本發明涉及一種促進畢赤酵母產堿性果膠酶的方法，屬于發酵工程技術領域。

背景技術：

果膠酶是一種復合酶，能夠將果膠聚合物分解成不飽和寡聚半乳糖醛酸。該酶分布廣泛，在部分寄生線蟲、植物和微生物內都有發現。果膠酶應用廣泛，已有40多年的工業應用史。根據最適反應pH的不同將果膠酶分為酸性果膠酶和堿性果膠酶PGL。其中酸性果膠酶主要應用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果實脫皮等方面。PGL應用主要應用于紡織、食品、造紙行業和環境領域。應用酶法作用上述領域相關反應具有環保、節約原料耗材和反應條件溫和等優點。然而目前對PGL進行分子改造研究較少，進行商品化的PGL也很少。

目前表達堿性果膠酶的宿主主要是畢赤酵母、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌。雖然通過發酵優化等手段可以有效提高堿性果膠酶的產量，但當達到一定限度堿性果膠酶的產量不能進一步提高，限制了堿性果膠酶的工業化生產，因此需從源頭解決限制堿性果膠酶表達的因素。

畢赤酵母宿主雖然具有表達蛋白易于純化等優點，然而目前的堿性果膠酶在畢赤酵母中表達時，存在表達量不高或者是外源基因原始核苷酸序列并不十分適合于畢赤酵母宿主的問題，從而限制了堿性果膠酶在畢赤酵母中的高效表達，酵母真核表達系統中存在的糖基化現象對堿性果膠酶的高效表達及性質存在極大影響。

因此，有必要對堿性果膠酶糖基化情況進行處理，進一步提高堿性果膠酶生產菌株的生產能力。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發明提供了一種有效促進堿性果膠酶在畢赤酵母中高效表達的方法，以抑制堿性果膠酶分泌過程中的糖基化現象。所述方法是在畢赤酵母培養基中添加衣霉素；所述畢赤酵母為表達堿性果膠酶基因的重組畢赤酵母。

在本發明的一種實施方式中，所述重組畢赤酵母以pPIC9K為表達載體，以Pichia pastoris GS115為宿主表達堿性果膠酶基因。

在本發明的一種實施方式中，所述重組畢赤酵母為畢赤酵母GS115-pPIC9K-PGL。

在本發明的一種實施方式中，衣霉素添加量為10～40μg/mL。

在本發明的一種實施方式中，所述衣霉素的添加濃度為20μg/mL。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是將畢赤酵母在含有以甲醇為誘導劑的BMMY培養基中，22-28℃，220rpm下培養。

在本發明的一種實施方式中，每24h向培養基中添加終濃度為10～20mL/L的甲醇。

在本發明的一種實施方式中，所述誘導表達前經過活化；所述活化是將畢赤酵母接種至BMGY培養基，于30℃、220rpm條件下培養24h。

在本發明的一種實施方式中，所述BMGY培養基每L含有如下成分：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油40g，YNB 13.4g，pH6.0的0.1mol的磷酸鹽緩沖液。

在本發明的一種實施方式中，所述BMMY培養基每L含有如下成分：蛋白胨20g，酵母粉10g，7-10％甲醇，YNB 13.4g，pH6.0的0.1mol的磷酸鹽緩沖液。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是將重組畢赤酵母活化后接種至生長培養基BMGY中于30℃、220rpm條件下培養24h，然后再轉接入誘導培養基BMMY中，于22-28℃，220rpm條件下搖瓶發酵，誘導堿性果膠酶的表達。

在本發明的一種實施方式中，所述活化是接種于種子培養基YPD中培養14h；再以體積分數10％的接種量轉入生長培養基BMGY。

在本發明的一種實施方式中，所述誘導培養基BMMY中分別添加濃度為1、5、10、20、40μg/mL的衣霉素，誘導過程中每24h添加終濃度10～20mL/L的甲醇。

本發明還提供所述方法在食品、紡織、環境或造紙方面的應用。

本發明的有益效果：通過添加不同濃度衣霉素，堿性果膠酶的分泌水平有較明顯的提升，當衣霉素濃度為20μg/mL堿性果膠酶產量最高，酶活為592.21U/ml較未添加衣霉素的對照酶活提高79.82％，極大的促進堿性果膠酶在畢赤酵母中的表達，且熱穩定性有所提升，55℃保溫30min的殘余酶活由51.82％提升至57.20％。本發明得到的堿性果膠酶可在堿性條件下催化通過反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷鍵裂解，廣泛應用于食品、紡織和造紙等行業。

說明書附圖

圖1為添加不同濃度衣霉素對PGL糖基化程度及分泌的影響；泳道1-6分別為K314Mopt添加0、1、5、10、20、40μg/mL衣霉素；

圖2為添加不同濃度衣霉素對PGL胞外酶活及菌體生長的影響。

具體實施方式：

培養基：

種子培養基YPD(1L)：胰蛋白胨20g、酵母粉10g、葡萄糖20g。

生長培養基1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油40g，YNB 13.4g，pH6.0的0.1M的磷酸鹽緩沖液。

