本發(fā)明屬化學與生物傳感技術領域，具體涉及一種具有熒光性能的蛋白質染色劑，以及該蛋白質染色劑的制備方法和應用。

背景技術：

有機小分子熒光探針廣泛的應用于環(huán)境科學、生命科學和材料科學等領域，并日益成為現(xiàn)代生命科學及疾病診斷等領域不可缺少的研究手段，因此，開發(fā)具有實用價值的功能性熒光染料分子倍受關注。以有機熒光團為基礎的分子熒光探針具有靈敏度高、操作簡便、重現(xiàn)性好、膜透性好、原位檢測等眾多優(yōu)點。而且，熒光染料常用作熒光探針，在標記生物分子或微粒的生物工程與醫(yī)療檢測領域具有重要應用。目前，許多的應用是利用熒光染料作為檢測工具，其需要熒光染料與蛋白質、氨基酸、核酸及其他的生物分子共價結合形成染料標記的配體。

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是Shapiro于1967年建立的，經(jīng)過不斷的改進、完善，現(xiàn)在已廣泛應用于蛋白質分析。由于SDS覆蓋蛋白質分子，使蛋白質能夠根據(jù)分子大小帶有相應的負電荷，使得蛋白質的電泳遷移率不受其原有電荷影響，而只與相對分子質量有關。因此通過SDS-PAGE可分離蛋白并測定蛋白質相對分子質量和蛋白質純度。在采用SDS-PAGE分析蛋白質特性時，考馬斯亮藍、銀染等是應用最為廣泛的蛋白染色劑，但是它們都需要進行單獨的染色和脫色過程，步驟繁瑣，操作要求高，且銀染稍有不慎會造成很深的背景，影響結果的清晰度，最嚴重的是，有的銀染膠脫色困難；考馬斯亮藍染色雖然染色背景低，但靈敏度低且消耗時間長。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種穩(wěn)定性好、固色性強的熒光蛋白質染色劑，并為該染色劑提供一種制備方法和應用。

解決上述技術問題所采用的技術方案是該熒光蛋白質染色劑的結構式如下：

上述熒光蛋白染色劑的制備方法如下：

1、在0℃、攪拌條件下，將干燥的環(huán)己酮和濃硫酸混合，然后加入4-二乙氨基酮酸，待4-二乙氨基酮酸完全溶解后，升溫至85～95℃，恒溫反應1.5～2小時，冷卻至常溫，將反應液倒入冰中，再加入質量分數(shù)為70％的高氯酸水溶液，過濾并用冰水洗滌，所得固體真空干燥。

2、在0℃、攪拌條件下，將POCl₃和N,N-二甲基甲酰胺按體積比為1:2.5～3.5混合；將步驟1真空干燥后的固體完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺后，滴加到N,N-二甲基甲酰胺和POCl₃的混合液中，滴加完后升溫至85～95℃，恒溫反應3～4小時，冷卻至常溫，將反應液倒入蒸餾水中，分離純化產物，得到熒光蛋白染色劑。

上述步驟1中，優(yōu)選4-二乙氨基酮酸與環(huán)己酮的摩爾比為1:1.5～2.5，干燥的環(huán)己酮和濃硫酸的體積比為1:10～15。

上述步驟2中，優(yōu)選步驟1真空干燥后的固體與POCl₃的摩爾比為1:1～1.5。

上述熒光蛋白染色劑在蛋白質染色中的用途，染色方法為常規(guī)蛋白質染色方法。

本發(fā)明的有益效果如下：

1、本發(fā)明染色劑的水溶液具有強烈的熒光，且該染色劑含有醛基(—CHO)，能與蛋白質上的氨基(—NH₂)反應，形成共價鍵，利于在染色時與客體產生相互作用，染色牢固，不易脫色，提高了染色與熒光檢測效果，提高了靈敏度，有利于熒光或裸眼識別與檢測。同時，本發(fā)明染色劑具有色澤鮮艷、色譜齊全、優(yōu)異耐洗牢度、價格相對便宜、應用工藝簡便的特點。

2、本發(fā)明染色劑可以在蛋白質的預處理過程中與蛋白質結合進行染色，然后進行SDS-PAGE分離，分離后即可直接進行蛋白質的分析與檢測，與傳統(tǒng)的考馬斯亮藍及銀染方法相比較，SDS-PAGE分離后不需要進行單獨的染色和脫色過程，具有使用方便、操作步驟少、節(jié)約時間、靈敏度高的優(yōu)點。

