞結合特性、病毒于細胞間傳播、因此作為重組疫苗，可以突破母源抗體的干擾等[Bublot,M.,et al.,Use of a vectored vaccine against infectious bursal disease of chickens in the face of high-titred maternally derived antibody.J Comp Pathol,2007.137Suppl 1:p.S81-4.]。目前，傳染性法氏囊病毒等多種禽病保護性抗原均已在HVT載體中成功表達[Tsukamoto,K.,et al.,Complete,Long-Lasting Protection against Lethal Infectious Bursal Disease Virus Challenge by a Single Vaccination with an Avian Herpesvirus Vector Expressing VP2Antigens.Journal of Virology,2002.76(11):p.5637-5645.]。應用上述水平制備的VaxxitexRHVT+IBD重組疫苗已經獲得生產許可，成為商品化的以皰疹病毒為載體的動物源性疫苗，使HVT成為最具有開發前景的病毒載體。其技術核心利用同源重組原理：通過外源基因兩側的非必需區同源臂與HVT基因組相對應區段進行同源交換，從而將外源基因導入基因組中。1992年Morgan等人首次利用同源重組方法構建了表達NDV(F)基因的重組HVT，該重組病毒既能抵抗致死性MDV的攻擊，又能預防新城疫，其保護率接近傳統疫苗的保護效果[Morgan,R.W.,et al.,Protection of chickens from Newcastle and Marek's diseases with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing the Newcastle disease virus fusion protein.Avian Dis,1992.36(4):p.858-70.]。后來，Gao等人使用上述方法將AIV H5N1(HA)基因插入到HVT基因組不同的位置中，構建了兩株rHVT重組病毒，疫苗試驗表明這兩株重組病毒均可以同時抵抗AI和MD[Gao,H.,et al.,Expression of HA of HPAI H5N1Virus at US2Gene Insertion Site of Turkey Herpesvirus Induced Better Protection than That at US10Gene Insertion Site.PLoS ONE,2011.6(7):p.e22549.]。

內源性啟動子具有克服針對抗原的母源抗體干擾作用。MDV基因的轉錄和翻譯，是受到嚴格調控的。如當病毒感染細胞時，病毒基因的表達分為3個時期：立即早期、遲早期和晚期。但是，以MDV構建重組病毒時，異源的強啟動子受到病毒的調控較少，在重組病毒免疫的早期，該啟動子所控制地保護抗原基因大量表達，與機體中針對該抗原的母源抗體發生反應，使得針對該抗原的母源抗體下降，從而降低了機體對某種疾病的早期保護。Sonoda等(Sonoda,Kengo,et al."Development of an effective polyvalent vaccine against both Marek's and Newcastle diseases based on recombinant Marek's disease virus type 1in commercial chickens with maternal antibodies."Journal of virology 74.7(2000):3217-3226.)利用MDVI型自身的gB啟動子構建重組病毒，表達NDV的F基因，免疫商品雞，可以提供100％的保護，同時，并不影響重組病毒的穩定性。因此，進一步證實了MDV I型自身的gB啟動子受到嚴格地調控，可以避免母源抗體的干擾，保證了免疫保護力。

影響外源基因表達水平的因素很多，而密碼子的選擇是其中重要的參數之一，基因表達水平與嗜好密碼子的使用程度之間存在強的相關性。每個氨基酸平均有三個對應密碼子，這使得不同的核苷酸序列可以編碼出相同的氨基酸序列，而編碼同一氨基酸的不同的密碼子在不同的生物和不同基因中的使用頻率有著顯著的差異，這與在細胞中相應的tRNA的濃度是呈正相關的。使用頻率極低的就是該物種或基因的稀有密碼子，稀有密碼子的使用已經被證實為阻礙基因表達的一個重要因素，因此去除稀有密碼子能夠顯著提高一個基因的翻譯速度。每個物種都有對應的偏嗜密碼子，因此為了提高外源基因在一個物種體內的翻譯和表達水平，常常對外源基因密碼子進行改造，使之符合該物種的密碼子偏嗜分布。Jiang(Jiang,Yongping,et al."Enhanced protective efficacy of H5subtype avian influenza DNA vaccine with codon optimized HA gene in a pCAGGS plasmid vector."Antiviral research 75.3(2007):234-241.)等人對H5的HA密碼子優化(optiHA)插入到真核表達質粒pCAGGS上免疫SPF雞，優化后的optiHA能夠顯著提高H5亞型禽流感DNA疫苗誘導的保護性抗體免疫反應水平，增強免疫保護效果。

