專利名稱：一種精子熒光染色測定方法
技術領域：
本發明涉及熒光染色，尤其涉及核酸染色，更涉及精子熒光染色。
背景技術：
精子密度、精子膜完整性以及精子的運動狀態是臨床男科實驗室評估精液
質量的最常用的指標。使用計算機輔助精子分析(CASA)可以較精確的提供精 子動力學的量化數據，但目前臨床上用的CASA不能用于精子密度的檢測，因 為它難以將精子從非精子的顆粒碎片中區分開來。CASA系統的另一個缺點是不 能區分不動的精子和死精子，特別是需輔助生殖治療的男性患者，如果不動精 子(D級)的百分數超過50%，則應檢測精子的存活率，而且存活率評估可核
查精子活力評估的準確性。
精子存活率檢測最常用的是伊紅染色和精子尾部低滲膨脹試驗，兩種方法
最大的缺點是重復性差，不同實驗室間的結果差異很大，而且操作過程中，對 精子的活率有顯著的影響，有的精子甚至已經不動了。
因此，本領域迫切需要提供一種熒光染色方法，它能準確區分死細胞和活 細胞，對非細胞成分拒染，同時又沒有細胞毒性，即染料的加入不影響細胞正 常的生命活動，那么畫A熒光染色CASA代替現有的CASA指日可待了 。

發明內容
本發明旨在提供一種精子熒光染色測定方法。
本發明的另一個目的是提供染料碘化丙啶(PI)和Transgreen在精子熒 光染色測定中的用途。
本發明的再一個目的是提供一種試劑盒，用于精子存活率熒光染色測定。
在本發明的第一個方面，提供了一種精子熒光染色測定方法，它包括步驟 (1)將精子、菲啶類染料和花菁類染料混合，得到混合溶液，所述的菲啶類 染料選自碘化丙啶、溴乙錠；花菁類染料選自Transgreen;(2)測定混合溶液中精子的熒光值。 在另一優選例中，它包括步驟
(1) 將精子、碘化丙啶和Transgreen混合，得到混合溶液；
(2) 計數混合溶液中綠色精子和/或紅色精子的個數，其中綠色精子是活精 子，紅色精子是死精子。
在另一優選例中，計數混合溶液中大于等于200個精子中綠色精子的個數。 在另一優選例中，混合溫度為20 — 37。C，更佳地為30 — 37。C。 在另一優選例中，所述的步驟(1)為將精子和碘化丙啶混合3 — 15分鐘后，
加入Transgreen，得到混合溶液。
在另一優選例中，精子和碘化丙啶混合5 — 10分鐘，更佳地，為4一9分鐘。 在另一優選例中，加入Transgreen混合5 — 20分鐘，進行步驟(2)的測定。
更佳地，加入Transgreen混合3—10分鐘。
在另一優選例中，精子和碘化丙啶混合的溶液濃度為12 — 48uM。 在另一優選例中，精子和碘化丙啶混合的溶液濃度為18 — 36uM，更佳地，為
21 — 30uM。
在另一優選例中，所述的步驟(1)為將精子和Transgreen混合3 —15分 鐘后，加入碘化丙啶，得到混合溶液。
在另一優選例中，精子和Transgreen混合5 —10分鐘，更佳地，為4一9分鐘。
在另一優選例中，加入碘化丙啶混合2 — 10分鐘，進行步驟(2)的測定。更
佳地，加入碘化丙啶混合3 — 7分鐘。
在另一優選例中，精子和Transgreen混合的溶液濃度為50 — 200nM。 在另一優選例中，精子和Transgreen混合的溶液濃度為75 — 150nM，更佳地，
為90 — 120nM。
在另一優選例中，所述的步驟(1)為將精子、碘化丙啶和Transgreen — 起加入，得到混合溶液。
在另一優選例中，精子、碘化丙啶和Transgreen —起加入后混合10 — 30分 鐘，較佳地為10 — 20分鐘，更佳地為15 — 20分鐘。
在本發明的第二方面，提供了一種菲啶類染料和花菁類染料形成的復合染料 的用途，所述的復合染料用于精子存活率熒光染色測定。在另一優選例中，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、溴乙錠；花菁類染料選
自Transgreeno
在本發明的第三方面，提供了一種試劑盒，它含有-
(a) 菲啶類染料，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、溴乙錠；和
(b) 花菁類染料，所述的花菁類染料選自Transgreen。
據此，本發明提供了一種熒光染色方法，它能準確區分死細胞和活細胞， 對非細胞成分拒染，同時又沒有細胞毒性，即染料的加入不影響細胞正常的生 命活動。


圖1顯示了 Transgreen染料和PI染料對精子運動參數的影響，即各組在
不同時間測定的活率；其中
T組表示精子懸液；A組表示精子懸液+ Transgreen; B組表示精子懸液十 PI; A+B組表示精子懸液+ Transgreen/PI。
圖2顯示了 Transgreen與PI加入時間先后對精子存活率統計的影響，即
各組在不同時間測定的存活率結果比較；其中
T組表示精子懸液；A60 + B組表示Transgreen預染60分鐘后加PI; B組 表示PI預染60分鐘后加Transgreen; (A+B) 60組表示Transgreen/PI復合 染料染色60分鐘。
具體實施例方式
發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現了一種精子存活率熒光染色方法， 本發明提供的方法是將精子懸液與PI和Transgreen混合，在適宜的溫度下培 養。該方法(1)可以精準地了解精子的密度；(2)可以準確地了解精子的存 活率；(3)可以有效地排除非精子因素的干擾；(4)可有效保持存活精子的 活力。