誘導培養基(1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，甲醇9％，YNB 13.4g，pH6.0的0.1M的磷酸鹽緩沖液。

堿性果膠酶酶活測定采用分光光度法：

樣品預處理：發酵液8000rpm離心10min，胞外PGL即包含于發酵上清液之中，取一定量做檢測。

酶活力檢測：PGL反應體系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-NaOH緩沖液(0.2mol·L^-1，0.44mmol·L^-1的CaCl₂，pH9.4)2mL，待測樣品20μL，無活性的酶液為空白對照。PGL反應條件為：將反應體系置于45℃下水浴15min，用3mL磷酸溶液(0.03mol·L^-1)終止反應，在235nm處測定吸光度值。

單位酶活定義：單位時間裂解聚半乳糖醛酸產生1μmol的不飽和聚半乳糖醛酸所用的酶量。

實施例1

選用碧云天SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒配制12％分離膠和5％濃縮膠，具體操作方法見產品說明書。樣品與5×上樣緩沖液以體積比4:1混合，沸水浴10min，冷卻后上樣。電泳時，80V恒壓電壓，待指示劑進入分離膠后，電壓調至150V，待指示劑至膠底時結束電泳。用考馬斯亮藍染色液對凝膠進行染色，染色1h后脫色(SDS-PAGE圖譜見附圖1)。

SDS-PAGE結果如圖1所示，從圖中可以看出，當衣霉素添加濃度逐漸增加時，PGL蛋白條帶逐漸下移蛋白大小逐漸變小，表明糖基化程度越來越低；同時當衣霉素濃度從0-20μg/mL不斷增加時，在相同點樣量條件下蛋白條帶逐漸加粗，說明添加一定濃度的衣霉素可以有效促進PGL的分泌。

實施例2

培養方法：菌株在種子活化后接種到基本發酵培養基YPD，于30℃、220rpm條件下培養14h，以10mL菌液/100mL培養基的接種量轉接至優化后的生長培養基BMGY培養基于30℃、220rpm條件下培養24h，再將菌株轉入誘導培養基BMMY中22-28℃、220rpm，每24h添加終濃度為10-20mL/L的甲醇，誘導堿性果膠酶的表達。

其中BMMY培養基中分別添加濃度為0、1、5、10、20、40μg/mL衣霉素。

衣霉素對PGL酶活的影響如圖2所示，通過添加不同濃度衣霉素，堿性果膠酶的分泌水平有較明顯的提升，當衣霉素添加濃度0、1、5、10、20μg/mL逐漸增加，堿性果膠酶的產量也不斷提高，當衣霉素濃度為20μg/mL堿性果膠酶產量最高，酶活為592.21U/ml較未添加衣霉素的對照酶活提高79.82％，極大的促進堿性果膠酶在畢赤酵母中的表達，當衣霉素添加濃度為40μg/mL時，由于衣霉素抑制了菌體的生長，因此酶活反而較添加濃度為20μg/mL時有所下降。

實施例3

培養方法：菌株在種子活化后接種到基本發酵培養基YPD，于30℃、220rpm條件下培養14h，以10mL菌液/100mL培養基的接種量轉接至優化后的生長培養基，于30℃、220rpm條件下培養24h，再將菌株轉入誘導培養基BMMY中22-28℃、220rpm，每24h添加終濃度10～20mL/L的甲醇，誘導堿性果膠酶的表達。

其中BMMY培養基中分別添加濃度為0、1、5、10、20、40μg/mL衣霉素，將培養96h的發酵液離心，在55℃保溫30min，測定殘余酶活，結果如表1所示。

表1添加不同濃度衣霉素對PGL熱穩定性的影響。

從表1可以看出，添加衣霉素可以有效提高PGL熱穩定性，添加不同濃度衣霉素時PGL在55℃保溫30min后的殘余酶活均有所提高，當衣霉素添加濃度為20μg/mL時，PGL55℃保溫30min后的殘余酶活由51.82％提高至57.20％，當衣霉素添加濃度為10μg/mL時，PGL55℃保溫30min后的殘余酶活更是由51.82％提高至64.77％，熱穩定性提高十分明顯。

實施例4

實施方式同實施例2，其區別在于以60μg/mL濃度將衣霉素加入至BMMY培養基中，發酵96小時后對發酵液中堿性果膠酶含量進行測定，結果顯示PGL酶活下降嚴重，由添加40μg/mL時的579.85U/mL下降至403.25U/mL，較最高產量592.21U/mL下降了31.9％。這可能是由于太高的衣霉素添加濃度，嚴重抑制了宿主細胞的生長，細胞干重由26.0g/L下降至21g/L左右。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。