本發明涉及一種乳酸菌生產β-甘露聚糖酶的方法。
背景技術：
β-甘露聚糖酶(β-mannanase，簡稱甘露聚糖酶，EC3.2.1.78)，是能夠專一性水解含β-1,4-甘露糖苷鍵的甘露多糖的內切水解酶，屬于半纖維素酶類。甘露聚糖酶在工業尤其是食品行業有廣泛用途，如用于果汁澄清進而提高出汁率；含有2-10個殘基的降解產物，即寡聚糖可促進人體腸道益生菌生長等。微生物甘露聚糖酶具有來源廣、活性高、作用條件溫和等優點，是基礎研究及工業應用的最重要來源。產甘露聚糖酶酶微生物類群主要是真菌中的霉菌和細菌中的芽孢桿菌，但往往因為發酵周期長或生物安全性差等原因，限制了工業化生產規模和應用領域。
乳酸菌是一類發酵糖類產生乳酸的無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。乳酸菌在自然界中分布廣泛，具有多種生態學功能。更重要的是，人體中的乳酸菌，具有改善腸胃功能、調節菌群平衡、抑制膽固醇吸收、抗腫瘤預防癌癥、消除自由基抗衰老等作用，積極的生理學意義和益生功能不容忽視。
魔芋是多年生天南星科草本根莖植物，主要產自東南亞地區。世界范圍內，我國是魔芋種植量最大的國家。因此，以魔芋為原料制成的粉末魔芋粉，廉價易得。魔芋粉中富含葡甘聚糖，是微生物胞外甘露聚糖酶的理想碳源。
目前，真菌產甘露聚糖酶發酵周期較長，細菌產甘露聚糖酶存在生物安全隱患，乳酸菌產甘露聚糖酶的活性較低。
技術實現要素：
本發明是要解決現有真菌產甘露聚糖酶發酵周期較長，產甘露聚糖酶細菌存在生物安全隱患，乳酸菌產甘露聚糖酶活性較低的問題，提供一種利用魔芋粉為碳源培養乳酸菌生產β-甘露聚糖酶的方法。
本發明利用魔芋粉為碳源培養乳酸菌生產β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步驟：
一、將-80℃保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)HDRS1接種于MRS固體培養基平板上，25～32℃恒溫靜置倒置培養36～60小時；
二、挑取單菌落至MRS液體培養基中，25～32℃、120～180rpm振蕩培養24～48小時；
三、5000～9000轉/分離心10～15分鐘，棄上清收集菌體，以空白液體MRS培養基調整細胞濃度至108個/mL，作為種子液；
四、以1％～3％(v/v)接種量將種子液接入發酵培養基，30℃、140rpm振蕩培養36～48小時，得發酵液；
五、將發酵液于5000～9000轉/分離心10～15分鐘，棄菌體，上清即為甘露聚糖酶粗酶液。
步驟一所述MRS固體培養基配方為：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐溫800.1mL/100mL、磷酸氫二鉀0.2g/100mL、乙酸鈉0.5g/100mL、檸檬酸三銨0.2g/100mL、硫酸鎂0.02g/100mL、瓊脂2g/100mL和蒸餾水，pH值6.0-6.5。
步驟二所述MRS液體培養基配方為：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐溫800.1mL/100mL、磷酸氫二鉀0.2g/100mL、乙酸鈉0.5g/100mL、檸檬酸三銨0.2g/100mL、硫酸鎂0.02g/100mL和蒸餾水，pH值6.0-6.5。
步驟四所述發酵培養基配方為：魔芋粉1g/100m、蛋白胨1g/100mL、吐溫80 0.1mL/100mL、磷酸氫二鉀0.2g/100mL、乙酸鈉0.5g/100mL、檸檬酸三銨0.2g/100mL、硫酸鎂0.02g/100mL和蒸餾水pH值6.0-6.5。
本發明中甘露聚糖酶活性測定方法為改良的DNS法：以pH 4.0檸檬酸緩沖液配制0.5％去除還原糖的魔芋粉溶液為反應底物。取發酵液上清2mL，加入2mL反應底物，50℃保溫15分鐘。加入DNS試劑3mL，沸水浴中煮沸5分鐘，冷卻后加蒸餾水補足體積至25mL。540nm下測定吸光度值，計算還原糖量。一個酶活單位以每分鐘產生1微摩爾甘露糖計。
本發明制備的甘露聚糖酶粗酶液，酶活為100-200U/mL。
步驟一所述植物乳桿菌HDRS1為乳桿菌屬細菌，2009年4月13日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，編號：CCTCC M209069，已在專利“一種工業發酵酸菜的方法”(授權公告號101697751B)中公布。
本發明的有益效果：
本發明首次提出以植物乳桿菌為出發菌株，以魔芋粉為唯一碳源發酵生產甘露聚糖酶，以液態發酵工藝培養乳酸菌生產甘露聚糖酶，制備含有高活性甘露聚糖酶的粗酶液。
乳酸菌是公認的益生菌，植物乳桿菌也包含在內。以植物乳桿菌生產甘露聚糖酶，可以解決目前產酶微生物帶來的生物安全隱患，大大拓展含有該菌株的甘露聚糖酶粗酶液的應用范圍，如食品、飼料和保健品領域。
本方法首次提出已魔芋粉作為植物乳桿菌產甘露聚糖酶的發酵底物。相比培養乳酸菌用的碳源葡萄糖，顯著降低了成本。因為魔芋粉在我國種植廣泛，廉價易得。以魔芋粉為唯一碳源供給植物乳桿菌HDRS1發酵產甘露聚糖酶，使得該方法的工業化應用成為可能。
本發明方法獲得的粗酶液中，甘露聚糖酶活性高達100-200U/mL。與真菌發酵產甘露聚糖酶相比，本方法縮短了發酵周期。本發明中植物乳桿菌HDRS1發酵周期僅需1.5～2天，而通常真菌產甘露聚糖酶發酵周期需要4～7天。
綜上，本發明拓展了產甘露聚糖酶的微生物來源，確保了生物安全性因為拓展了應用范疇，生產成本低，周期短，生產菌株無生物安全隱患，且本發明方法生產的粗酶液酶活顯著高于現有報道。對于拓展產甘露聚糖酶的微生物來源，深入挖掘乳酸菌應用范疇具有重要意義。
具體實施方式
本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。
具體實施方式一：本實施方式利用魔芋粉為碳源培養乳酸菌生產β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步驟：
