本發明屬生命科學和生物
技術領域：
，是一種檢測MED1基因啟動子甲基化狀態的引物和檢測方法。
背景技術：
：MED1基因編碼的MED1蛋白(Methyl-CpGBindingDomainProtein4又稱甲基化CpG結合域蛋白4)。MED1蛋白有兩個功能區域。氨基末端的5-甲基胞嘧啶結合區域(即甲基化CpG結合結構域)結合甲基化或半甲基化的DNA。羧基末端結合區域編碼DNA轉葡糖基酶(糖苷酶)的活性。簡單來說該蛋白由N末端的甲基化CpG結合結構域和C末端的DNA糖苷酶兩個結構域組成。目前，MED1的DNA糖苷酶結構域晶體結構已經得到解析。代謝標記表明該蛋白在體內是一種磷酸化蛋白。MED1是DNA堿基切除修復通路(BaseExcisionRepair，BER)的重要成員之一，是一種重要的切補修復酶。該蛋白通過與甲基化了的DNA結合，修復自發的脫氨基作用而達到維持基因組完整的目的。具體來說，轉葡糖基酶可以特異性地切除DNA序列中甲基化或半甲基化的胞嘧啶(C)和錯配的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，它的這些性質提示在體內它可能通過從DNA上移除5-甲基胞嘧啶(m5C)的脫氨基產物，從而減少m5C的可突變性，維護基因組的穩定性，抑制基因突變，從而減少腫瘤的發生。目前，MED1蛋白和甲基化的DNA的關系的研究已經成為熱點，同樣，對MED1基因自身的甲基化的問題也逐漸成為人們關注的對象。作為一個腫瘤抑制基因，MED1基因的正常的轉錄，翻譯表達的相關蛋白，對基因組完整性的維持，進而在基因水平上抑制腫瘤的發生，發展都有重要意義。甲基化不同于傳統的基因突變等機制，它不涉及DNA堿基對的改變，它是在不改變堿基對序列的前提下在局部堿基上作的基團修飾。這一重要的表觀遺傳學作用機制，一般會影響DNA的mRNA的轉錄，使其下調表達，進而蛋白的翻譯量會減少。而對于抑癌基因來說，抑癌蛋白的下調表達則不能很好的執行抑制腫瘤發生發展的功能，故而腫瘤會發生。J.HarrisonHoward等認為，由于MED1基因的甲基化而導致的基因下調表達和子宮頸癌、結直腸癌、卵巢癌的發病發展有很重要的關系。目前對于MED1啟動子甲基化檢測的常規方法有：甲基化特異性PCR(MSP)、亞硫酸氫鹽焦磷酸測序、甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-HRM)，甲基化特異性PCR(MS-PCR)等。其中MSP法是使用PCR擴增檢測來判斷樣本是否存在甲基化，該法實用且普遍，但假陽性率高，穩定性較差；亞硫酸氫鹽焦磷酸測序因其操作繁瑣，因此不適合大批量檢測；MS-HRM是通過將單堿基序列的差異轉變成熔解曲線的差異，從而判斷是否存在甲基化，這種方法對儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀，同時該法只能分析檢測片段整體甲基化狀態，而不能明確每個CG位點的甲基化狀態；MS-PCR是基于PCR開發的技術，主要是在檢測中加入了TaqMan探針，從而保證了較高的靈敏度和準確度，但其對于多個甲基化位點的檢測，也只能做到整體化分析，同時探針成本較高，因此該法較適用于少數位點大量樣本檢測。技術實現要素：為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是：設計用于檢測MED1基因啟動子甲基化的引物，包括一對特異性擴增兼并引物SEQNO1和SEQNO2，其序列為：SEQNO1：5’-GGYGGATAGYGAGGTTAGGAGTT-3’；SEQNO2：5’-AATCTTACTCTTATCRCCCAAACTAA-3’；所述SEQNO1和SEQNO2同時也為雙向測序引物，R堿基代表A或G，Y堿基代表C或T。