本發明提供的精子熒光染色測定的方法是將精子懸液分別與菲啶類染料， 花菁類染料或復合染料混合共孵育。
5在本發明的一個優選例中，是將精子懸液與復合染料Transgreen/PI混合 共孵育。溶液中會有染成綠色和紅色的精子，綠色的精子是活精子，紅色的精 子是死精子，測定混合溶液中大于等于200個精子中綠色精子所占的比例即為 精子的存活率。
然后可以運用一些分析軟件，得到有關精子密度、存活情況、活力等的參 數。所述的分析軟件包括但不限于計算機輔助精子精液質量分析系統、動(靜) 態圖像分析系統、熒光顯微鏡或流式細胞儀。
精子質膜的完整性對于受精十分重要。目前臨床男科實驗室依然用精子伊 紅Y染色或精子尾部低滲膨脹試驗作為常用的活體精子染色技術，這些方法存 在著一定的主觀性、可變性以及靈敏度差等缺點。熒光染色技術有靈敏度高、 便于觀察等特點，如果將熒光染色技術動態地應用于計算機輔助精子自動分析 系統及流式細胞儀，則可以在短時間內同時得到精子的活率、存活率及密度等 數據，而且可以將精子分成五級(A，B，C，D，E) ， D級(含D級)以上為活精子， 即有生命力的，E級為死精子。
PI是一類只對死精子或細胞染色的核染料(紅色)，而Transgreen染料 是一種膜通透性的核染料，可以快速穿透任何細胞膜(或細胞壁)而與DNA結 合，因此死活精子都著色(綠色)。Transgreen與PI同時存在的情況下，PI 能取代Transgreen與DNA結合。結果導致活細胞呈綠色，死細胞呈紅色。
本發明方法所使用的染料中，除了花菁類染料，也可以是本領域熟知的其 它具有膜通透性的核染料，例如但不限于，Hoechst33342，只要所用的染料可
以將精子從非精子的顆粒碎片中區分開來。優選花菁類染料，更優選 TrMsgreen。
本發明方法所使用的染料中，除了菲啶類染料，也可以是本領域熟知的其
它的死細胞或死精子的核染料，例如但不限于，Hoechst33258，只要所用的染 料可以將精子從非精子的顆粒碎片中區分開來。優選菲啶類染料，更優選PI。
本發明還提供了一種復合染料的用途，所述的復合染料包括菲啶類染料和 花菁類染料。可以將該復合染料與精子混合、孵育，測定綠色精子在所有精子 中所占的比例，從而獲得精子密度計數及精子的活率。
所述的菲啶類染料選自PI、溴乙錠；所述的花菁類染料選自Transgreen。本發明也提供了一種染料PI的用途，就是將它與精子和Transgreen混合、 孵育，從而獲得精子密度計數及精子的活率。
本發明也提供了一種染料Transgreen的用途，就是將它與精子和PI混合、 孵育，從而獲得精子密度計數及精子的活率。
本發明提供一種試劑盒，在所述的試劑盒中含有(a)菲啶類染料和(b) 花菁類染料。所述的菲啶類染料選自PI、溴乙錠；所述的花菁類染料選自 Tr過nsgreen。
在所述的試劑盒中還可以含有進行精子或細胞培養的緩沖液及說明書。 本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。
本發明的主要優點在于
1、 本發明提供的方法簡便、快速且可動態評價精子存活率；
2、 本發明提供的方法靈敏度高、快速方便及價格低廉；
3、 本發明提供的方法為精子密度及精子存活率的精確計算提供可能。
下面將結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于 說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數按重量計。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于 本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例l 精子熒光染色
材料與方法研究對象
正常生育男性，精子密度"0xl0Vml， 3+1 級精子>50%, WBC<lxl06/ml， 禁欲3-5d后，手淫法留取精液于潔凈的玻璃器皿內。精液液化后，通過上游法 優化精子，并調整密度為60xl06/ml，總活率>90%。
試劑
碘化丙啶(PI)購自Sigma公司；
Transgreen熒光分子探針購自上海淦峰生物技術有限公司。 儀器
計算機輔助精液分析系統(配有熒光裝置和恒溫裝置)，由安萊公司提供 的VideoTest Cytogenetics自動精子圖像分析系統； C02培養箱，購自Heraeus。 方法
一、 精子運動功能分析
將處理好的精子懸液分成四組
a組，精子懸液-,
b組，精子懸液+ Transgreen (終濃度為100nM); c組，精子懸液+ PI (終濃度為24uM); d組，精子懸液+ Transgreen/PI 。
在37。C， 5%(202培養箱孵育，每隔30分鐘，各取10ul，應用計算機輔助 精液分析系統分析精子運動參數精子活動率、曲線速度(VCL)、直線速度 (VSL)、平均路徑(VAP)、頭側擺幅度(ALH)。
二、 精子存活率比較
a組，精子懸液，培養60分鐘后加入PI;
b組，精子懸液+ Transgreen (終濃度為100nM)，培養60分鐘后加入PI; c組，精子懸液+ PI (終濃度為24uM) ， 60分鐘后加入Transgreen; d組，精子懸液+ Transgreen/PI，培養60分鐘。
計算a組200個精子中未染色精子所占的百分數及b-c各組200個精子中 綠色精子所占的百分數。
三、 統計學分析
