本發明屬于細胞生物學、生物化學和分子生物學等技術領域，特別涉及一種快速簡易的擬南芥完整葉綠體的提取方法。
背景技術：
擬南芥(Arabidopsis thaliana)，又名鼠耳芥，是目前已知植物基因組中最小的，也是一種應用十分廣泛的模式生物。而葉綠體是植物細胞特有的細胞器，是植物進行光合作用的場所，除了光合作用外，還參與氨基酸、脂肪酸、植物生長物質、維生素等的合成。因而，植物葉綠體的發育與功能研究一直倍受人們關注。同時，獲得高純度的葉綠體用于蛋白質功能的研究成為先決條件。目前，關于擬南芥葉綠體提取的方法，大多數由提取菠菜和豌豆葉綠體的方法改進而來。1985年Riet等人的分離方法只用了一種濃度的percoll梯度，得到的葉綠體純度不夠；2008年Daniel Salvi的提取方法需要用到較高條件的高速水平離心機。還有一些方法提取液的配方復雜，花費時間長。本發明提供了一種快速簡易的完整葉綠體提取方法，提取時間短，配方簡單，離心要求低，進行定量測定后，可以直接運用于葉綠體膜蛋白、基質蛋白及葉綠體DNA的提取等各種后續研究。
技術實現要素：
為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種快速簡易的完整葉綠體的提取方法。
本發明的目的通過下述技術方案實現：
一種快速簡易的擬南芥完整葉綠體的提取方法，其特征在于，包括以下操作步驟：
(1)用具預冷；
(2)在培養箱光周期開始2-3h時，取3-4周的擬南芥葉片，置于冰上；
(3)然后在勻漿機中加入200ml的Medium I(緩沖液I)，低速勻漿；
(4)使用miracloth(神奇濾布)或者紗布過濾，1500g水平離心5min，沉淀為墨綠色粗葉綠體，上清為淺綠色；
(5)盡量去除上清，沉淀用約5ml的Medium II(緩沖液II)輕柔懸浮；
(6)配置40％/80％percoll(細胞分離液)梯度，將樣品上樣至percoll梯度上層，3000g水平離心30min；
(7)完整葉綠體位于上下兩個percoll組分的交界處，將完整葉綠體吸出；用SH buffer(SH緩沖液)稀釋3倍，1500g水平離心2min，沉淀重懸于25ml SH buffer，1000g離心1min；
(8)沉淀用適量SH buffer懸浮(約5-10ml)，可以立即鏡檢觀察葉綠體，并色素定量。
更為具體地，一種快速簡易的完整葉綠體提取方法，包括以下操作步驟：
(1)本方法所有用具(組織搗碎勻漿機、燒杯、試管、試劑等)需在冰上或者-20℃預冷，離心均在4℃條件下。
(2)在培養箱光周期開始2-3h時，取3-4周的擬南芥葉片共20g，置于冰上。
(3)然后在勻漿機中加入200ml的Medium I(緩沖液I)(330mM sorbitol(山梨糖醇)，30mM Tricine-KOH(三甲基甘氨酸-氫氧化鉀)pH 8.4，5mM EGTA，5mM EDTA，10mM NaHCO3)，低速勻漿，時間不宜超過5min。
(4)使用3層miracloth(神奇濾布)或者8層紗布過濾至4個50ml圓底離心管中，1500g水平離心5min，沉淀為墨綠色粗葉綠體，上清為淺綠色。
(5)盡量去除上清，沉淀用約5ml的Medium II(緩沖液II)(300mM sorbitol(山梨糖醇)，20mM Hepes-KOH(4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫氧化鉀)pH 7.6，5mM MgCl2，2.5mM EDTA)輕柔懸浮(槍頭剪大口)。
(6)在50ml離心管中配置23ml 40％/80％percoll(細胞分離液)梯度，將樣品上樣至4個percoll梯度上層，3000g水平離心30min。
(7)完整葉綠體位于上下兩個percoll(細胞分離液)組分的交界處(5ml刻度線)，小心將完整葉綠體吸出，每一個percoll交界處可吸出5-10ml葉綠體。用SH buffer(SH緩沖液)(330mM sorbitol，50mM Hepes-KOH pH 8.0，2mM DTT，DTT需現用現加)稀釋3倍，1500g水平離心2min，沉淀重懸于25ml SH buffer，1000g離心1min。
(8)沉淀用適量SH buffer(SH緩沖液)(330mM sorbitol，50mM Hepes-KOH pH 8.0，2mM DTT，DTT需現用現加)懸浮(約5-10ml)，可以立即鏡檢觀察葉綠體，并色素定量。
(Percoll(細胞分離液)梯度配制：首先配制含6％(w/v)sorbitol(山梨糖醇)的100％Percoll(細胞分離液)，然后配制Percoll(細胞分離液)梯度。40％組分，7.2ml 100％Percoll+10.8ml SH buffer；80％組分，4ml 100％Percoll+1ml SH buffer。)
與現有技術相比，本發明具有以下優點及有益效果：
(1)本發明不需要將擬南芥暗處理過夜，節省步驟和時間。
(2)本發明的三個提取液配方簡單，但是能提取到大量有活力的葉綠體。
(3)本發明改進了步驟4、6離心力的大小，大大降低了對離心機的要求。
(4)本發明改進了步驟6離心的時間，使得獲得盡可能多的完整葉綠體。
附圖說明
圖1是使用本發明提取的擬南芥完整葉綠體圖，(注：Bar＝5μm)。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
實施例1一種快速簡易的擬南芥完整葉綠體的提取方法
(1)本方法所有用具(組織搗碎勻漿機、燒杯、試管、試劑等)需在冰上或者-20℃預冷，離心均在4℃條件下。
(2)在培養箱光周期開始2-3h時，取3-4周的擬南芥葉片共20g，置于冰上。
(3)然后在勻漿機中加入200ml的Medium I(330mM sorbitol，30mM Tricine-KOH pH 8.4，5mM EGTA，5mM EDTA，10mM NaHCO3)，低速勻漿，時間不宜超過5min。
(4)使用3層miracloth或者8層紗布過濾至4個50ml圓底離心管中，1500g水平離心5min，沉淀為墨綠色粗葉綠體，上清為淺綠色。
(5)盡量去除上清，沉淀用約5ml的Medium II(300mM sorbitol，20mM Hepes-KOH pH 7.6，5mM MgCl2，2.5mM EDTA)輕柔懸浮(槍頭剪大口)。
(6)在50ml離心管中配置23ml 40％/80％percoll梯度，將樣品上樣至4個percoll梯度上層，3000g水平離心30min。
(7)完整葉綠體位于上下兩個percoll組分的交界處(5ml刻度線)，小心將完整葉綠體吸出，每一個percoll交界處可吸出5-10ml葉綠體。用SH buffer(330mM sorbitol，50mM Hepes-KOH pH 8.0，2mM DTT，DTT需現用現加)稀釋3倍，1500g水平離心2min，沉淀重懸于25ml SH buffer，1000g離心1min。
(8)沉淀用適量SH buffer懸浮(約5-10ml)，可以立即鏡檢觀察葉綠體，并色素定量。
(Percoll梯度配制：首先配制含6％(w/v)sorbitol的100％Percoll，然后配制Percoll梯度。40％組分為7.2ml 100％Percoll+10.8ml SH buffer，80％組分為4ml 100％Percoll+1ml SH buffer，5ml的80％組分用長針頭緩慢注射到40％組分底部。)
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。