此外，多家跨國公司已經研制出以HVT為載體的商品化疫苗。其中，法國梅里亞公司的HVT用來表達傳染性法氏囊病(IBD)的VP2基因，即可用來預IBD，又能預防馬立克氏病(MD)，目前已經在70多個國家銷售使用。詩華公司的HVT系列產品中，ND表達新城疫病毒(NDV)的F基因，用于預防ND和MD；AI表達clade2.2(A/swan/Hungary/4999/2006)H5N1的HA蛋白，用于預防不同亞型的H5高致病性禽流感和MD，保護率在80％-100％。目前已經在埃及，蒙古，越南等多個國家的家禽養殖業中投入使用，發揮了巨大的經濟效益。

技術實現要素：

本發明目的在于構建表達H7N9亞型禽流感血凝素蛋白的重組HVT病毒，為研制H7N9亞型禽流感的疫苗提供基礎。

本發明表達H7N9亞型AIV血凝素蛋白的重組火雞皰疹病毒株rHOH，是火雞皰疹病毒血清3型FC126株重組毒株，其保藏號CGMCC NO.12985。

所述的重組火雞皰疹病毒株rHOH，它的gB啟動子來源于火雞皰疹病毒載體FC126自身；表達的外源抗原(血凝素蛋白)基因經Gallus Gallus的密碼子偏嗜性優化，核苷酸的序列發生改變，但不改任何變氨基酸序列。

本發明的第二個目的在于提供高效表達H7N9亞型禽流感病毒HA的HVT重組病毒的構建方法，該方法包括以下步驟：

(1)先獲得密碼子優化過的OHA和HVT的gB(HgB)啟動子，在帶有同源臂的pCMGFP上EcoRV、NheI與Kpn2I酶切位點(核苷酸位置140408-140651之間)依次進行連接替換HgB啟動子和表達外源的OHA基因；連接完后的質粒，轉化到Takala的JM109感受態細胞內37度培養過夜，挑斑提質粒雙酶切和測序鑒定，陽性的質粒命名為pHOH；所述OHA序列如SEQ ID NO:1，HgB啟動子序列如SEQ ID NO:2；

(2)將中間轉移質粒pHOH與表達GFP熒光蛋白的重組火雞皰疹病毒(rHVT-GFP)的DNA進行磷酸鈣共轉染，篩選出不帶熒光的病毒蝕斑后，并經過間接免疫熒光(IFA)和測序鑒定，該不帶熒光的蝕斑即為帶有H7N9的HA的重組火雞皰疹病毒rHOH。

本發明還公開了所述重組火雞皰疹病毒株rHOH在制備預防H7N9亞型禽流感病毒的疫苗中的用途。

本發明的優點在于：本發明供了一種用于預防H7N9亞型禽流感的候選疫苗毒株，接種孵化后第18日齡的雞胚或1日齡的雛雞，預防和控制家禽的H7N9疫情，保護公眾衛生和安全。

附圖說明

圖1 HVT的gB(HgB)啟動子，M為200bp的Marker，1為742bp的HgB啟動子。

圖2中間轉移質粒pHOH圖譜。

圖3轉移質粒pHOH的雙酶切鑒定，M為1000bp的marker，1和2同為經EcoRV和NheI雙酶切。

圖4同源重組示意圖

圖5 rHOH的IFA結果和陰性對照，(左邊為陰性對照，右邊為陽性結果)。

圖6重組質粒pHOH構建示意圖。

圖7重組病毒rHOH轉染、同源重組以及篩選鑒定示意圖。

本發明毒株rHOH于2016年9月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，分類命名為火雞皰疹病毒血清3型FC126株重組毒株；保藏號CGMCC NO.12985。

具體實施方式

材料

rHVT-GFP和pCMGFP由由揚州大學農業部畜禽傳染病重點實驗室構建保存，參見專利申請公布號：CN105002146A。H7N9亞型禽流感JX148株(A/chicken/Zhejiang/JX148/2014)由揚州大學農業部畜禽傳染病重點實驗室分離保存，雞胚效價為10，血凝抑制反應證明JX148的多抗血清與其他亞型的H7N9具有較高的交叉反應性。

pCR2.1載體：購自Invitrogen公司；High fidelity DNA polymerase、T4DNA連接酶、Agarose Gel DNA Extraction Kit購自Roche公司；質粒抽提試劑盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)為QIAGEN公司產品；其余常規試劑均為國產分析純。

步驟1.密碼子優化與合成

根據JX148HA的序列(EPI_ISL_235293)，交由南京金斯瑞公司參照雞(Gallus gallus)的密碼子偏嗜(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝9031)進行密碼子優化與合成optiHA(OHA：SEQ ID NO:1)，添加酶切位點后克隆到UC57載體上(由金斯瑞公司提供)，命名為UC57-OHA。

