本發明涉及生物化工領域，更具體的，本發明涉及一種能增強丁二酸分泌能力的產丁二酸大腸桿菌的構建方法及應用。

背景技術：

丁二酸又稱琥珀酸，是重要的C4平臺化合物，被廣泛應用于醫藥、香料、油漆、染料、食品等行業，將其作為前體可合成四氫呋喃、γ-丁內酯、1，4-丁二醇等有機化學品以及聚丁二酸丁二醇酯類生物可降解材料。此外，丁二酸還用于生產抗生素、氨基酸及維生素等利于人類健康的中間體，被美國能源部認為是未來12種最有價值的生物煉制產品之一，市場需求量保持在10％以上的年增長率。

目前丁二酸主要由石化合成或微生物發酵制備。相比于化學合成，微生物發酵制備具有原料來源廣泛且價格低廉，污染小，環境友好，且在發酵過程中可以吸收固定CO₂，能有效緩解溫室效應，故成為近年來研究的熱點。

構建獲得具有優良丁二酸生產性能的發酵菌株是實現生物法高效制備丁二酸的關鍵之一。目前的研究熱點主要集中在產琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)，產琥珀酸曼氏桿菌(Mannheimiasucciniciproducens)，重組大腸桿菌(Escherichia coli)及重組谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)等。其中野生型菌株雖具有較高的丁二酸生產能力，但培養過程中對氮源的要求較高，且過程中產生大量的副產物如甲酸、乙酸等，阻礙了其工業化應用。而重組大腸桿菌由于遺傳背景清楚，基因工程改造易行且培養基要求簡單等優點，近年來被廣泛用于研究以獲得高產丁二酸生產菌株。

當利用E.coli兩階段發酵產琥珀酸過程中，在厭氧階段結束時，去除發酵液中的產物(主要是琥珀酸)，將細胞轉入新鮮培養基中，從而使細胞處于較低的，滲透壓和離子強度條件下，細胞能夠再次生長，并在厭氧條件下發酵生產琥珀酸。可見發酵后期大腸桿菌自身轉運丁二酸的能力受限，因此，如何提高菌株抗逆性能及轉運羧酸能力，顯得尤為重要。

本發明通過在大腸桿菌中異源表達來自于谷氨酸棒狀桿菌的轉運蛋白(Gene ID:1020162)，強化菌株對胞內的丁二酸產物的轉運能力，減少胞內丁二酸的積累，且可解除產物抑制，進一步提高菌株丁二酸的生產能力。目前，雖然有相關報道表明可通過強化菌株轉運能力提高丁二酸產量，但是篩選獲得合適的轉運蛋白仍是難點且報道較少。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術存在的問題，提供一種能增強丁二酸分泌能力的重組大腸桿菌構建方法，通過提高菌株羧酸轉運能力，同時解除產物抑制，達到提高丁二酸產量的目的。

為了實現本發明的目的，本發明采用了以下技術方案：

以缺乏乳酸脫氫酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因活性且磷酸轉移酶系統的ptsG染色體發生自發突變的大腸桿菌為出發菌株，構建含有谷氨酸棒狀桿菌NCgl2130基因(Gene ID:1020162)的重組大腸桿菌。

優選的，所述出發菌株選用E.coliAFP111。

本發明的技術方案具體可采用如下步驟實現：

(1)將谷氨酸棒狀桿菌NCgl2130基因克隆到pTrc99a質粒上，得到重組質粒；

(2)將重組質粒pTrc99a-NCgl2130轉化入出發菌株中，即得到大腸桿菌重組菌。

具體的，上述(1)中重組質粒采用如下方式構建：

(1)以谷氨酸棒狀桿菌基因組為模板，利用PCR擴增體系擴增NCgl2130基因片段，PCR產物片段回收：

(2)利用雙酶切體系，雙酶切pTrc99a質粒和PCR回收片段，酶切產物經電泳后回收雙酶切的質粒及基因片段，利用T4連接體系，將前述經雙酶切的質粒和基因片段連接；其中，酶切位點為Hind III和Xba I；

