專利名稱：一種用預培養方式提高乳酸菌凍干活性的方法
技術領域：
一種用預培養方式提高乳酸菌凍干活性的方法，屬于酸奶凍干發酵劑、乳酸菌活菌制劑技術領域。
背景技術：
由于成本和工業化方面的問題，菌體收集最常用的方法是離心分離法，即借助離心機的離心力作用使菌體沉積，目的就是將菌體與培養基和代謝產物分開，且要盡可能減少對菌體的損傷，此類方法簡便、快速、處理量大，適合商業化生產。菌體經過富集培養、離心收集和保護劑懸浮后，一般采取的措施就是迅速于低溫下預凍，預凍一定時間后就開始冷凍干燥。從保護劑懸浮菌體到預凍這一步，可以做的工作很多Broadbent等指出將乳酸乳球菌置于10℃冷激2h，能提高細胞凍融后的存活率。國內關于這方面的研究才剛起步，東北農大的張蘭威等人發表過一篇綜述。國外有文獻報道的也僅限于對大腸桿菌和一些嗜溫乳酸菌關于冷激方面的研究。關于德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌這兩種常用于酸奶發酵劑菌種進行預培養的研究還未見諸報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種用預培養方式提高乳酸菌凍干活性的方法，在菌體經過富集培養，離心收集和保護劑懸浮后，先不置于低溫下預凍，而是把懸浮菌體重新送回一定溫度培養一定時間，然后再冷凍干燥。本發明把這種處理方法稱為預培養。預培養對前面的離心收集過程使菌體造成的損傷有修復作用，所以能提高乳酸菌凍干活性。本發明根據微生物的生理代謝特點，引入了預培養的思路，最大限度的挖掘凍干酸奶發酵劑活性提高的關鍵控制點。
本發明的技術方案酸奶發酵劑主要由德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)兩種菌構成。將這兩種菌分別或按照1∶1的配比以2％接入發酵培養基中培養，用常規方法經過富集培養，離心后收集菌體，加入保護劑懸浮，保護劑的用量是菌體濕重量的10-15倍，加保護劑懸浮后的乳酸菌菌體于4℃放置平衡30min，在30-45℃溫度下，經過30-120min時間的預培養后，再進行冷凍干燥。
本發明所用乳酸菌菌種為德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus)CTCC6047、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)CTCC6038或以上兩個菌種按質量比1∶1混合菌種。
本發明所用保護劑為8g脫脂奶粉、2g甘油、0.5g酵母膏，加水100mL充分混合溶解。
本發明所用保護劑應于115℃、15min條件下滅菌，滅菌后置于37℃下培養三天，確認無菌后才能使用。
預培養的溫度優選為42℃，預培養的時間優選為60分鐘，本方法也適用于乳酸菌活菌制劑或酸奶發酵劑。
本發明的有益效果采用預培養方式可以修復離心過程中對菌體造成的損傷，所以能提高乳酸菌凍干活性。本發明對于用作酸奶發酵劑乳酸菌，可以縮短凝乳時間。菌體經過預培養過程，由冷凍干燥前的不活躍狀態又能回復到富集培養后的相對活躍狀態。所選菌株最適預培養溫度為42℃，最適預培養時間為60min。將此種狀態的菌體凍干后，菌體活性顯著提高，凝乳時間比對照組縮短25min。
菌體用保護劑懸浮后不能馬上冷凍，保護劑與菌體細胞平衡需要一段時間。保護劑與菌體在4℃放置30min以上平衡完成。
經過穩定性實驗表明，預培養的細胞穩定性比對照組要好。前者于4℃的條件下貯藏90天后，凝乳時間損失36％；而對照組損失62％。
具體實施例方式
實施例1菌種由德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)CTCC6047和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)CTCC6038兩種菌按照1∶1的配比以2％接入發酵培養基中培養，用常規方法經過富集培養，離心后收集菌體，加入上述保護劑懸浮，于4℃放置平衡30min后進行預培養。預培養溫度分別選擇20℃，30℃，42℃，55℃，預培養時間分別選擇1小時，2小時，3小時，進行初選，分別考察培養過程中pH和菌數的變化；考察預培養處理后的細胞經凍干后的成活率和凝乳時間。結果表明菌體在20℃這個生長溫度，各項指標很接近，pH和菌數都無變化，隨著時間的延長，pH會看出些變化，但很微弱，這證明20℃下菌體只有微弱的代謝。55℃為菌體生長的上限，也沒有代謝，而且菌體數量隨著時間的延長遞減，這證明該溫度對菌體產生嚴重的傷害；30℃作為嗜溫性乳酸菌的最適生長溫度，桿菌和球菌有一定程度的代謝比20℃強，但比42℃弱很多。在這些預培養溫度中，以42℃時的菌體變化最顯著，證明菌體在此溫度下開始變得活躍。但在該溫度下，菌體細胞生長不符合微生物在液體中發酵生長的一般規律，菌體數量從3h后開始下降，而在正常的液體發酵時，乳酸菌在這段時間正處于生長旺盛的對數期。分析原因可能是由于在如此一種體系中，細胞密度過大，營養成分的構成、滲透壓等都不如10％的牛奶中好，隨著時間的延長，有害代謝產物積累增多，很快就到了不適合菌體生長的程度。
