本發明涉及基因突變檢測領域，具體涉及為一種用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變檢測的雜交捕獲試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
：乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，被稱為女性殺手，發病率僅次于肺癌。其中遺傳性乳腺癌約占乳腺癌發病率的5％～7％。患乳腺癌及卵巢癌的最大風險因素是乳腺癌易感基因BRCA1或BRCA2基因發生遺傳性突變。BRCA1和BRCA2是兩個腫瘤抑制基因，其結構、功能的異常與乳腺癌、卵巢癌的發生密切相關，不僅能抑制細胞生長，還參與細胞周期調控、基因轉錄調節、DNA損傷修復以及凋亡等多種重要細胞活動，在維持基因組穩定性中起重要作用。由于BRCA1和BRCA2基因的突變與遺傳性乳腺癌的發生有一定的聯系，所以對BRCA基因進行檢測，尋找其致病突變位點，可幫助篩選出高危人群，有助于風險評估和早期診斷。目前，用于BRCA基因突變檢測的方法主要有高分辨率熔解曲線法(HRM)、多重PCR擴增捕獲技術、限制小片段長度多態性分析法(RFLP)和DNA直接測序法。高分辨率溶解曲線法是一種基于PCR新型技術，它是在有熒光嵌合染料的情況下PCR擴增片段，擴增后的產物通過一個快速的可控的加熱處理開始熔解。熒光水平在升溫的過程中實時監測，染料隨著雙鏈DNA的熔解，熒光信號逐漸減少。DNA雙鏈體的熔解溫度差異反應了基因的變異。該方法存在的缺點是：通過熔解曲線的圖不能判斷某一特異性的變異體，下游分析中檢測仍需要有測序等補充。多重PCR擴增捕獲技術利用多重PCR擴增富集樣品基因組中目標區域的DNA片段，再進行文庫構建和高通量測序，該技術的缺點：通量小，目前一次PCR獲取最長的基因組DNA片段長度應該不會超過50kb，而且需要特殊的酶和特殊的PCR條件，成本高昂，穩定性差。當然100kb以下的片段，通過多次PCR的方式也是可行的，一般每個擴增片段的長度在500bp左右性價比最佳。RFLP法是將PCR與限制性酶切相結合的方法。該方法存在以下缺點：RFLP實驗操作繁瑣，檢測周期長，成本高昂，存在第一輪酶切不完全導致的假陽性，非閉管操作，易于污染，難以滿足臨床檢測要求。DNA直接測序法存在以下缺點：檢測周期較長，花費昂貴，非閉管操作，難以避免交叉污染，通量不高。另外，該方法靈敏度較低，雜合突變、膠壓縮、GC富集區的存在等問題使得很難通過一次測序獲得精確的數據，需要多次重復測序才可能避免假陽性等，因此直接測序方法難適用于臨床檢測。技術實現要素：本發明的目的之一在于針對現有用于BRCA基因突變檢測的方法所存在的不足而提供一種可用于高通量、高靈敏度、高穩定性、低成本檢測BRCA1和BRCA2基因突變的試劑盒。本發明主要是利用液相探針雜交捕獲技術對BRCA1和BRCA2基因全外顯子區進行捕獲富集，然后通過高通量測序技術對富集后的全外顯子序列進行測定，最終通過生物信息學分析高通量測序數據，從而發現全外顯子區的突變情況及其突變頻率。本發明另一目的是提供一種檢測乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變雜交富集的方法。為了實現本發明目的，本發明采取的技術方案是：一種用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變檢測的雜交捕獲試劑盒，包括雜交用試劑、PCR擴增試劑及富集度檢測試劑；其中所述雜交用試劑包括如下SEQNO.1-SEQNO.173探針混合物，且摩爾數比為SEQNO.1:SEQNO.(2-172):SEQNO.173＝1：1：1,檢測時，濃度為2nMeach的上述探針混合物用量為1μl；所述PCR擴增試劑包括如下SEQNO.176和SEQNO.177構成的引物對：SEQNO.176AATGATACGGCGACCACCGASEQNO.177CAAGCAGAAGACGGCATACGA所述富集度檢測試劑包括如下SEQNO.156和SEQNO.157構成的引物對：SEQNO.156ACCATCACGTGCACTAACAAGACAGSEQNO.157GTCCTCTTACTCTCTCACCTCAAG在本發明的一個優選實施例中，所述乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變檢測的雜交捕獲試劑盒還包括雜交體系所用試劑：Block3.1/3.2、HumanCot-1PerfectHybTMPlushybridizationbuffer；其中，Block3.1/3.2包括如下SEQNO.174和SEQNO.175構成的引物：SEQNO.174AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTSEQNO.175CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT且摩爾數比為SEQNO.174：SEQNO.175＝1：1，檢測時濃度為300μMeach的上述混合液用量為1μl。