本發明涉及農業生物技術領域，尤其涉及一種防治植物病害的生防菌株及其菌劑的制備方法和應用。

背景技術：

玉米鞘腐病致病菌為層出鐮孢菌(Fusarium proliferatum)。該病是近年我國玉米生產上發生的一種新病害。玉米鞘腐病在我國春玉米區均有不同程度發生。該病主要發生在玉米生長后期的籽粒形成直至灌漿充實期。發病嚴重時，引起玉米禿尖、籽粒干癟，或者穗腐，造成很大的產量損失。

目前該病在我國屬新發生病害，并有加重危害趨勢，發生規律及防治措施有待深入研究。生物防治對環境污染小，無殘留，安全有效，在提倡可持續發展的今天，隨著人們生活水平的提高和環保意識的加強，對農產品的質量提出了更高的要求。微生物殺菌劑成為植物病害防治研究的重要方面，具有廣泛的應用前景。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種解淀粉芽孢桿菌HM-6及其菌劑的制備方法和應用，該生防菌株HM-6具有安全、無毒、無環境污染的特點；菌劑制備方法簡單，成本低；HM-6及其菌劑對玉米鞘腐病的防效達75%以上，且施用簡單，可替代或減少化學農藥的施用，提高農產品的安全性；同時對玉米大斑病、番茄灰霉病、黃瓜枯萎病、蘋果斑點落葉病均有很強的抑制作用。

為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：

對采自不同環境土樣進行微生物的分離，以玉米鞘腐病病原菌為靶標菌，篩選得到防治效果穩定的拮抗菌HM-6，經鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。已于2017年01月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1 號院3號），保藏號為CGMCC No. 13627。

本發明還提供了含有解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑。

含有解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑的制備方法，包括下述步驟：

（1）將解淀粉芽孢桿菌HM-6接種于牛肉膏蛋白胨平板上，在28-32℃下活化1d；

（2）轉接于牛肉膏蛋白胨培養液中，在28-32℃、120-180rpm的搖床上培養16-20h，得種子液；

（3）按體積比為3%-5%的接種量將種子液接種到發酵培養基中，在28-35℃、110-150rpm條件下培養2-3d，得發酵液；

（4）發酵液離心，離心得到的固體經冷凍干燥后，得到菌粉；

（5）菌粉中加入助劑，制得含有解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑。

優選的，步驟（3）中，發酵培養基的組成成分及其重量百分比為：玉米粉3-5%、豆粕3-5%、氯化鈉0.2-0.4%、磷酸二氫鉀0.03-0.05%，其余為水；pH值為7.0-7.5。

優選的，步驟（5）中，助劑的組成成分及其與菌粉的重量百分比為：蔗糖2.0-2.6％，羧甲基纖維素2.0-3.5%，十二烷基硫酸鈉8.0-10.0%，硅藻土36.0-38.0%，菌粉50%。

進一步優選的，制得50%可濕性粉劑，活菌數達10⁹-10¹⁰CFU/g。

本發明還提供了解淀粉芽孢桿菌HM-6在防治玉米鞘腐病中的應用。

以及解淀粉芽孢桿菌HM-6在防治玉米大斑病、番茄灰霉病、黃瓜枯萎病、蘋果斑點落葉病中的應用。

本發明還提供了解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑在防治玉米鞘腐病中的應用。

以及解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑在防治玉米大斑病、番茄灰霉病、黃瓜枯萎病、蘋果斑點落葉病中的應用。

采用上述技術方案所產生的有益效果在于：

（1）針對近年來新發病害玉米鞘腐病有加重發生的趨勢，造成玉米產量和質量下降，損失嚴重，又缺乏有效防治措施的現狀，本發明提供了防治該病效果穩定的生防菌株HM-6并提供了其簡單易行的菌劑制備方法和應用技術；

（2）本發明的菌株HM-6是解淀粉芽孢桿菌，屬于目前生物防治中應用較為廣泛的芽孢桿菌屬成員之一，具有安全、無毒、無環境污染的特點；

（3）本發明的HM-6菌劑制備方法簡單，成本低；

（4）實踐證明，本發明的HM-6菌劑，對玉米鞘腐病具有很好的防治效果?？刹捎冒璺N和噴施兩種方式。拌種：菌劑500倍液拌種，堆悶4～8小時后直接播種，防效可達75%以上，即便發病，病斑也較小，對產量影響不大。噴施：在發病初期，隔7-10d噴施該菌劑500倍液，連續噴2-3次，其防效可達82.5%。且施用簡單，可替代或減少化學農藥的施用，提高農產品的安全性；