20℃時菌體處于休眠狀態，菌體沒有發生變化，存活率隨著時間的延長仍維持在初始狀態的值71％，但由于3h后菌體休眠時間過長，菌體趨于不活躍，所以凍干后的凝乳時間延長5min。
30℃預培養的結果在存活率方面表現得較好，預培養3h時的存活率達到83％，比任何對照組都高。這可能是菌體細胞在此低溫下產生的應激反應，體內或細胞膜產生了抵御冷凍、干燥等損傷的脂肪酸、蛋白質，這印證了國外大部分學者的報道，Mary等曾將這種應激狀態產生的蛋白質分離出來。在42℃(最適生長溫度)下，預培養1h左右的存活率僅次于30℃3h的值，達到81％。但預培養3h后的存活率較低，只有68％。這可能是由于42℃預培養菌體代謝旺盛，在如此一種高菌體濃度的環境下，環境很快變得不適應菌體生長，代謝產物對菌體產生了損傷，所以2h后存活率開始下降。最重要的發現是42℃預培養的細胞凍干后，比其他組的凍干活性要大得多，預培養1h的凝乳時間只有185min，比對照組不經過預培養的細胞要快25min，這表明經過42℃預培養的細胞，單個細胞的凍干活性得到了加強，印證了預培養設計的思路。
42℃被選擇作為最佳預培養溫度，再在此溫度下對預培養時間做一個優化，選擇能使菌體細胞達到最大凍干活性的預培養時間。將懸浮菌體于42℃分別預培養0、30、60、90、120、150min后測培養過程中pH和菌數的變化。凍干后測活性和存活率。
表1 42℃預培養時間對菌體凍干活性的影響
由上表可知，在42℃預培養過程中，菌體數量的變化很微小，從0min到120min菌體數量僅由2.6×109cfu/ml增加到3.0×109cfu/ml。繼續培養，則菌體數量會下降，150min后，菌體水平下降到初始濃度2.6×109cfu/ml。這可能是由于在此體系中，細胞密度過大，營養成分的構成、滲透壓等都不如10％的牛奶中好，所以生長代謝相對微弱。至于pH為什么變化快，可能是能量代謝仍然可以順利進行的緣故。在活性方面，預培養到60min凍干后的凝乳時間為185min，活性最強。隨著預培養時間的延長，菌體周圍的環境惡化，菌體受到損傷，所以90min以后的細胞凍干活性開始下降。
綜上所述，從存活率、凝乳時間等綜合考察，選擇預培養溫度范圍為30-45℃，優選為42℃；預培養時間為30-120分鐘，優選為60分鐘。
權利要求
1.一種提高乳酸菌凍干活性的方法，其特征是經過富集培養，離心收集乳酸菌菌體后用保護劑懸浮，保護劑的用量是菌體濕重量的10-15倍，加保護劑懸浮后的乳酸菌菌體在4℃放置30分鐘平衡，在30-45℃溫度下，經過30-120分鐘的預培養后，再進行冷凍干燥。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是所用乳酸菌為德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)CTCC6047、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)CTCC6038或以上兩個菌種按質量比1∶1混合菌種。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是所用保護劑為8g脫脂奶粉、2g甘油、0.5g酵母膏，加水100mL充分混合溶解。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征是保護劑應于115℃、15分鐘條件下滅菌，滅菌后置于37℃下培養三天，確認無菌后才能使用。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征是預培養的溫度優選為42℃。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征是預培養的時間優選為60分鐘。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征是本方法適用于乳酸菌的活菌制劑或酸奶發酵劑。
全文摘要
一種用預培養方式提高乳酸菌凍干活性的方法，屬于酸奶凍干發酵劑、乳酸菌活菌制劑技術領域。本發明將凍干前的乳酸菌菌體與保護劑混合，在4℃放置30分鐘平衡，再在一定溫度下，經過一定時間的預培養，然后再冷凍干燥貯藏。與傳統的不經預培養的凍干方法相比較，經過富集培養，離心收集和保護劑懸浮后，先不置于低溫下預凍，而是把懸浮菌體重新送回一定溫度培養一定時間，然后再冷凍干燥。預培養對前面的離心收集過程使菌體造成的損傷有修復作用，所以能提高乳酸菌凍干活性。本發明引入了預培養的思路，用這種方法可以提高凍干酸奶發酵劑、乳酸菌活菌制劑的活性。
文檔編號C12R1/46GK1724648SQ20051004049
公開日2006年1月25日 申請日期2005年6月11日 優先權日2005年6月11日
發明者趙建新, 陳衛, 田豐偉, 張灝, 潘巧, 黃文利 申請人:江南大學