附圖說明

圖1是本發(fā)明熒光蛋白質染色劑的熒光光譜圖。

圖2是牛血清白蛋白的染色圖。

圖3是溶菌酶的染色圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于這些實施例。

實施例1

1、將35mL質量分數(shù)為98％的濃硫酸加入到干燥的圓底燒瓶中，再向圓底燒瓶中逐滴加入3.3mL(31.85mmol)干燥的環(huán)己酮，并將其冷卻到0℃，然后在劇烈攪拌的情況下，向圓底燒瓶中分批加入總質量為5.0136g(16mmol)的4-二乙氨基酮酸，待4-二乙氨基酮酸完全溶解后，在90℃水浴鍋中加熱反應1.5小時，反應完后反應液顏色呈黑紅色，將反應液冷卻至常溫后傾入到150g冰中，再加入3.5mL質量分數(shù)為70％的高氯酸水溶液，過濾并且用100mL冰水洗滌，所得固體在真空烘箱中45℃烘干。所得干燥產物的MS(ESI+)m/z:實測值376.1909[M+H]⁺，理論值[C₂₄H₂₆NO₃]⁺:376.1907。

2、將1.5mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)加入到圓底燒瓶中，在冰水浴中冷卻到0℃，在劇烈攪拌的情況下，將0.56mL(6mmol)POCl₃逐滴緩慢加到圓底燒瓶中；將1.875g(5mmol)步驟1真空干燥后的固體用10mL DMF完全溶解后，緩慢加入到DMF和POCl₃的混合液中，在90℃水浴鍋中加熱反應3小時，此時反應液顏色為紅棕色；將反應液冷卻至常溫后傾入到水中，用二氯甲烷萃取并旋蒸后，在真空烘箱中45℃烘干，用石油醚與乙酸乙酯、甲醇的體積比為9:3:0.4的混合液為展開劑進行柱色譜分離提純，得到熒光蛋白染色劑0.8859g，其產率為47.3％。

所得產物的結構表征數(shù)據(jù)為：MS(ESI+)m/z:實測值404.1858[M+H]⁺,理論值[C₂₅H₂₅NO₄]⁺404.1856；¹H NMR(400MHz,CDCl₃,d/ppm)δ:10.50-10.17(m,1H),7.73-7.32(m,2H),7.30-7.12(m,1H),6.56(d,J＝9.3Hz,1H),6.35(d,J＝3.0Hz,1H),6.26(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),3.81-3.12(m,4H),2.61-1.36(m,5H),1.26(dd,J＝20.4,12.8Hz,3H),1.16(t,J＝7.4Hz,3H)。

將所得染色劑完全溶解于蒸餾水中，采用RF-5301型熒光分光光度計進行表征，結果見圖1。由圖可見，此染色劑的激發(fā)波長為476nm，發(fā)射波長為564nm。

實施例2

實施例1制備的熒光蛋白質染色劑在牛血清白蛋白染色中的用途，具體方法如下：

樣品的預處理：將熒光蛋白質染色劑完全溶解無水乙醇中，再加入蒸餾水，配制成1mg/mL的熒光蛋白質染色劑溶液；將50μL 1mg/mL的熒光蛋白質染色劑溶液和20μL 1mg/mL牛血清白蛋白水溶液加入25μL pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，并加入10μL甘油，充分混合后，在57℃下加熱1小時，在3000rpm的轉速下離心10min。

電泳分離：取15μL離心后的上清液加入聚丙烯酰胺凝膠(分離膠7.5％，濃縮膠4％)的泳道中，下槽中加入1000mL電泳緩沖液(3.0g Tris、14.4g甘氨酸、剩余為蒸餾水)，在濃縮膠部分施加100V的恒壓，當鮮紅色的條帶跑至分離膠部分時，電壓升至150V，直到條帶跑至凝膠下邊緣1cm處時，停止電泳，在凝膠成像儀上拍照，結果見圖2。由圖可見，本發(fā)明熒光蛋白質染色劑能夠對牛血清白蛋白進行染色。

實施例3

實施例1制備的熒光蛋白質染色劑在溶菌酶染色中的用途，具體方法如下：

樣品的預處理：將熒光蛋白質染色劑完全溶解無水乙醇中，再加入蒸餾水，配制成1mg/mL的熒光蛋白質染色劑溶液；將50μL 1mg/mL的熒光蛋白質染色劑溶液和20μL 1mg/mL溶菌酶水溶液加入25μL pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，并加入10μL甘油，充分混合后，在57℃下加熱1小時，使溶菌酶充分變性，在3000rpm的轉速下離心10min。

電泳分離：取15μL離心后的上清液加入聚丙烯酰胺凝膠(分離膠16.5％，夾層膠10％，濃縮膠4％)的泳道中，下槽中加入1000mL電泳緩沖液(3.0g Tris、14.4g甘氨酸、剩余為蒸餾水)，在溫度為4℃、電流為25mA的條件下進行電泳，直到條帶跑至凝膠下邊緣1cm處時，停止電泳，在凝膠成像儀上拍照，結果見圖3。由圖可見，本發(fā)明熒光蛋白質染色劑能夠對溶菌酶進行染色。