（5）同時本發明的HM-6菌劑對玉米大斑病、番茄灰霉病、黃瓜枯萎病、蘋果斑點落葉病均有很強的抑制作用。其中，對番茄灰霉病的預防作用防效可達81.3%，治療作用防效可達72.5%。

附圖說明

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明；

圖1是本發明實施例3中HM-6對玉米鞘腐病原菌的抑制效果圖；

圖2是本發明實施例3中HM-6對番茄灰霉病原菌的抑制效果圖；

圖3是本發明實施例3中HM-6對玉米大斑病原菌的抑制效果圖。

具體實施方式

實施例1

HM-6的分離、篩選與鑒定

（1）HM-6的分離：不同生境采集土樣，稱取土壤10g放入盛有90ml無菌水的三角瓶，充分振蕩20min，靜置10min，再吸菌液逐級稀釋得10^-5和10^-6的菌懸液，吸取0.2ml菌懸液至牛肉膏蛋白胨平板上，涂布均勻，每個稀釋度重復三次，置于28℃生化培養箱中培養24h，挑取菌落特征不同的單菌落進行劃線分離純化，接入斜面，得到不同的菌株，進行編號并記錄菌落特征，置于4℃冰箱保存備用。

（2）HM-6的篩選：

采用平板對峙培養的方法進行初篩。將玉米鞘腐病菌在PDA平板上培養后，用打孔器取直徑為0.6cm的菌盤，置于PDA平板的中央，將在牛肉膏蛋白胨平板上活化過的菌株劃線接至距病原菌2 cm處，每個處理重復3次，在25℃培養箱中培養4d。觀察有無抑菌帶產生，并記錄抑菌帶大小，將產生抑菌帶的菌株作為拮抗菌進行復篩。

采用活體測試法進行復篩。

將初篩獲得的拮抗菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在30℃、150rpm下培養48h，得菌懸液備用。玉米種子在25℃下催芽，播種于裝有滅菌珍珠巖的營養缽中，定期噴灑營養液，當株高約30cm時，進行實驗測試。將玉米鞘腐病菌在PDA平板上培養后，用打孔器取直徑為0.6cm的菌盤，長有菌絲的一面緊貼于葉鞘，用膠帶小心固定到玉米葉鞘上。每株接種2個，待葉鞘處出現典型病斑后噴拮抗菌菌懸液，并設清水對照，每個處理10株。置于溫室培養，觀察記錄發病狀況，進行統計分析，計算防效。期間每隔一天每個營養缽加入20mL的營養液。

通過上述方法篩選得到防治效果穩定的HM-6。

（3）HM-6的鑒定：通過對HM-6進行培養特征觀察、顯微觀察、革蘭氏染色、16S rDNA全序列分析、系統發育分析等研究，結果初步鑒定其為解淀粉芽孢桿菌。

形態特征：牛肉膏培養基上生長初期，菌落呈白色，邊緣光滑，有突起，水潤透明，不產色素。生長后期菌株呈乳白色，邊緣呈小波浪狀，有明顯的突起，褶皺，不產色素，呈黏稠狀。PDA培養基上生長初期與牛肉膏上相似，后期轉為黃褐色，邊緣光滑，突起不明顯，菌落外緣有透明圈。通過染色在顯微鏡下觀察，細胞短桿狀，具有運動性，周生鞭毛，芽孢直徑小于菌體、中生，革蘭氏染色呈陽性。

分子生物學鑒定：將提取的拮抗菌HM-6基因組DNA進行16S rDNA的PCR擴增。PCR擴增的引物27F：5^’ GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3^’；1492R：5^’CGGCTACCTTGTTACGACTT 3^’。PCR擴增產物回收后寄送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。然后將測序結果在Blast在線分析比對，并構建系統發育樹來鑒定其分類地位。結果與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens AB006920)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis subsp AJ276351)相似度均達99%。利用MEGA軟件構建出系統發育樹，其與解淀粉芽孢桿菌處于同一分支，結合細菌生長形態特征，鑒定HM-6為解淀粉芽孢桿菌。