(3)將連接產物利用CaCl₂轉化法轉化至E.coli DH5α，挑取陽性克隆做菌落PCR驗證，將正確的陽性克隆培養后提取重組質粒。

本發明的另一目的在于提供上述方法構建的重組菌株。

本發明的又一目的在于提供上述方法構建的重組菌株在丁二酸生產中的應用。

本發明采用厭氧搖瓶或發酵罐發酵重組大腸桿菌生產丁二酸，其中厭氧搖瓶采用一步厭氧發酵法；發酵罐采用二階段發酵法，有氧階段提高生物量，厭氧階段發酵產酸。

重組菌進行厭氧搖瓶發酵條件優化，出發菌做空白對照，具體步驟為：

(1)厭氧發酵溫度條件優化：重組菌活化培養后，轉厭氧搖瓶發酵，厭氧搖瓶按照20℃、25℃、30℃、35℃、40℃五個溫度梯度，轉速200r/min，發酵時間為48h進行同批次發酵，每個條件做三個平行實驗，出發菌做空白對照；

(2)厭氧發酵誘導劑濃度優化：重組菌活化培養后，轉厭氧搖瓶發酵，厭氧搖瓶按照0、0.1、0.3、0.5mmol/L四種誘導劑濃度梯度，轉速200r/min，發酵時間為48h進行同批次發酵；每個條件做三個平行實驗，出發菌做空白對照；

結果表明，厭氧搖瓶發酵最優條件為：溫度30℃，IPTG濃度0.1mmol/L，轉速200r/min，發酵時間48h。此條件下，重組菌DCW 1.77g/L，耗糖21g/L，產丁二酸17.65g/L；而出發菌DCW 1.37g/L，耗糖17g/L，產丁二酸14.10g/L；相對于出發菌株，丁二酸產量提高25.2％(注:數值均為三個平行樣的平均值)。

重組菌進行3L發酵罐放大實驗，出發菌做空白對照，采用二階段發酵法的具體步驟如下：

(1)平板活化，種子培養；

(2)發酵生產丁二酸：將搖瓶培養的種子液全部接入裝有1.5L發酵培養基的3L發酵罐中，接種量10％(v/v)，接種后一次性補加葡萄糖至30g/L，用20％質量分數的碳酸鈉調pH維持在6.8左右，轉速200r/min，37℃下有氧培養長菌體，當OD長到0.6左右，加入誘導劑(0.1mmol/L)，并將溫度控制在30℃進行有氧誘導。當糖耗盡后，補加葡萄糖至30g/L，200r/min，pH＝6.8，溫度30℃進行厭氧發酵。若糖耗盡，繼續一次性補加葡萄糖至30g/L，進行厭氧發酵，直至不再耗糖為止；

結果表明，重組菌DCW 3.88g/L，耗糖70g/L，產丁二酸58.5g/L；而出發菌DCW 3.77g/L，耗糖60g/L，產丁二酸50.5g/L；相對于出發菌株，丁二酸產量提高15.8％。

本發明通過異源表達來自于由谷氨酸棒狀桿菌的轉運蛋白(SucE)，構建了一株丁二酸分泌能力明顯增強的重組大腸桿菌；通過厭氧發酵條件的優化及3L發酵罐放大實驗可知，該重組菌對丁二酸的分泌能力明顯提高，整個過程菌體生長、耗糖及丁二酸生產能力明顯增強。該研究為強化大腸桿菌轉運丁二酸能力提供了一個新的優良轉運蛋白，為強化丁二酸分泌性能提供了一種新途徑。

附圖說明

圖1是擴增出的基因NCgl2130的電泳條帶；圖中M：5kb marker；

圖2是重組菌DH5α菌落PCR的電泳條帶；圖中M：5kb marker；

圖3是重組菌AFP11質粒單雙酶切驗證的電泳條帶；圖中M1:5kb marker；M2:10kb marker；1、2泳道經Hind III和Xba I酶切，3、4泳道經Hind III酶切；