采用STATA 8.0統計軟件包進行Log-rank生存檢驗及相關多因素分析， 比較各個實驗組與空白對照組之間的運動參數和存活率差異。結果
一、 Transgreen染料和PI染料對精子運動參數的影響
在0—120min內，a， b， c， d四組精子在活率(見圖1)、曲線速度(VCL)、 直線速度(VSL)、平均路徑(VAP)、頭側擺幅度(ALH)的差異均無顯著性。
結果表明，Transgreen/PI復合染料在120分鐘內，對精子各運動參數均 沒有顯著影響。
二、 Transgreen與PI加入時間先后對精子存活率統計的影響 Transgreen與PI染料不分先后，且加入時間相隔60分鐘，對精子存活率
的計數沒有影響。(見圖2)
結果表明，Transgreen和PI染料與精子，特別是與死精子DNA的結合始 終會達到一個動態的平衡，已經結合上Transgreen的死精子當有PI加入后， 在很短的時間內Transgreen染料仍然會被PI置換下來。
另一方面，Transgreen, PI以及Transgreen/PI復合染料在2個小時甚至 更長的時間內，不影響精子的存活率。
討論
在精子培養懸液中，分別加入PI， Transgreen及Transgreen/PI混合染 料，培養120分鐘或更長時間，染料不影響精子的各項運動參數；Transgreen/PI
復染后精子存活率與PI單染法的統計結果沒有差異。
發明人發現在120分鐘時間內，Transgreen/PI復合染料不影響精子細胞 運動，另外由于Transgreen與DNA結合的親和力比PI低，因此即使Transgreen 預染60分鐘后的精液標本，只要再與PI孵育5分鐘，死精子上的綠色熒光 (Transgreen)會被紅色的熒光(PI)代替，各組精子存活率的統計沒有差異。
因此Transgreen/PI復染，是一種靈敏度高、快速方便又價廉的精子存活 率檢測新方法，適合在熒光顯微鏡、CASA系統和流式細胞儀上作動態及靜態分 析，具有重要的臨床應用價值。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而己，并非用以限定本發明的實質技術 內容范圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任 何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相 同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。
權利要求
1.一種精子熒光染色測定方法，其特征在于，它包括步驟(1)將精子、菲啶類染料和花菁類染料混合，得到混合溶液，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、溴乙錠；花菁類染料選自Transgreen；(2)測定混合溶液中精子的熒光值。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，它包括步驟(1) 將精子、碘化丙啶和Transgreen混合，得到混合溶液；(2) 計數混合溶液中綠色精子和/或紅色精子的個數，其中綠色精子是活精 子，紅色精子是死精子。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)為將精子和碘 化丙啶混合3 — 15分鐘后，加入Transgreen,得到混合溶液。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，精子和碘化丙啶混合的溶液濃度 為12 — 48uM。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)為將精子和 Transgreen混合3 — 15分鐘后，加入碘化丙啶，得到混合溶液。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，精子和Transgreen混合的溶液濃 度為50 — 200nM。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)為將精子、碘 化丙啶和Transgreen —起加入，得到混合溶液。
8. —種菲啶類染料和花菁類染料形成的復合染料的用途，其特征在于，所述 的復合染料用于精子存活率熒光染色測定。
9. 如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、 溴乙錠；花菁類染料選自Transgreen。
10. —種試劑盒，其特征在于，它含有(a) 菲啶類染料，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、溴乙錠；和(b) 花菁類染料，所述的花菁類染料選自Transgreen。
全文摘要
本發明公開了一種精子熒光染色方法，它是將精子與PI，Transgreen及Transgreen/PI混合，置37℃，5％CO₂培養箱共孵育。運用計算機輔助精子精液質量分析系統，分析熒光染料加入后精子各運動參數的改變以及Transgreen/PI復染作為計算精子存活率是可行的。
文檔編號G01N33/48GK101308131SQ200710040709
公開日2008年11月19日 申請日期2007年5月16日 優先權日2007年5月16日
發明者施惠娟, 健 王, 瑤 袁, 趙洪鑫 申請人:上海市計劃生育科學研究所