實施例2

含有解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑的制備方法，包括下述步驟：

首先將解淀粉芽孢桿菌HM-6接種于牛肉膏蛋白胨平板上，在28℃下活化1d，然后轉接于牛肉膏蛋白胨培養液中，在28℃、120rpm的搖床上培養18h，得種子液，最后按體積比為3%的接種量將種子液接種到發酵培養基（重量百分比：玉米粉4%、豆粕3%、氯化鈉0.3%、磷酸二氫鉀0.04%，其余為水；pH7.0-7.5）中，在30℃、150rpm條件下培養3d，得發酵液，發酵液離心，離心得到的固體經冷凍干燥后，得到菌粉。然后菌粉中加入助劑（重量百分比：2.5％蔗糖，8.5% SDS，3.0% CMC，36.0%硅藻土，50%菌粉），制得含有解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑（50%可濕性粉劑，活菌數達10⁸-10⁹cfu/g）。

實施例3

含有解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑的應用

（一）對玉米鞘腐病的防治作用（溫室盆栽試驗）

拌種施用：菌劑500倍液拌種，堆悶4～8h后直接播種于裝有滅菌珍珠巖的營養缽中，定期噴灑營養液，當株高約30cm時，進行實驗測試。將玉米鞘腐病菌在PDA平板上培養后，用打孔器取直徑為0.6cm的菌盤，長有菌絲的一面緊貼于葉鞘，用膠帶小心固定到玉米葉鞘上。每株接種2個，接20株。并設清水對照。置于溫室培養，觀察記錄發病狀況，進行統計分析，計算防效。期間每隔一天每個營養缽加入20mL的營養液。

葉面噴施：玉米種子在25℃下催芽，播種于裝有滅菌珍珠巖的營養缽中，定期噴灑營養液，當株高約30cm時，進行實驗測試。將玉米鞘腐病菌在PDA平板上培養后，用打孔器取直徑為0.6cm的菌盤，長有菌絲的一面緊貼于葉鞘，用膠帶小心固定到玉米葉鞘上。每株接種2個，待葉鞘處出現典型病斑后噴菌劑500倍液，隔7d噴一次，連續噴3次。并設清水對照。每個處理20株。置于溫室培養，觀察記錄發病狀況，進行統計分析，計算防效。期間每隔一天每個營養缽加入20mL的營養液。

測試結果表明含有解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑通過拌種對玉米鞘腐病的防效可達75%以上；通過葉面噴施其防效可達82.5%。

HM-6對玉米鞘腐病原菌的抑制效果，見圖1所示。

（二）對番茄灰霉病的防治作用（溫室盆栽試驗）

番茄種子在25℃下催芽，播種于裝有滅菌珍珠巖的營養缽中，當株高約20cm時，進行實驗測試作如下處理。

預防作用：

處理1：噴500倍液含有解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑24h后接種番茄灰霉病原菌

處理2：噴清水24h后接種番茄灰霉病原菌

處理3：常規種植，不噴菌劑不接種病原菌

治療作用：

處理1：接種番茄灰霉病原菌1d、7d、15d后連續噴含有解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑500倍液3次

處理2：接種番茄灰霉病原菌1d、7d、15d后噴清水

處理3：常規種植，不噴菌劑不接種病原菌

每個處理20株。置于溫室培養，每隔一天每個營養缽加入20mL的營養液。觀察記錄發病狀況，進行統計分析，計算防效。

測試結果表明含有解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑對番茄灰霉病既具有預防作用，也具有治療效果。其預防作用防效可達81.3%，治療作用防效可達72.5%。

HM-6對番茄灰霉病原菌的抑制效果，見圖2所示。

（三）對其他病原菌的抑制作用

通過平板對峙培養測試，該含有解淀粉芽孢桿菌HM-6的菌劑對玉米大斑病、黃瓜枯萎病、蘋果斑點落葉病均有很強的抑制作用。

HM-6對玉米大斑病原菌的抑制效果，見圖3所示。

本發明生防菌株HM-6具有安全、無毒、無環境污染的特點；菌劑制備方法簡單，成本低；HM-6及其菌劑對玉米鞘腐病的防效達75%以上，且施用簡單，可替代或減少化學農藥的施用，提高農產品的安全性；同時對玉米大斑病、番茄灰霉病、黃瓜枯萎病、蘋果斑點落葉病均有很強的抑制作用。