圖4是重組菌表達目的蛋白的蛋白膠驗證條帶；

圖5是3L發酵罐放大實驗發酵結果。

具體實施方式

根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所描述的本發明。

實施例中選用的出發菌株大腸桿菌AFP111來源：

Applied and environmental microbiology,2001,67(1):148-154.申請人首先通過查閱到該生物材料的上述文獻出處，并聯系了發表人系美國芝加哥大學的David P.Clark教授，并郵件請求其贈與該生物材料，并免費獲得了該生物材料；且申請人保證從本申請日起二十年內向公眾發放該生物材料。

實施例1：

本實施例中，重組大腸桿菌構建的具體方法如下:

以谷氨酸棒狀桿菌CorynebacteriumglutamicumATCC13032基因組為模板，擴增谷氨酸棒狀桿菌NCgl2130基因片段。

其中上游引物序列：

5-GCTCTAGAGAACGTGCCCAGTTCCACATCAAATAACGC-3

下游引物序列：

5-CCCAAGCTTTGCCGAGAAGTTGAACAGCAATCTTGCAG-3

PCR擴增體系為：谷氨酸棒狀桿菌基因組模板(不少于200ng)1μL，引物上游Primer 1和下游Primer 2各1μL，dNTP 4μL，5×Primer star緩沖液10μL，Primer star聚合酶0.5μL，ddH₂O 32.5μL。

PCR反應程序為：94℃預變性10min，94℃變性45s；然后57℃退火45s，72℃延伸2min，循環30次；72℃延伸10min。

PCR產物進行PAGE實驗，將正確的擴增條帶(圖1)按照柱式割膠回收試劑盒回收。

雙酶切體系為：10×緩沖液5μL，Hind III 1μL，Xba I 1μL，底物(環狀質粒或目的基因)10μL，ddH₂O 33μL，總體積50μL；對質粒pTrc99a和目的基因NCgl2130分別按照50μL雙酶切體系進行酶切。

雙酶切產物進行PAGE實驗，用柱式割膠回收試劑盒回收，經膠回收的目的基因片段和質粒進行連接。

連接反應體系為：T4ligase 10×Buffer 2μL，酶切質粒(50ng左右)2μL，基因片段(200ng左右)5μL，T4ligase 0.5μL，ddH₂O10.5μL，總體積20μL。連接得到重組質粒pTrc99a-NCgl2130。

轉化感受態細胞實驗：取2μL重組質粒pTrc99a-NCgl2130加入制備好的200μLDH5α感受態細胞中，用手指輕彈均勻，冰浴30min，42℃水浴熱激90s，快速置于冰上2min后，再加入1mL新鮮的SOC培養液，于37℃，200r/min振蕩培養1h，取上述培養菌液100μL涂布于含抗性(氯霉素，卡那霉素，氨芐霉素)LB固體培養基表面，放37℃培養箱中培養12h；菌落PCR并進行電泳鑒定(圖2)，篩選出正確的陽性克??；將驗證正確的陽性克隆接種于含抗性(氯霉素，卡那霉素，氨芐霉素)LB試管中培養并提取重組質粒，再按照同樣的轉化法將提取的重組質粒轉化入AFP111感受態細胞中，篩選陽性克隆即培養后提取重組質粒進行單雙酶切，酶切產物進行PAGE鑒定(圖3)；通過鑒定，成功篩選出含重組質粒的陽性克隆，最后對該單克隆菌落進行保種并放-80℃冰箱保藏。

實施例2：

本實施例中，重組大腸桿菌膜蛋白提取的具體方法如下：

平板培養：將實施例1獲取的重組菌接種在平板培養基上厭氧培養，培養溫度為37℃，培養時間為12h；

種子培養：將平板培養的重組菌接種到試管種子培養基中，裝液量為5mL，培養溫度為37℃，轉速200r/min，培養時間為14h；

有氧誘導：將試管培養的重組菌接種到500mL搖瓶中，裝液量為100mL，接種量1％(v/v)，誘導劑IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)濃度為0.5mmol/L，誘導溫度為37℃，轉速200r/min，培養時間8h；

