本發明涉及桑黃，特別涉及一種桑黃液體培養對重金屬的富集規律的研究方法。
（二）
背景技術：
藥用真菌桑黃（Phellinus igniarius）具有抗癌、抗氧化、增強免疫調節、抗炎、降血脂和抗病毒等作用 ，在傳統中藥中，其被用于治療傷口、腹痛和淋病。最近的研究強調了其抗癌和肝臟保護功能 。 其含有三萜、黃酮、多糖等活性成分。
當前，桑黃產品大部分依賴于桑黃子實體，桑黃子實體生長對環境的依賴性很高，生長周期長，產量不穩定。利用液體培養可以較容易地對各種生長影響因素進行控制和優化，獲得穩定高產。
食藥用菌有一個共性，即對重金屬的富集能力普遍較強，這對食藥用菌的安全性有一個潛在的影響。如果桑黃對重金屬的富集能力較差，在對培養原料的選擇方面會更寬泛，菌絲體的安全性會更容易得到保證。但目前僅有對木耳、銀耳、香菇、平菇等對重金屬富集能力的研究，還沒有關于桑黃對重金屬富集能力的研究記載，桑黃在對重金屬的規避方面還無據可依。
所以，本專利做了桑黃與平菇、蛹蟲草對重金屬富集能力的比較研究，以期總結桑黃對重金屬富集的規律，為桑黃的工業化擴大培養奠定基礎。
（三）
技術實現要素：
本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種桑黃液體培養對重金屬的富集規律的研究方法，通過該方法可知，桑黃對各種重金屬的富集能力明顯低于平菇和蛹蟲草，這些規律的把握，對于維持桑黃產品較高的安全性具有天然的優勢，對于工廠化液體培養時選擇適宜的培養基進行桑黃培養具有較高的指導意義。
本發明是通過如下技術方案實現的：
一種桑黃液體培養對重金屬的富集規律的研究方法，其特殊之處在于：包括以下步驟：
（1）配制液體培養基；
（2）在液體培養基中加入重金屬；
（3）在培養溫度為23-35℃，搖床轉速為100-250r/min的培養條件下進行搖床培養；
（4）將培養的菌懸液用紗布過濾，得菌絲體，再用蒸餾水沖洗，50-70℃烘干至恒重，稱重；
（5）對菌絲體中的重金屬含量進行測定。
步驟（1）中，配制液體培養基：麥麩放入足量的水中，煮沸20-40min，紗布過濾，向濾液中依次加入玉米粉、MgSO4·7H2O和KH2PO4 ，調pH值為5-7，配制培養基液體培養基，其中，液體培養基中：麥麩2-5%，玉米粉1.5-3.5%，MgSO4·7H2O 0.1-0.2%，KH2PO4 0.05-0.15%。
步驟（2）中，在配制的液體培養基中，汞、鉛、銅、鎘、砷每種重金屬設n個濃度，汞的濃度為0-0.06mg/L，鉛的濃度為0-7.5mg/L，銅的濃度為0-4mg/L，鎘的濃度為：0-0.06mg/L，砷的濃度為：0-0.4mg/L，空白對照不添加任何重金屬。
優選，步驟（2）中，在配制的液體培養基中，汞、鉛、銅、鎘、砷每種重金屬設七個濃度，汞的濃度設定為0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.070mg/L，鉛的濃度設定為0、1.5、3、4.5、6、7.5、8.0、8.5mg/L，銅的濃度設定為0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.0mg/L，鎘的濃度設定為：0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07mg/L，砷的濃度設定為：0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mg/L，空白對照不添加任何重金屬，每種樣三個平行。
步驟（3）中，桑黃培養時間為18-22d。
本發明的有益效果是：本發明對桑黃對各種重金屬（Hg、Pb、Cu、Cd、As）的吸收進行了系列的研究，研究發現，桑黃與平菇、蛹蟲草相比，對重金屬Hg、Pb、Cu、Cd、As的吸收，明顯要低，平菇、蛹蟲草對Hg的最高富集量為桑黃的1.22倍、3.95倍；平菇、蛹蟲草對Pb的最高富集量為桑黃的1.89倍、1.29倍；平菇、蛹蟲草對Cu的最高富集量為桑黃的21.13倍、2.75倍；桑黃對Cd沒有富集；平菇、蛹蟲草對As的最高富集量為桑黃的1.24倍、17.56倍。這一特點在重金屬污染日益嚴重的今天，具有非常重要的意義，對于維持桑黃產品較高的安全性具有天然的優勢，所以，桑黃菌粉及各種活性成分的提取分離的安全性相對較高。
（四）具體實施方式
實施例1
1. 菌種：桑黃；平菇；蛹蟲草
2. 培養料：麥麩3.5%，玉米粉2.5%，MgSO4·7H2O 0.15%，KH2PO4 0.1%，pH 6。
3. 主要試劑：氯化汞[HgCl2]、硝酸鉛[Pb(NO3)2]、五水硫酸銅[CuSO4.5H2O]、氯化鎘[CdCl2]、三氧化二砷[AS2O3]，鹽酸、硫酸、硝酸、高氯酸（以上試劑均為國產分析純試劑）、蒸餾水、三次蒸餾水等。
4. 培養基的配制：
按照配方組成（麥麩3.5%，玉米粉2.5%，MgSO4·7H2O 0.15%，KH2PO4 0.1%，pH 6）及配制方法（麥麩放入足量的蒸餾水中，煮沸30min，四層紗布過濾，向濾液中依次加入玉米粉、MgSO4·7H2O和KH2PO4 ，pH值為6）配制培養基。