在本發明的一個優選實施例中，所述雜交體系所用試劑由以下體積的各組分組成：在本發明的一個優選實施例中，所述乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變檢測的雜交捕獲試劑盒還包括雜交后通過生物素親和素的反應使目標DNA片段錨定在帶有親和素的Streptavidinbeads，以及用于洗去非目標DNA的1×washingbuffer、0.1×washingbuffer和將捕獲的DNA洗脫下來的FEbuffer。在本發明的一個優選實施例中，所述1×washingbuffer緩沖液包括0.15M濃度的氯化鈉、15mM的檸檬酸鈉和0.1％SDS。在本發明的一個優選實施例中，所述0.1×washingbuffer緩沖液包括0.015M的氯化鈉、1.5mM的檸檬酸鈉、0.1％SDS。在本發明的一個優選實施例中，所述FEbuffer緩沖液為pH8.2的含95％甲酰胺的10mMEDTA的溶液。在本發明的一個優選實施例中，所述乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變檢測的雜交捕獲試劑盒還包括雜交后用于洗滌Streptavidinbeads的BW緩沖液。在本發明的一個優選實施例中，BW緩沖液包括5mMTris·Cl、0.5mMEDTA、1.0M氯化鈉和0.01％吐溫-20。在本發明的一個優選實施例中，所述PCR擴增試劑還包括PCR預混液和去離子水。在本發明的一個優選實施例中，所述PCR預混液為2×預混液，使用時終濃度為1×。在本發明的一個優選實施例中，所述2×預混液包括2×Q5buffer、1×GCenhancerbuffer、各組分濃度為0.4mM的dNTP、用量為0.2μl的濃度2000U/ml為Q5高保真DNA聚合酶。在本發明的一個優選實施例中，所述富集度檢測試劑還包括2×SYBRGreenMasterMix(vazyme)、Primermix(10uMeach)、dH2O和input/R1/R2。一種檢測乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變雜交富集的方法，具體包括如下步驟：1)文庫構建。2)雜交捕獲：對構建好的文庫等比例混合后使用SEQNO.1-SEQNO.173探針混合物進行液相探針捕獲雜交，富集獲得DNA；其中SEQNO.1-SEQNO.173探針混合物的摩爾數比為SEQNO.1:SEQNO.(2-172):SEQNO.173＝1：1：1,檢測時，濃度為2nMeach的上述探針混合物用量為1μl；雜交捕獲所采用的雜交體系由以下體積的各組分組成：雜交程序如下：將H1、H2混勻離心后分別放入PCR中，變性退火程序如下：程序運行完畢后將H1用移液槍一次性小心加入到H2中，由于PerfectHybTMPlushybridizationbuffer比較粘稠請勿用槍頭吹打混勻；將混合液放在漩渦振蕩器上振蕩混勻離心后放入PCR儀中，50℃雜交過夜；用1mlBW重新懸浮Streptavidinbeads，洗滌兩次；將雜交完畢的混合液用移液槍小心轉移至含SAbeads的離心管中，緩慢地一次性將管壁上的SAbeads沖到離心管底部，漩渦振蕩10s后甩一下，于50℃1200rpm孵育45min；取預熱好的500μl1×washingbuffer/eachsample洗滌SAbeads兩次，每次50℃1200rpm孵育1min；然后用500μl0.1×washingbuffer/eachsample洗滌SAbeads兩次，每次50℃1200rpm孵育1min；向洗滌后的磁珠加入20μlFEbuffer，漩渦振蕩混勻短暫離心后95℃1200rpm孵育10min；最后使用NucleotideRemovalKit對上清進行純化；3)PCR擴增：對一輪富集獲得DNA進行PCR擴增，擴增使用的引物對(SEQNO.176和SEQNO.177)，擴增后使用1×AMPurXPbeads進行純化。所述的擴增體系包括：雜交產物20μl、5ul引物(SEQNO.176和SEQNO.177)、50μlPCR預混液、去離子水，總體積100μl。PCR擴增程序如下：4)二輪雜交富集：對純化后的一輪PCR產物留取20ng用于富集度檢測，其余全部用于二輪雜交。