本發明屬于家禽生物制品研發技術領域，具體涉及一種H5亞型禽流感病毒的增殖方法。

背景技術：

2003年以來，高致病性禽流感病毒在我國和世界許多國家廣泛流行，不僅給養禽業造成巨大的損失，同時對人類的健康也構成了巨大的威脅。為了更好的預防禽流感病毒的傳播，農業部批準8家企業進行H5亞型禽流感疫苗的生產。現在禽流感病毒的繁殖方法主要是依靠雞胚進行，提高病毒含量主要通過濃縮的方法實現，但濃縮也明顯提高了產品的成本，增加了污染的幾率。因此，提高制苗用毒株的病毒含量才能保證疫苗優質高效。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種H5亞型禽流感病毒的增殖方法，能夠有效的提高尿囊液中病毒的含量，從而彌補現有技術的不足。

本發明的H5亞型禽流感病毒的增殖方法，包括如下的步驟：

1)取H5亞型禽流感病毒用病毒稀釋液進行稀釋后接種10日齡的SPF雞胚，在36℃培養，然后收獲72h未死亡雞胚的尿囊液，收集尿囊液，置-40℃保存；

所述的H5亞型禽流感病毒，為Re-6、Re-7、Re-8株中的任一種或幾種；

所述的病毒稀釋液，是添加氨基酸混合物和維生素混合物的磷酸緩沖液；

其中氨基酸混合物的配比如下：40％天冬氨酸、30％脯氨酸、30％谷氨酰胺；

維生素混合物的配比如下：40％維生素B3、30％維生素B1和30％維生素B7。

所述的磷酸緩沖液的一種配比如下：NaH₂PO₄·2H₂O 1.56g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，Nacl 9g，加水至1000ml；

作為實施例的優選，在病毒稀釋液中氨基酸混合物的質量百分比為0.3％，維生素混合物的質量百分比為0.5％；

2)將步驟1)收集的尿囊液再用病毒稀釋液進行10倍倍比稀釋，選取10^-6～10^-9范圍稀釋度的病毒液接種10日齡SPF雞胚，置35.5℃培養，收獲72h未死亡胚尿囊液，再取高稀釋度且HA效價最高的尿囊液混合后作為種子液。

3)按照步驟3)的方法對步驟2)收集的種子液連續傳代4次，再取高稀釋度且HA效價為10log2、9log2、10log2的尿囊液混合，獲得最終制備疫苗用的病毒液；

本發明方法制備的病毒液，可以不經過濃縮就直接來制備疫苗：

所述的疫苗制備方法如下：

1)油相制備：取獸用白油95份，硬脂酸鋁1份，置于油相制備罐中加熱至80℃后，再加5份的司本-80，至溫度達到115℃時，維持30min，冷卻后備用；

2)水相制備：將病毒液滅活后加入水相中，取滅菌后的5份吐溫-80，加入配液罐中，同時加入病毒液95份，攪拌20～30min，使吐溫-80完全溶解；

3)乳化：取油相2份放于高速剪切機內，開動電機慢速轉動攪拌，同時加入水相1份，以10000r/min，乳化5分鐘，乳化后，取10ml，以3000r/min離心15分鐘完成制備。

本發明提供一種禽流感病毒增殖方法及利用該方法制備的禽流感疫苗，旨在節約疫苗制備成本，提高生產效率，從而克服現有制苗用毒株病毒含量比較低，制備多聯多價疫苗需要濃縮才能達到單苗的技術缺陷。

具體實施方式

申請人在研究中發現，將氨基酸和維生素添加到磷酸溶液中制成的病毒稀釋液可提高病毒的增殖效果。用該稀釋液稀釋病毒后進行病毒的增殖、純化，可使病毒含量提高7～10倍，無需濃縮即可實現多聯多價疫苗的生產，免疫效果也很顯著；從而促成了本發明。

本發明用了3株禽流感的病毒毒株，分別為Re-6、Re-7、Re-8株。這3株病毒經過純化后獲得HA效價高、免疫原性好的病毒株，純化后Re-6、Re-7、Re-8株的病毒含量分別為10^8.5EID₅₀/0.1ml、10^8.38EID₅₀/0.1ml、10^8.5EID₅₀/0.1ml；HA效價分別為10log2、9log2、10log2。其中Re-6、Re-7、Re-8株是目前用作制備H5亞型禽流感病毒疫苗的常用病毒株。