步驟2.擴增HVT的內源性gB啟動子

使用DNeasy Blood tissue kit抽提FC126(GenBank:AF291866)的基因組DNA。使用Gene promoter miner(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)在線預測分析啟動子含有TAAT和CAAT等真核生物啟動子的順式作用元件。并合成引物，PCR克隆FC126的gB啟動子(HgB，SEQ ID NO:2)，并在啟動子首位末端均添加EcoRV和NheI限制性內切酶位點和保護性堿基。引物序列如下

gB-F:gatatcATTGTTCAATCATGATGTCCA(SEQ ID NO:3)

gB-R:gctagcGAGTTCCACCGACCGTATGA(SEQ ID NO:4)

PCR擴增(50μL反應體系)：以含有抽提的基因組基因為模板，吸至0.5mL PCR反應管中，以引物gB-F和gB-R擴增gB啟動子基因，具體操作方法如下：

10×Reaction Buffer 5μL

gB-F(50pmol/μL) 1μL

gB-R(50pmol/μL) 1μL

dNTPs(10mmol/L) 1μL

Expand High Fidelity Polymerase(3.5U/μL) 1μL

cDNA 4μL

SW 37μL

PCR反應循環參數：94℃預變性3min；94℃30s，56℃45s，72℃延伸2min，20個循環后72℃延伸10min，4℃保存。將PCR產物經電泳后切割含目的大小片段的凝膠，用Agrose Gel DNA Extraction Kit回收純化后與pCR-2.1T載體相連，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，提取質粒，經EcoR I酶切鑒定正確后送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，將序列測定正確的陽性質粒命名HgB(圖1)。

步驟3.構建中間轉移質粒

將UC57-OHA使用Nhe I和Kpn II雙酶切，電泳后膠回收備用。將pCMGFP使用EcoRv和NheI雙酶切后，電泳膠回收備用。在專利CN105002146A中所構建帶有同源臂的中間質粒pCMGFP基礎上，將OHA和HgB分別替換到pCMGFP質粒上，并將測序鑒定好的陽性質粒重新命名為pHOH(圖2)，并雙酶切鑒定(圖3)。中間質粒的構建示意圖如圖6所示。

步驟4.重組火雞皰疹病毒的構建和純化

(1)rHVT-GFP感染細胞DNA的制備

原代和次代CEF細胞按常規方法制備，在每瓶T75細胞培養瓶的次代CEF中接種105空斑形成單位(PFU)的重組rHVT-GFP病毒株、培養3-5天、等80％細胞產生典型的細胞病變后收獲細胞、按照傳統的酚氯仿方法提取HVT基因組。

(2)轉移載體pCMHA和rHVT-GFP基因組DNA共轉染CEF細胞

用QIAprep Spin MiniPrep Kit(QIAGEN)抽提轉移載體pHOH質粒DNA。CEF按常規方法制備，在開始轉染試驗1h前制備次代CEF，每個60mm培養皿鋪3x10⁶細胞，于37℃、5％CO2條件下培養。

在無菌的指形管中依次加入以下試劑：

無菌超純水 194μL

rHVT-GFP DNA 5μg

轉移載體pHOH質粒 1μg

TE 補足至25μL

同時需設不加轉移載體pCMGFP質粒的HVT對照組，體系如下：

無菌超純水 194μL

rHVT-GFP DNA 5μg

TE 補足至25μL

混勻上述體系后，從管底緩慢加入31μL 2mol/L CaCl2溶液和250μL 2xHBSP溶液(42mmol/L HEPES、1.4mmol/L Na2HP04、274mmol/L NaCl、5mmol/L KCI、pH7.05的6mmol/L葡萄糖)，用吸管輕輕從管底吹出數個氣泡，室溫靜置30min，形成CaP04-DNA混合物。向每個鋪有次代CEF細胞的60mm培養皿中加入500μL CaP04-DNA復合物，輕輕搖勻，繼續培養4h。棄掉培養基，每個細胞培養皿中加入2mL的甘油休克。

2.5ml甘油休克液的體系按如下：

無菌超純水 0.9mL

甘油 0.35mL

2xHBSP 1.25mL

混勻上述體系后作用1min后棄掉休克液，用維持液(V)培養基洗滌細胞，棄掉洗滌液，加入含4％胎牛血清的生長液(G)培養基，繼續培養5-7d后用倒置熒光顯微鏡觀察。