膜蛋白提?。喊凑漳さ鞍滋崛≡噭┖?生工Sangon Biotech)提供的方法，提取膜蛋白并進行SDS-PAGE實驗(圖4)，凝膠成像儀觀察電泳條帶，出發菌做空白對照。結果表明，重組菌的膜蛋白提取液跑出60kDa的蛋白條帶，而對照菌沒有，可見，重組菌能夠成功表達出目的蛋白；

平板培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L；

種子培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L。

實施例3：

本實施例中，重組菌厭氧發酵溫度條件優化的具體方法如下：

平板培養：將實施例1獲取的重組菌接種在平板培養基上厭氧培養，培養溫度為37℃，培養時間為12h；

種子培養：將平板培養的重組菌接種到試管種子培養基中，裝液量為5mL，培養溫度為37℃，轉速200r/min，培養時間為14h；再將試管培養的重組菌接種到500mL搖瓶中，裝液量為100mL，接種量1％(v/v)，培養溫度為37℃，轉速200r/min，培養時間8h；

厭氧發酵：將種子培養液接種到100mL厭氧搖瓶發酵培養基中，裝液量為30mL，接種量10％(v/v)，堿式碳酸鎂0.72g作為pH調節劑，初始葡萄糖30g/L，向培養基中加入誘導劑IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)濃度為0.1mmol/L，充二氧化碳2min；轉速200r/min，溫度按照20℃、25℃、30℃、35℃、40℃五個梯度，發酵時間為48h；每個條件做三個平行實驗；

平板培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L；

種子培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L；

發酵培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，誘導劑0.1mmol/L，葡萄糖30g/L，堿式碳酸鎂24g/L。

重組菌厭氧發酵溫度優化的結果如表1所示：

表1重組菌厭氧發酵溫度的優化

發酵結果表明，厭氧搖瓶發酵最優溫度為30℃，在此溫度條件下，重組菌DCW 1.67g/L，耗糖20g/L，產丁二酸15.65g/L，收率為78.3％(注:數值均為三個平行樣的平均值)。

實施例4：

本實施例中，重組菌厭氧發酵誘導劑濃度優化的具體方法如下：

平板培養：將重組菌接種在平板培養基上厭氧培養，培養溫度為37℃，培養時間為12h；

種子培養：將平板培養的重組菌接種到試管種子培養基中，裝液量為5mL，培養溫度為37℃，轉速200r/min，培養時間為14h；再將試管培養的重組菌接種到500mL搖瓶中，裝液量為100mL，接種量1％(v/v)，培養溫度為37℃，轉速200r/min，培養時間8h；

厭氧發酵：將種子培養液接種到100mL厭氧搖瓶發酵培養基中，裝液量為30mL，接種量10％(v/v)，堿式碳酸鎂0.72g作為pH調節劑，初始葡萄糖30g/L，溫度30℃，充二氧化碳2min；轉速200r/min，誘導劑IPTG濃度按照0，0.1，0.3，0.5mmol/L四個濃度梯度，發酵時間為48h；每個條件做三個平行實驗；

平板培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L；

種子培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L；

發酵培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，誘導劑0.1mmol/L，葡萄糖30g/L，堿式碳酸鎂24g/L。

重組菌厭氧發酵誘導劑濃度優化的結果如表2所示：

表2重組菌厭氧發酵誘導劑濃度的優化

發酵結果表明，厭氧搖瓶發酵最優誘導劑濃度為0.1mmol/L，在此誘導劑濃度下，重組菌DCW 1.79g/L，耗糖22g/L，產丁二酸17.66g/L，收率為80.3％(注：數值均為三個平行樣的平均值)。