本發明提供的另一個技術方案是：用于檢測MED1基因啟動子甲基化的方法，包括：(1)提取樣本中的DNA；(2)將步驟(1)中提取的DNA進行亞硫酸氫鹽處理；(3)以步驟(2)中的DNA作為模板，使用SEQNO1和SEQNO2擴增MED1基因片段，獲得PCR擴增產物；(4)對步驟(3)中獲得的產物測序；(5)根據步驟(4)的測序結果，得到序列CG位點的甲基化結果；其中，PCR擴增反應條件為：第一階段，92-97℃預變性5-15min；第二階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度62-66℃90sec，延伸溫度72℃30sec，循環12-18次，每循環一次，所述退火溫度降低0.5℃；第三階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度53-57℃30sec，延伸溫度72℃30sec，循環24-34次；第四階段，72℃10min；第五階段，擴增反應結束，擴增產物在4℃下保存。所述的測序為Sanger測序，測序引物為：SEQNO1：5’-GGYGGATAGYGAGGTTAGGAGTT-3’；SEQNO2：5’-AATCTTACTCTTATCRCCCAAACTAA-3’；該方法檢測的樣本為石蠟切片樣本、全血樣本、新鮮組織樣本或細胞系樣本。更進一步地，本發明提供一種用于檢測MED1基因啟動子甲基化的試劑盒的技術方案，包括亞硫酸鹽修飾、PCR擴增試劑以及Sanger測序試劑、陽性對照品、陰性對照品，其中：(1)亞硫酸鹽處理試劑包括：BisulfiteMix、RNasefreewater、DNAProtectBuffer；(2)PCR擴增試劑：10*PCRBuffer、2mMdNTP、5*QSolutionBuffer、5U/ulTaq酶、10uM擴增引物(SEQNO1、SEQNO2)以及滅菌水；(3)酶純化試劑：EXOI、CIP；(4)測序試劑：BigdyeTerminatorV3.1、無水乙醇、EDTA、及測序引物(SEQNO1、SEQNO2)。其中，陽性對照品為經過所有胞嘧啶甲基化修飾的全甲基化正常人群血液基因組DNA，陰性對照品為正常人群血液基因組DNA。本發明采用Touch-downPCR擴增和Sanger測序法MED1啟動子甲基化檢測，針對石蠟切片DNA片段化嚴重，在造成亞硫酸氫鹽處理飽和的情況下，仍出現的有效模板濃度很低的情況，Touch-downPCR擴增可確保正、反向擴增引物與樣本DNA模板的結合發生在最互補的序列之間，當退火溫度降低到非特異性擴增發生的水平時，特異性擴增產物在此時已經有一個幾何數的起始優勢，豐度較高，在剩余的擴增反應中，特異性擴增產物與非特異擴增產物產生競爭，但是因非特異性擴增產物豐度較低，特異性擴增產物始終優先擴增，從而產生單一的占主導地位的特異性擴增產物。而Sanger測序法是檢測基因甲基化的金標準，檢測結果準確性高，并且很大程度上地節省了檢測成本。由于DNA序列在經亞硫酸鹽處理后，其部分C堿基會轉變為T，導致序列區域內CG含量和Tm值發生較大程度的變異，進而影響常規引物設計軟件在其序列上獲得理想的引物序列。因此，本發明中PCR采用的擴增引物以及測序引物均為自行設計，經多次試驗篩選出檢測引物，由實驗結果可知引物引發擴增效果良好。其中測序引物使用兼并堿基，從而使得陰性、陽性都可在同一體系擴增。同時，擴增引物的使用比例經過多次優化實驗，相對于其它文獻和軟件設計的引物具備了更加理想的擴增效率。因此，本發明的檢測方法具備了檢測出率高，檢測穩定性好，準確度高以及低污染風險等優勢。檢測結果將有助于預見相關腫瘤疾病的早期，同時具有潛在的指導臨床醫生個體化治療的作用。附圖說明圖1是本發明的檢測基因甲基化的方法檢測標準序列的陰性標準序列。圖2是本發明的檢測基因甲基化的方法檢測標準序列的陽性標準序列。圖3是本發明的檢測基因甲基化的方法檢測第4號樣本的檢測結果，檢測結果為陰性。圖4是本發明的檢測基因甲基化的方法檢測第1號樣本的檢測結果為陽性。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。