(3)重組病毒rHOH的篩選和純化

將轉染后的CEF用倒置熒光顯微鏡觀察，標記出不帶有綠色熒光的病毒空斑。棄掉培養基，用帶有少許胰酶的吸管刮取病毒空斑，轉移至10mL生長液(G)培養基中進行稀釋，每一個病毒空斑接種一塊已鋪次代CEF細胞的96孔板，每孔接種l00μL稀釋的病毒空斑，置于37℃、5％CO2條件下培養。重復上述步驟，直到96孔細胞培養板上所有的病毒空斑都不帶有綠色熒光，并且組成每個病毒空斑的細胞都不帶有熒光，說明重組病毒純化完全，將該重組病毒命名為rHOH。同源重組的方法示意見圖4。

步驟5.重組火雞皰疹病毒的鑒定

間接免疫熒光試驗(IFA)檢測rHOH對外源抗原的表達：以rHOH感染次代CEF細胞，3-5天形成病毒空斑；用冷甲醇固定細胞30分鐘，PBS洗滌3次；加工作濃度的抗AIV HA多克隆抗體(H7血清)，37℃作用1小時，PBS洗滌2-3次；加工作濃度的抗雞IgG/lgM熒光單抗，37℃作用1小時，用PBS洗滌2-3次；置熒光鏡下觀察，結果表明組成病毒空斑的所有細胞均帶熒光(圖5)。轉染、同源重組以及篩選和鑒定的示意圖如圖7所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 揚州大學

<120> 表達H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組火雞皰疹病毒株rHOH及構建方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaacacac agatcctggt gttcgccctg attgctatca ttcccactaa tgctgacaag 60

atctgcctgg ggcaccacgc agtgagcaac ggcaccaaag tgaataccct gacagagaga 120

ggagtggaag tggtgaacgc aactgagacc gtggaaagga ctaatatccc tcgcatttgc 180

agcaagggga agaaaaccgt ggatctgggc cagtgcggac tgctggggac aatcactggc 240

ccccctcagt gcgaccagtt cctggagttt agcgctgatc tgatcattga gagaagggaa 300

ggatccgacg tgtgctaccc tgggaagttc gtgaacgagg aagcactgcg gcagatcctg 360

agagagagcg gcggaattga taaagaagcc atggggttta cttactccgg catcagaacc 420

aatggagcaa ccagcgcatg caggaggtcc gggagctcct tctacgccga gatgaagtgg 480

ctgctgagca acaccgacaa tgccgctttt ccccagatga ctaagagcta caaaaacacc 540

agaaaatccc ctgccctgat cgtgtggggc attcaccaca gcgtgtccac agctgaacag 600

actaagctgt acggaagcgg gaacaaactg gtgacagtgg gaagctccaa ttaccagcag 660

agcttcgtgc catccccagg agcaaggcca caggtgaacg gactgagcgg ccgcatcgac 720

tttcactggc tgatgctgaa ccctaatgat accgtgacat tcagctttaa tggcgctttc 780

atcgcaccag accgggcttc ctttctgaga ggcaagagca tgggaattca gtccggggtg 840

caggtggacg caaactgcga gggagattgc taccacagcg ggggcacaat catttccaac 900

ctgccattcc agaatatcga tagcagggca gtgggaaagt gcccaagata cgtgaaacag 960

cgctccctgc tgctggctac tggaatgaag aacgtgcctg agatcccaaa aggccgggga 1020

ctgttcggcg ctatcgcagg atttattgag aacgggtggg aaggcctgat tgacggatgg 1080

tacgggttta gacaccagaa tgctcagggg gagggcacag cagccgacta caagagcact 1140

cagtccgcaa tcgatcagat taccggaaag ctgaacaggc tgatcgaaaa aacaaatcag 1200

cagttcgagc tgattgacaa cgaatttaat gaggtggaaa aacagatcgg gaacgtgatt 1260

aattggaccc gcgatagcat cacagaagtg tggtcctaca acgccgagct gctggtggct 1320

atggaaaatc agcacaccat tgacctggcc gatagcgaga tggacaagct gtacgaaaga 1380

gtgaaaaggc agctgcgcga gaacgctgag gaagatggaa ccgggtgctt cgaaatcttt 1440

cacaagtgcg atgacgattg catggcaagc attaggaaca atacatacga tcactccaaa 1500

taccgggagg aagccatgca gaacagaatc cagattgacc ctgtgaagct gagctccggg 1560

tacaaagatg tgatcctgtg gttcagcttt ggcgcatcct gcttcatcct gctggccatt 1620

gtgatgggcc tggtgtttat ttgcgtgaag aacggaaata tgcgctgcac aatctgcatt 1680

taa 1683

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atcagttacg atcggatcgg tttagtaata gccacaccca caattgacct aggtcaatat 540

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aatgaagtac tttaatcggt ctttatttat ttttctcacc ccaatcttat ccatcgcgac 660

ctcagaaatt aaattaccaa atgtgacagc gcgagaaatt gtttcgggca tacagctatc 720

cgaagacgag acgacatttt ac 742

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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