在配制的液體培養基中，汞、鉛、銅、鎘、砷每種重金屬設七個濃度，汞的濃度設定為0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.070mg/L，鉛的濃度設定為0、1.5、3、4.5、6、7.5、8.0、8.5mg/L，銅的濃度設定為0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.0mg/L，鎘的濃度設定為：0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07mg/L，砷的濃度設定為：0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mg/L，空白對照不添加任何重金屬，每種樣三個平行。
5. 培養基的滅菌
將306瓶（每個菌種）裝有150ml液體培養基的250ml錐形瓶封裝好放進滅菌鍋，121℃滅菌30min；
6. 接種及液體培養
超凈工作臺無菌操作，用打孔器（d=1cm）打取菌餅，每瓶培養基中接種2塊菌餅，在培養溫度為28℃，搖床轉速為160r/min的培養條件下進行搖床培養（桑黃18d，平菇15d，蛹蟲草18d）。
7菌絲體干重的測定
將培養的菌懸液用四層紗布過濾，得菌絲體，再用蒸餾水沖洗3次，置于濾紙上，60℃烘干至恒重，電子天平稱重。
8 重金屬含量的檢測方法
參照食品安全國家標準對菌絲體中的重金屬含量進行測定：
GB 5009.17-2014 食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定（2016-3-21實施）
GB 5009.12-2010 食品安全國家標準 食品中鉛的測定(（ 2010-06-01 實施 ）
GB/T 5009.13-2003 食品中銅的測定（2004-01-01實施）
GB 5009.15-2014 食品安全國家標準 食品中鎘的測定（2015-07-28實施）
GB 5009.11-2014 食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定（2016-03-21實施）
9 結果：
對桑黃對各種重金屬（Hg、Pb、Cu、Cd、As）的吸收進行了系列的研究，研究發現，桑黃與平菇、蛹蟲草相比，對重金屬Hg、Pb、Cu、Cd、As的吸收，明顯要低，平菇、蛹蟲草對Hg的最高富集量為桑黃的1.22倍、3.95倍；平菇、蛹蟲草對Pb的最高富集量為桑黃的1.89倍、1.29倍；平菇、蛹蟲草對Cu的最高富集量為桑黃的21.13倍、2.75倍；桑黃對Cd沒有富集；平菇、蛹蟲草對As的最高富集量為桑黃的1.24倍、17.56倍。
這一特點在重金屬污染日益嚴重的今天，具有非常重要的意義，對于維持桑黃產品較高的安全性具有天然的優勢，所以，桑黃菌粉及各種活性成分的提取分離安全性相對較高。
實施例2
1. 菌種：桑黃；平菇；蛹蟲草
2. 培養料：麥麩2%，玉米粉3.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO4 0.15%，pH 5。
3. 主要試劑：氯化汞[HgCl2]、硝酸鉛[Pb(NO3)2]、五水硫酸銅[CuSO4.5H2O]、氯化鎘[CdCl2]、三氧化二砷[AS2O3]，鹽酸、硫酸、硝酸、高氯酸（以上試劑均為國產分析純試劑）、蒸餾水、三次蒸餾水等。
4. 培養基的配制：
按照配方組成（麥麩2%，玉米粉3.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO4 0.15%，pH 5）及配制方法（麥麩放入足量的水中，煮沸20min，四層紗布過濾，向濾液中依次加入玉米粉、MgSO4·7H2O和KH2PO4 ，pH值為6）配制培養基。
在配制的液體培養基中，汞、鉛、銅、鎘、砷每種重金屬設七個濃度，汞的濃度設定為0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.070mg/L，鉛的濃度設定為0、1.5、3、4.5、6、7.5、8.0、8.5mg/L，銅的濃度設定為0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.0mg/L，鎘的濃度設定為：0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07mg/L，砷的濃度設定為：0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mg/L，空白對照不添加任何重金屬，每種樣三個平行。
5. 培養基的滅菌
將306瓶（每個菌種）裝有150ml液體培養基的250ml錐形瓶封裝好放進滅菌鍋，121℃滅菌30min；
6. 接種及液體培養
超凈工作臺無菌操作，用打孔器（d=1cm）打取菌餅，每瓶培養基中接種2塊菌餅，在培養溫度為23℃，搖床轉速為250r/min的培養條件下進行搖床培養（桑黃22d，平菇15d，蛹蟲草18d）。