一、將-80℃保存的植物乳桿菌HDRS1接種于MRS固體培養基平板上，25～32℃恒溫靜置倒置培養36～60小時；
二、挑取單菌落至MRS液體培養基中，25～32℃、120～180rpm振蕩培養24～48小時；
三、然后于5000～9000轉/分離心10～15分鐘，棄上清收集菌體，以空白液體MRS培養基調整細胞濃度至108個/mL，作為種子液；
四、以1％～3％接種量將種子液接入發酵培養基，30℃、140rpm振蕩培養36～48小時，得發酵液；
五、將發酵液于5000～9000轉/分離心10～15分鐘，棄菌體，上清即為甘露聚糖酶粗酶液。
步驟一所述植物乳桿菌HDRS1為乳桿菌屬細菌，2009年4月13日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，編號：CCTCC M209069。
具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一所述MRS固體培養基配方為：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐溫80 0.1mL/100mL、磷酸氫二鉀0.2g/100mL、乙酸鈉0.5g/100mL、檸檬酸三銨0.2g/100mL、硫酸鎂0.02g/100mL、瓊脂2g/100mL和蒸餾水，pH值6.0-6.5。其它與具體實施方式一相同。
具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：步驟一中28～31℃恒溫靜置倒置培養40～55小時。其它與具體實施方式一或二相同。
具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：步驟一中30℃恒溫靜置倒置培養48小時。其它與具體實施方式一或二相同。
具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是：步驟二所述MRS液體培養基配方為：葡萄糖1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐溫80 0.1mL/100mL、磷酸氫二鉀0.2g/100mL、乙酸鈉0.5g/100mL、檸檬酸三銨0.2g/100mL、硫酸鎂0.02g/100mL和蒸餾水，pH值6.0-6.5。其它與具體實施方式一至四之一相同。
具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：步驟二中于28～31℃、130～160rpm振蕩培養30～40小時。其它與具體實施方式一至五之一相同。
具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：步驟二中于30℃、140rpm振蕩培養24小時。其它與具體實施方式一至五之一相同。
具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一至七之一不同的是：步驟三中于8000轉/分離心10～15分鐘。其它與具體實施方式一至七之一相同。
具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式一至八之一不同的是：步驟四中以2％接種量將種子液接入發酵培養基。其它與具體實施方式一至八之一相同。
具體實施方式十：本實施方式與具體實施方式一至九之一不同的是：步驟四所述發酵培養基配方為：魔芋粉1g/100mL、蛋白胨1g/100mL、吐溫80 0.1mL/100mL、磷酸氫二鉀0.2g/100mL、乙酸鈉0.5g/100mL、檸檬酸三銨0.2g/100mL、硫酸鎂0.02g/100mL和蒸餾水pH值6.0-6.5。其它與具體實施方式一至九之一相同。
具體實施方式十一：本實施方式與具體實施方式一至十之一不同的是：步驟五中將發酵液于8000轉/分離心10～15分鐘。其它與具體實施方式一至十之一相同。
下面對本發明的實施例做詳細說明，以下實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方案和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1：本實施例利用魔芋粉為碳源培養乳酸菌生產β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步驟：
一、將-80℃保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)HDRS1接種于MRS固體培養基平板上，30℃恒溫靜置倒置培養48小時；
二、挑取單菌落至MRS液體培養基中，30℃、140rpm振蕩培養24小時；
三、然后于8000轉離心10分鐘，棄上清收集菌體，以空白液體MRS培養基調整細胞濃度至108個/mL，作為種子液；
四、以2％(v/v)接種量將種子液接入發酵培養基，30℃、140rpm振蕩培養72小時，得發酵液；
五、將發酵液于8000轉離心10分鐘，棄菌體，上清即為甘露聚糖酶粗酶液。
步驟一所述植物乳桿菌HDRS1為乳桿菌屬細菌，2009年4月13日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，編號：CCTCC M209069。
本方法中甘露聚糖酶活性測定方法為改良的DNS法：以pH 4.0檸檬酸緩沖液配制0.5％去除還原糖的魔芋粉溶液為反應底物。取發酵液上清2mL，加入2mL反應底物，50℃保溫15分鐘。加入DNS試劑3mL，沸水浴中煮沸5分鐘，冷卻后加蒸餾水補足體積至25mL。540nm下測定吸光度值，計算還原糖量。一個酶活單位以每分鐘產生1微摩爾甘露糖計。
本實施例制備的粗酶液甘露聚糖酶活力為195.6U/mL。
本實施例以廉價原料魔芋粉為唯一碳源培養基，以植物乳桿菌為生產菌株，發酵生產甘露聚糖酶。該方法生產成本低、發酵周期短僅為1.5天、生產菌株無生物安全隱患。