實施例5：

本實施例中，重組菌厭氧搖瓶發酵(其中出發菌做空白對照)的具體方法如下：

平板培養：將重組菌接種在平板培養基上厭氧培養，培養溫度為37℃，培養時間為12h；

種子培養：將平板培養的重組菌接種到試管種子培養基中，裝液量為5mL，培養溫度為37℃，轉速200r/min，培養時間為14h；再將試管培養的重組菌接種到500mL搖瓶中，裝液量為100mL，接種量1％(v/v)，培養溫度為37℃，轉速200r/min，培養時間8h；

厭氧發酵：將種子培養液接種到100mL厭氧搖瓶發酵培養基中，裝液量為30mL，接種量10％(v/v)，堿式碳酸鎂0.72g作為pH調節劑，初始葡萄糖30g/L，向培養基中加入誘導劑IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)濃度為0.1mmol/L，充二氧化碳2min；誘導溫度為30℃，轉速200r/min，發酵時間為48h；出發菌做空白對照；

平板培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L；

種子培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L；

發酵培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，誘導劑0.1mmol/L，葡萄糖30g/L，堿式碳酸鎂24g/L。

菌株厭氧搖瓶發酵結果如下表3所示:

表3菌株厭氧搖瓶發酵結果

發酵結果表明，重組菌DCW 1.77g/L，耗糖21g/L，產丁二酸17.65g/L；而出發菌DCW1.37g/L，耗糖17g/L，產丁二酸14.10g/L；相對于出發菌株，丁二酸產量提高25.2％(注:數值均為三個平行樣的平均值)。

實施例6：

本實施例中，重組菌3L發酵罐放大實驗(出發菌做空白對照)，并采用二階段發酵法的具體步驟如下：

平板培養：將重組菌接種在平板培養基上厭氧培養，培養溫度為37℃，培養時間為12h；

種子培養：將平板培養的重組菌接種到試管種子培養基中，裝液量為5mL，培養溫度為37℃，轉速200r/min，培養時間為14h；再將試管培養的重組菌接種到500mL搖瓶中，裝液量為100mL，接種量1％(v/v)，培養溫度為37℃，轉速200r/min，培養時間8h；

厭氧發酵：將搖瓶培養的種子液全部接入裝有1.5L發酵培養基的3L發酵罐中，接種量10％(v/v)，接種后一次性補加葡萄糖至30g/L，用20％質量分數的碳酸鈉調pH維持在6.8左右，轉速200r/min，37℃下有氧培養長菌體，當OD長到0.6左右時，加入誘導劑IPTG(終濃度0.1mmol/L)，并控制溫度30℃有氧誘導。當糖耗盡后，再次補加葡萄糖至30g/L，并轉接厭氧進行發酵，溫度37℃，200r/min，pH＝6.8。若糖耗盡，繼續一次性補加葡萄糖至30g/L，進行厭氧發酵，直至不再耗糖為止；其中出發菌做空白對照。

平板培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L；

種子培養基配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L；

發酵培養基配方為：Citric Acid 3g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 4g/L，KH₂PO₄8g/L，(NH₄)₂HPO₄8g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，(NH4)₂SO₄0.75g/L，NH₄Cl 0.2g/L，CaCl₂·2H₂O 10mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.5mg/L，CuCl₂·2H₂O 0.25mg/L，MnSO₄·H₂O 2.5mg/L，CoCl₂·6H₂O 1.75mg/L，H₃BO₃0.12mg/L，Al₂(SO₄)₃1.77mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/L，Fe(III)citrate16.1mg/L；VB₁20mg/L(單獨滅菌加入)，Biotin 2mg/L(單獨滅菌加入)，121℃高壓滅菌15分鐘。菌株3L發酵罐放大實驗發酵結果如圖5所示。

圖中，DCW 1，Glucose 1，Succinate 1為出發菌株AFP111發酵數據；DCW 2，Glucose 2，Succinate 2為重組菌株AFP111/pTrc99a-NCgl2130發酵數據。

發酵結果表明，重組菌DCW 3.88g/L，耗糖70g/L，產丁二酸58.5g/L；而出發菌DCW3.77g/L，耗糖60g/L，產丁二酸50.5g/L；相對于出發菌株，丁二酸產量提高15.8％。