其中，二輪雜交input量為100ng-500ng，雜交時間為4h，其余條件與步驟同一輪雜交；5)PCR擴增：對二輪富集獲得DNA進行PCR擴增，擴增使用的引物對SEQNO.176和SEQNO.177，擴增所用循環數為10，擴增后使用1×AMPurXPbeads進行純化；6)富集度檢測：對步驟2)所得的multiplexDNAsamplelibrarypool、步驟3)和步驟5)經過PCR擴增后的一輪、二輪DNA分別使用StepOneTMandStepOnePlusTMRealtimePCRsystem進行RealtimePCR富集度檢測，每個樣本做三個重復，以超純水做陰性對照，以混合前任意一個文庫做陽性對照。模板使用量均為3.44ng；計算每個樣本Ct的平均值，然后使用富集前DNA樣本Ct的平均值減去富集后的DNA樣本Ct的平均值得到ΔCt；計算富集度，富集度計算方法為：Foldenrichment＝EΔCp，其中E為引物對為SEQNO.156和SEQNO.157的PCR擴增效率，經檢測該引物對的擴增效率為2.0，R2為0.991；7)測序：對經步驟6)檢測后有一定富集度的步驟2)獲得的PCR擴增產物進行測序。8)分析：對步驟7)獲得的測序結果進行分析，完成全外顯子區的突變檢測。與現有技術相比，本發明的檢測方法和試劑盒具有如下優點：1)平鋪間隔式探針設計，在全外顯子區間距均勻的排列173條探針，可實現全外顯子區的突變檢測，不但能對已知突變進行分析，還能發現新的突變；2)成本低，穩定性高，重復性好，通量高，可同時檢測多個樣本文庫；3)通過序列捕獲聚焦關鍵序列，減少了后續測序需要覆蓋的區域大小，轉而增加測序深度，有效減小數據處理難度，提高了靈敏度，增加混合樣本中突變的檢出率。4)樣品來源廣泛，可使用多種來源的基因組DNA如FFPE組織、FF組織、血細胞、唾液及血漿來源的游離DNA片段，對待檢測樣品要求量低。總體來說，本發明的試劑盒可用于高靈敏度、高通量、低成本、易操作的BRCA1和BRCA2基因全外顯子突變檢測，協助臨床醫生篩選出具有乳腺癌易感風險的個體，達到預防乳腺癌發生的目的。附圖說明圖1是本發明乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變檢測雜交捕獲試劑盒一輪雜交富集度檢測圖；圖2是本發明乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變檢測雜交捕獲試劑盒二輪雜交富集度檢測圖；圖3是本發明乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變檢測雜交捕獲試劑盒富集文庫AgilentBioanalyzer2100檢測圖；圖4是本發明乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變檢測雜交捕獲試劑盒數據分析結果圖。具體實施方式以下結合附圖和具體實施例對本發明一種用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變檢測的雜交捕獲試劑盒及其方法進行詳細地描述說明。乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變檢測的雜交捕獲試劑盒，包括雜交用試劑、PCR擴增試劑及富集度檢測試劑。1)雜交捕獲：所述雜交試劑包括探針混合物(SEQNO.1-SEQNO.173)，且摩爾數比為SEQNO.1:SEQNO.(2-172):SEQNO.173＝1：1：1。檢測時，濃度為2nMeach的上述探針混合物用量為1μl。所述乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2突變檢測的雜交捕獲試劑盒還包括雜交體系所用試劑：Block3.1/3.2(SEQNO.174和SEQNO.175)、HumanCot-1PerfectHybTMPlushybridizationbuffer。Block3.1/3.2摩爾數比為SEQNO.174：SEQNO.175＝1：1，檢測時濃度為300μMeach的上述混合液用量為1μl。另外，HumanCot-1的規格為1mg/ml，檢測時用量為1μl。PerfectHybTMPlushybridizationbuffer的用量為50μl。所述雜交體系中還包括MultiplexDNAsamplelibrarypool，該librarypool是將各待富集文庫使用AgilentBioanalyzer2100高靈敏性DNA芯片進行檢測得到文庫片段分布范圍及主峰的平均片段長度和濃度。然后按照等質量等比例混合，得到520ng的文庫，其中500ng用于雜交，剩余20ng用于雜交后富集度檢測用。