實施例1MED1基因啟動子區CG島甲基化檢測試劑盒包括一對特異性兼并引物SEQNO1和SEQNO2，同時，此引物為測序引物，其堿基序列如下所示：SEQNO1：5’-GGYGGATAGYGAGGTTAGGAGTT-3’；SEQNO2：5’-AATCTTACTCTTATCRCCCAAACTAA-3’；MED1基因啟動子區CG島甲基化檢測試劑盒還包括如下試劑：(1)亞硫酸鹽處理試劑：BisulfiteMix、RNasefreewater、DNAProtectBuffer；(2)PCR擴增試劑：10*PCRBuffer、2mMdNTP、5*QSolutionBuffer、5U/ulTaq酶、10uM擴增引物(SEQNO1、SEQNO2)以及滅菌水；(3)酶純化試劑：EXOI，CIP；(4)測序試劑：BigdyeTerminatorV3.1，無水乙醇，EDTA，及測序引物(SEQNO1，SEQNO2)。(5)陽性質控品：已確定的MED1基因啟動子區CG島甲基化的DNA。陰性質控品：已確定的MED1基因啟動子區CG島無甲基化的DNA。空白對照品：滅菌水。實施例2DNA提取試劑和方式。取石蠟切片(5-10μm厚，1×1cm2大小)5-8張，將石蠟包埋組織收集到1.5mL離心管內，短暫離心；加入1mL組織透明液，充分振蕩，13200rpm離心1min，移除上清液；加入0.5mL組織透明液，充分振蕩，13200rpm離心1min，移除上清液；加入1mL乙醇(96-100％)，劇烈振蕩，13200rpm室溫離心2min，移除上清液；打開蓋子，室溫(15-25℃)或金屬浴37℃孵育直到剩余乙醇完全揮發；取180μLBufferATL對管內組織進行吹吸重懸，然后加入20μL蛋白酶K，再次振蕩；將含有混合液的離心管置于56℃的金屬浴上，孵育1h，期間顛倒混勻3次，直至樣品完全溶解；將離心管轉移至90℃的金屬浴上，再次孵育1h；短暫離心，將管蓋上的溶液甩至管底；向管內加入200μLBufferAL，充分振蕩混勻。然后加入200μL乙醇(96-100％)，再次振蕩混勻；短暫離心，將管蓋上的溶液甩至管底；小心將混合液用移液器轉移至含有QIAampMinElutecolumn吸附柱的2mL收集管內，8000rpm離心1min，棄收集管，將吸附柱置于一個新的收集管上；向吸附柱內加入500μLBufferAW1，務必不要打濕吸附柱管口邊緣。8000rpm離心1min，棄收集管，將吸附柱置于一個新的收集管上；向吸附柱內加入500μLBufferAW2，務必不要打濕吸附柱管口邊緣。8000rpm離心1min，棄收集管，將吸附柱置于一個新的收集管上；13200rpm室溫離心3min，以徹底甩掉吸附膜上殘留的溶液；將吸附柱將吸附柱置于一個干凈的1.5mL離心管上(自備)，小心向膜中央滴加50μLBufferATE；13200rpm室溫離心1min，取收集到的DNA溶液1.5μL用NanoDrop檢測所得DNA的濃度和純度；將剩余的DNA溶液于-20℃保存。實施例3亞硫酸鹽處理試劑和方法如下。操作步驟：將實施例2提取的基因組DNA與1.5mlEP管中使用雙蒸水稀釋至50ul加5.5ul新鮮配制的3MNaOH溶液，42℃水浴30min；水浴期間配制以下溶液：10mM氫醌溶液(Hydryquinone)：取55mg氫醌于50ml水中溶解；3.6mol/LNaHSO3：取18.8gNaHSO3加入40ml水中，并以3MNaOH溶液調節溶液PH至5.0，最終定容至50ml。加30ul10mM氫醌溶液和520ul3.6mol/LNaHSO3至上述水浴后溶液中，EP管外包裹以鋁箔紙避光，輕柔顛倒混勻溶液，管內加100ul石蠟油，短暫離心使石蠟油蓋住液面，防止水浴過程中水分的蒸發并限制氧化50℃避光水浴16h；水浴完后將移液器槍頭伸入石蠟油層下，先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出，然后小心吸取約580ulDNA溶液至潔凈的1.5mlEP管中，使用PCR產物回收試劑盒回收DNA，所得到的DNA溶于50ul去離子水，加5.5ul新鮮配制的3MNaOH，室溫放置15min，然后加33ul10M乙酸銨中和NaOH，使溶液PH＝7，也加入4ul10mg/ml葡萄糖作為沉淀位置指示劑，加入270ul冰無水乙醇，至于-20℃，過夜沉淀后，4℃，12000rpm離心，30min，倒掉上清液，收集沉淀，加入500ul70％乙醇，洗劑沉淀，4℃12000rpm，5min離心兩次；倒掉上清，室溫干燥至沉淀由不透明變為半透明或透明時，依DNA沉淀多少加入30-50ul雙蒸水溶解沉淀。