7菌絲體干重的測定
將培養的菌懸液用四層紗布過濾，得菌絲體，再用蒸餾水沖洗3次，置于濾紙上，50℃烘干至恒重，電子天平稱重。
8 重金屬含量的檢測方法
參照食品安全國家標準對菌絲體中的重金屬含量進行測定：
GB 5009.17-2014 食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定（2016-3-21實施）
GB 5009.12-2010 食品安全國家標準 食品中鉛的測定(（ 2010-06-01 實施 ）
GB/T 5009.13-2003 食品中銅的測定（2004-01-01實施）
GB 5009.15-2014 食品安全國家標準 食品中鎘的測定（2015-07-28實施）
GB 5009.11-2014 食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定（2016-03-21實施）
9 結果：
對桑黃對各種重金屬（Hg、Pb、Cu、Cd、As）的吸收進行了系列的研究，研究發現，桑黃與平菇、蛹蟲草相比，對重金屬Hg、Pb、Cu、Cd、As的吸收，明顯要低，平菇、蛹蟲草對Hg的最高富集量為桑黃的1.22倍、3.95倍；平菇、蛹蟲草對Pb的最高富集量為桑黃的1.89倍、1.29倍；平菇、蛹蟲草對Cu的最高富集量為桑黃的21.13倍、2.75倍；桑黃對Cd沒有富集；平菇、蛹蟲草對As的最高富集量為桑黃的1.24倍、17.56倍。
實施例3
1. 菌種：桑黃；平菇；蛹蟲草
2. 培養料：麥麩5%，玉米粉1.5%，MgSO4·7H2O 0.2%，KH2PO4 0.05%，pH7。
3. 主要試劑：氯化汞[HgCl2]、硝酸鉛[Pb(NO3)2]、五水硫酸銅[CuSO4.5H2O]、氯化鎘[CdCl2]、三氧化二砷[AS2O3]，鹽酸、硫酸、硝酸、高氯酸（以上試劑均為國產分析純試劑）、蒸餾水、三次蒸餾水等。
4. 培養基的配制：
按照配方組成（麥麩5%，玉米粉1.5%，MgSO4·7H2O 0.2%，KH2PO4 0.05%，pH7）及配制方法（麥麩放入足量的水中，煮沸40min，四層紗布過濾，向濾液中依次加入玉米粉、MgSO4·7H2O和KH2PO4 ，pH值為7）配制培養基。
在配制的液體培養基中，汞、鉛、銅、鎘、砷每種重金屬設七個濃度，汞的濃度設定為0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.070mg/L，鉛的濃度設定為0、1.5、3、4.5、6、7.5、8.0、8.5mg/L，銅的濃度設定為0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.0mg/L，鎘的濃度設定為：0、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07mg/L，砷的濃度設定為：0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mg/L，空白對照不添加任何重金屬，每種樣三個平行。
5. 培養基的滅菌
將306瓶（每個菌種）裝有150ml液體培養基的250ml錐形瓶封裝好放進滅菌鍋，121℃滅菌30min；
6. 接種及液體培養
超凈工作臺無菌操作，用打孔器（d=1cm）打取菌餅，每瓶培養基中接種2塊菌餅，在培養溫度為35℃，搖床轉速為100r/min的培養條件下進行搖床培養（桑黃18d，平菇15d，蛹蟲草18d）。
7菌絲體干重的測定
將培養的菌懸液用四層紗布過濾，得菌絲體，再用蒸餾水沖洗3次，置于濾紙上，70℃烘干至恒重，電子天平稱重。
8 重金屬含量的檢測方法
參照食品安全國家標準對菌絲體中的重金屬含量進行測定：
GB 5009.17-2014 食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定（2016-3-21實施）
GB 5009.12-2010 食品安全國家標準 食品中鉛的測定(（ 2010-06-01 實施 ）
GB/T 5009.13-2003 食品中銅的測定（2004-01-01實施）
GB 5009.15-2014 食品安全國家標準 食品中鎘的測定（2015-07-28實施）
GB 5009.11-2014 食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定（2016-03-21實施）
9 結果：
對桑黃對各種重金屬（Hg、Pb、Cu、Cd、As）的吸收進行了系列的研究，研究發現，桑黃與平菇、蛹蟲草相比，對重金屬Hg、Pb、Cu、Cd、As的吸收，明顯要低，平菇、蛹蟲草對Hg的最高富集量為桑黃的1.22倍、3.95倍；平菇、蛹蟲草對Pb的最高富集量為桑黃的1.89倍、1.29倍；平菇、蛹蟲草對Cu的最高富集量為桑黃的21.13倍、2.75倍；桑黃對Cd沒有富集；平菇、蛹蟲草對As的最高富集量為桑黃的1.24倍、17.56倍。