優選的，雜交體系由以下體積的各組分組成：雜交程序如下：將H1、H2混勻離心后分別放入PCR中，變性退火程序如下：程序運行完畢后將H1用移液槍一次性小心加入到H2中，由于PerfectHybTMPlushybridizationbuffer比較粘稠請勿用槍頭吹打混勻。將混合液放在漩渦振蕩器上振蕩混勻離心后放入PCR儀中，50℃雜交過夜。用1mlBW重新懸浮Streptavidinbeads，洗滌兩次。將雜交完畢的混合液用移液槍小心轉移至含SAbeads的離心管中，緩慢地一次性將管壁上的SAbeads沖到離心管底部，漩渦振蕩10s后甩一下，于50℃1200rpm孵育45min。取預熱好的500μl1×washingbuffer/eachsample洗滌SAbeads兩次，每次50℃1200rpm孵育1min。然后用500μl0.1×washingbuffer/eachsample洗滌SAbeads兩次，每次50℃1200rpm孵育1min。向洗滌后的磁珠加入20μlFEbuffer，漩渦振蕩混勻短暫離心后95℃1200rpm孵育10min。最后使用NucleotideRemovalKit對上清進行純化。2)PCR擴增：對一輪富集獲得DNA進行PCR擴增，擴增使用的引物對(SEQNO.176和SEQNO.177)，擴增后使用1×AMPurXPbeads進行純化。所述的擴增體系包括：雜交產物20μl、5ul引物(SEQNO.176和SEQNO.177)、50μlPCR預混液、去離子水，總體積100μl。PCR擴增程序：3)二輪雜交富集：對純化后的一輪PCR產物留取20ng用于富集度檢測，其余全部用于二輪雜交。其中，二輪雜交input量為100ng-500ng，雜交時間為4h，其余條件與步驟同一輪雜交。4)PCR擴增：對二輪富集獲得DNA進行PCR擴增，擴增使用的引物對(SEQNO.176和SEQNO.177)，擴增所用循環數為10，擴增后使用1×AMPurXPbeads進行純化。5)富集度檢測：對步驟1)所得的multiplexDNAsamplelibrarypool、步驟2)和步驟4)經過PCR擴增后的一輪、二輪DNA分別使用StepOneTMandStepOnePlusTMRealtimePCRsystem進行RealtimePCR富集度檢測，每個樣本做三個重復，以超純水做陰性對照，以混合前任意一文庫做陽性對照。模板使用量均為3.44ng。計算每個樣本Ct的平均值，然后使用富集前DNA樣本Ct的平均值減去富集后的DNA樣本Ct的平均值得到ΔCt。計算富集度，富集度計算方法為：Foldenrichment＝EΔCp，其中E為引物對(SEQNO.156和SEQNO.157)的PCR擴增效率，經檢測該引物對的擴增效率為2.0，R2為0.991。效果說明：圖1可以看出，經過一輪雜交后，檢測引物所在的DNA富集度為210。圖2可以看出，經過二輪雜交后，檢測引物所在的DNA富集度為216。結果表明，經過兩輪雜交后目的片段確實得到了一定程度的富集，且富集效果顯著。圖3為二輪雜交富集產物質量分析，從圖中可以看出文庫主峰單一且大小與雜交前文庫大小一致，可用于進一步測序分析。圖4中對雜交后的4個文庫進行了信息分析，結果表明該雜交試劑盒對BRCA全外顯子實現了有效富集，可有效地用于BRCA1和BRCA2基因全外顯子突變的檢測。應當指出的是雖然在某些情況下，對該基因的檢測對于相關癌癥的診斷、預防和治療有重要的輔助意義，但這些基因的突變不是必然導致所述疾病的發生，因此對這些基因的檢測并不涉及疾病的診斷或治療方法。本發明的試劑盒具有靈敏度高、通量高、成本低、易于操作、穩定性高等特點，可協助臨床醫生篩選出具有乳腺癌易感風險的個體，達到預防乳腺癌發生的目的。與高分辨率溶解曲線法相比，HRM通過熔解曲線的圖不能判斷某一特異性的變異體，下游分析中檢測仍需要有測序等進行補充說明。多重PCR擴增捕獲技術通量小，目前一次PCR獲取最長的基因組DNA片段長度應該不會超過50kb，而且需要特殊的酶和特殊的PCR條件，成本高昂，穩定性差。RFLP實驗操作繁瑣，檢測周期長，成本高昂，存在第一輪酶切不完全導致的假陽性，非閉管操作，易于污染，難以滿足臨床檢測要求。DNA直接測序法檢測周期較長，花費昂貴，非閉管操作，難以避免交叉污染，通量不高，靈敏度較低，雜合突變、膠壓縮、GC富集區的存在等問題使得很難通過一次測序獲得精確的數據，需要多次重復測序才可能避免假陽性等，難適用于臨床檢測。以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例，應當理解，本領域的普通技術無需創造性勞動就可以根據本發明的構思做出諸多修改和變化。因此，凡本
技術領域：
中技術人依本發明構思在現有技術基礎上通過邏輯分析、推理或者根據有限的實驗可以得到的技術方案，均應該在由本權利要求書所確定的保護范圍之中。當前第1頁1 2 3