利用本發明所述的DNA亞硫酸氫鈉處理試劑和方法，可以獲得更高的DNA回收率，高轉化率，同時可以降低DNA降解率和片段化率，從而提高了PCR擴增和后續分析技術的靈敏度。實施例4PCR檢測方法如下。PCR引物為：所有引物純度達到PAGE級或HPLC級，不含雜帶。提供合成結構出具的合成產物的質檢證明，如PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜，證明使用引物達到檢測要求。MED1的引物序列如下：SEQNO1：5’-GGYGGATAGYGAGGTTAGGAGTT-3’；SEQNO2：5’-AATCTTACTCTTATCRCCCAAACTAA-3’；PCR檢測反應體系為：8-10×PCR緩沖液、0.8-1.2mMdNTPs、0.8-1.2uM擴增引物(SEQNO1和SEQNO2)、0.5-2ng模板DNA，0.05-0.1U/ulDNA聚合酶。所述dNTPs包括：10mMdATP、10mMdCTP、10mMdTTP、10mMdGTP。所述PCR緩沖液包括：TRIS.CL、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鎂。PCR檢測的反應條件為：第一階段，92-97℃預變性5-15min；第二階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度62-66℃90sec，延伸溫度72℃30sec，循環12-18次，每循環一次，所述退火溫度降低0.5℃；第三階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度53-57℃30sec，延伸溫度72℃30sec，循環24-34次；第四階段，72℃10min；第五階段，擴增反應結束，擴增產物在4℃下保存。電泳檢測后將所得PCR產物進行酶純化，測序反應，上機測序；所述酶純化的反應條件為：37℃50min，95℃5min。所述測序反應的反應條件為：95℃4min，95℃15S；50℃20S；60℃2min，25個循環。依據相關軟件獲得樣本的MED1啟動子甲基化狀態。以亞硫酸鹽處理后的MED1啟動子序列為標準序列，通過軟件分析獲得樣本的MED1啟動子甲基化狀態。針對石蠟切片DNA片段化嚴重，而亞硫酸氫鹽修飾飽和狀態下仍呈現有效模板濃度低的問題，將Touch-downPCR擴增和Sanger測序相結合，可顯著提高檢測靈敏度。實施例5子宮頸癌樣本檢測：選擇石蠟切片樣本10例，3例為已確診子宮頸癌樣本，3例為正常人樣本，其余4例為未知樣本。利用本發明的試劑盒按照實施例3中的方法進行樣本DNA提取、亞硫酸處理、純化回收、PCR擴增、測序及結果分析。(1)材料：待測樣本、陽性質控品、陰性質控品、空白對照。(2)儀器：移液器、高速離心機、NANODROP1000、渦旋震蕩以、冰箱、電泳儀、凝膠拍照系統，ABI3500XLGeneticAnalyzer，PCR儀。(3)試劑：DNA聚合酶(凱杰)，DNA純化試劑(凱杰)，dNTPs(TaTaRa)、純化水，亞硫酸鹽處理試劑(凱杰)，EXOI(NEB)，CIP(NEB)，BigdyeTerminator(NEB)。(4)引物：所有引物純度達到PAGE級或HPLC級，不含雜帶。提供合成結構出具的合成產物的質檢證明，如PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜，證明使用引物達到檢測要求。