下面結合具體實施例對本發明進行詳細的描述。

實施例1

本實施例的禽流感病毒增殖方法，包括如下的步驟：

1、病毒稀釋液的配制：每1000ml磷酸緩沖液中加氨基酸組合3g、維生素組合5g，0.22um濾器過濾除菌，備用。

pH7.0的磷酸緩沖液配方為：NaH₂PO₄·2H₂O 1.56g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，Nacl 9g，加水至1000ml。

氨基酸組合配方為：天冬氨酸40％、脯氨酸30％和谷氨酰胺30％。

維生素組合配方為：維生素B1 30％、維生素B3 40％和維生素B7 30％。

2、病毒的擴繁，方法如下：

1)取Re-6、Re-7、Re-8株，分別用上述稀釋液作10000倍稀釋后接種10日齡SPF雞胚，0.1ml/枚，置36℃培養，收獲72h未死亡胚尿囊液，收集尿囊液，測定HA分別為8log2、8log2、8log2，均標記為E0，置-40℃保存；

2)病毒無限稀釋法純化：將繁殖后病毒液用上述稀釋液進行10倍倍比稀釋，選取10^-6～10^-9 4個稀釋度的病毒液接種10日齡SPF雞胚10枚，0.1ml/枚，置35.5℃培養，收獲72h未死亡胚尿囊液，再取高稀釋度且HA效價高(分別為9log2、9log2、9log2)的尿囊液混合后作為基礎種子，標記為E1。

3)將得到的基礎種子E1代按照步驟2)方法連續傳代4代(標記為E2～E5)后，獲得HA效價為10log2、9log2、10log2的尿囊液，經測定病毒含量為10^8.5EID₅₀/0.1ml、10^8.38EID₅₀/0.1ml、10^8.5EID₅₀/0.1ml，置-40℃保存；

增殖病毒及與原毒對比試驗：

將步驟3)得到的尿囊液和未用本實施例方法擴繁的病毒分別用上述稀釋液適當稀釋后，分別接種10日齡非免疫雞胚100枚，0.1ml/枚，置35.5℃培養，收獲72h未死亡胚的尿囊液，測定半成品HA效價及病毒含量。

由上述結果可見，用本發明方法純化后的毒株，經測定，其病毒含量比未純化前高7-10倍。本發明的方法應用上述3株禽流感病毒進行試驗，證明該方法純化禽流感病毒的重復性好很好。

實施例2

將上述收獲后的病毒液分別制備疫苗進行免疫效力對比試驗

(一)抗原液準備

1、實施例1中擴繁純化前的病毒液各100ml。

2、實施例1中擴繁純化前的病毒液各300ml濃縮至100ml。

3、實施例1中擴繁純化后的病毒液各100ml。

(二)抗原液病毒含量測定將(一)抗原液分別測定HA效價及EID₅₀。由試驗結果可見，未純化的病毒液即使濃縮3倍其病毒含量也很難達到純化后的病毒的病毒含量。

(三)抗原液的滅活將上述病毒液分別用0.05％的甲醛溶液滅活16小時，置2～8℃保存。經滅活檢驗合格后進行疫苗制備。

(四)疫苗制備

1、油相制備：取獸用白油95份，硬脂酸鋁1份，置于油相制備罐中加熱至80℃后，再加5份的司本-80，至溫度達到115℃時，維持30min，冷卻后備用；

2、水相制備：將滅活的三種病毒液加入水相中，取滅菌后的5份吐溫-80，加入配液罐中，同時加入病毒液95份，攪拌20～30min，使吐溫-80完全溶解；

3、乳化：取油相2份放于高速剪切機內，開動電機慢速轉動攪拌，同時徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分鐘制備。

結果表明，免疫效力由高到低依次為純化后的病毒液制備疫苗、未純化病毒液濃縮3倍制備疫苗、未純化病毒原液制備疫苗。