MED1的引物序列如下：SEQNO1：5’-GGYGGATAGYGAGGTTAGGAGTT-3’；SEQNO2：5’-AATCTTACTCTTATCRCCCAAACTAA-3’；(5)PCR檢測，反應體系為：8-10XPCR緩沖液、0.8-1.2mMdNTPs、0.8-1.2uM如權利要求3所述的擴增引物、0.5-2ng模板DNA，0.05-0.1U/ulDNA聚合酶。(6)所述dNTPs中包括10mMdATP、10mMdCTP、10mMdTTP、10mMdGTP，所述PCR緩沖液包含TRIS.CL、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鎂。(7)所述PCR檢測的反應條件為：第一階段，92-97℃預變性5-15min；第二階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度62-66℃90sec，延伸溫度72℃30sec，循環12-18次，每循環一次，所述退火溫度降低0.5℃；第三階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度53-57℃30sec，延伸溫度72℃30sec，循環24-34次；第四階段，72℃10min；第五階段，擴增反應結束，擴增產物在4℃下保存。(8)電泳檢測后將所得PCR產物進行酶純化，測序反應，上機測序；(9)所述酶純化的反應條件為：37℃50min，95℃5min。所述測序反應的反應條件為：95℃4min，95℃15S；50℃20S；60℃2min，25個循環。(10)依據相關軟件獲得樣本的MED1啟動子甲基化狀態。以亞硫酸鹽處理后的MED1啟動子序列為標準序列，通過軟件分析獲得樣本的MED1啟動子甲基化狀態。10例樣本的MED1基因啟動子甲基化狀態結果如下表所示：樣本編號檢測到甲基化的CG數檢測結果S1(子宮頸癌)0個陰性S2(子宮頸癌)12個陽性S3(子宮頸癌)0個陰性S4(正常人)0個陰性S5(正常人)0個陰性S6(正常人)0個陰性S7(子宮頸癌未確診)0個陰性S8(子宮頸癌未確診)0個陰性S9(子宮頸癌未確診)12個陽性S10(子宮頸癌未確診)0個陰性檢測樣本的MED1基因啟動子甲基化狀態結果如圖2所示，圖3為S1樣本檢測結果，結果為陰性(箭頭指CG位點)。圖4為S2樣本檢測結果，結果為陽性(箭頭指CG位點)。SEQUENCELISTING<110>南京艾迪康醫學檢驗所有限公司<120>MED1基因啟動子甲基化檢測的引物和檢測方法<130><160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1ggyggatagygaggttaggagtt23<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>2aatcttactcttatcrcccaaactaa26<210>3<211>211<212>DNA<213>人工序列<400>3ggtggatagtgaggttaggagtttgagattagtttggttaatatggtgaaattttgtttt60tattaaaaatagttgggtgtggtggtgggtgtttgtaattttagttatttgggaggttga120ggtaggagaattgtttgaatttgggaggtggaggttgtagtgagttgatattgtgttatt180gtattttagtttgggtgataagagtaagatt211<210>4<211>211<212>DNA<213>人工序列<400>4ggcggatagcgaggttaggagttcgagattagtttggttaatacggcgaaatttcgtttt60tattaaaaatagttgggcgtggtggcgggtgtttgtaattttagttattcgggaggttga120ggtaggagaatcgtttgaattcgggaggcggaggttgtagtgagtcgatatcgtgttatt180gtattttagtttgggcgataagagtaagatt211當前第1頁1 2 3