本發明涉及病毒檢測技術領域，更具體地，涉及一種豬戊型肝炎病毒ORF2重組蛋白的制備方法及其ORF2蛋白和檢測試劑盒。

背景技術：

戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的以黃疸為主要表現的急性病毒性肝炎，主要經糞-口途徑傳播。該病主要流行于衛生設施不完善的發展中國家（如亞洲和非洲），在發達國家（如美國和一些歐洲國家）也存在散發的情況。戊型肝炎的致死率（1～4%）比甲型肝炎（0.1～2%）的致死率要高，并且對孕婦的致死率能高達30%。

HEV具有一個血清型，四個基因型，基因1和2型只感染人，主要流行于亞洲、非洲、墨西哥。基因 3、4 型宿主范圍較廣，除了可感染人和家豬外，也可感染雞、鹿、兔子、老鼠等其他動物。基因3型主要流行于美國、加拿大、阿根廷、西班牙、法國、澳大利亞、荷蘭、新西蘭等。基因4型分布在中國，日本，印度和越南。因此，戊型肝炎已經是一個重要的公共衛生問題而不只是食物安全和人畜共患病等潛在的風險。

Luminex xMAP（Flexible multi-analyte profing）液相芯片技術有機整合了激光分析技術、流式細胞技術等多項最新科技成果，可用于蛋白、核酸和配體受體等熒光生物學反應的檢測，具有高通量、準確性高、重復性好、靈敏度高、線性范圍廣等優勢。其原理是以不同熒光編碼的微球為載體，進行抗原-抗體、受體-配體、酶-底物結合反應以及核酸雜交反應，通過紅、綠兩束激光判斷微球的熒光編碼及報告分子的熒光強度，從而達到快速準確的定性和定量檢測的目的。目前，液相芯片檢測技術已被廣泛應用于醫療保健、食品生產、環境衛生等領域的微生物檢測領域，并在在呼吸道、蟲媒介等病毒檢測方面也廣泛應用。

實驗室檢測HEV主要采用分子生物學和血清學。PCR是檢測HEV RNA最常用的方法，核酸存在于血清、膽汁、糞便中的時間非常短暫，出現臨床癥狀1～2周前可以檢測到HEV RNA，糞便容易受到污染，病毒載量低，該檢測方法出現不穩定結果。12周齡的豬感染HEV出現病毒血癥3周后可檢測出IgM，可持續5～7周。當IgM升高3周后，IgG抗體為陽性，可持續至4～5個月，因此，實驗室常采用ELISA監測HEV抗體。目前，商品化的ELISA試劑盒以1型 HEV 抗原為主，很少有以4型HEV作為抗原建立檢測方法的研究，且國內沒有豬HEV液相蛋白檢測方法的報道。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種豬戊型肝炎病毒ORF2重組蛋白的制備方法。

本發明的第二個目的是提供上述方法制備得到的豬戊型肝炎病毒ORF2重組蛋白。

本發明的第三個目的是提供所述豬戊型肝炎病毒ORF2重組蛋白作為免疫原在制備檢測豬戊型肝炎病毒的試劑中的應用。

本發明的第四個目的是提供一種檢測豬戊型肝炎病毒的試劑盒。

本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的：

一種豬戊型肝炎病毒重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：

S1. 以表達HEV ORF2 C段第337個到第645個氨基酸片段的核苷酸序列為目的片段，利用上游引物F和下游引物R擴增該目的片段；上游引物F和下游引物R的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

S2. 連接pMAL-c5X載體，獲得pMAL-c5X-ORF2重組質粒，轉入原核表達菌誘導表達即可。

HEV基因組為單股正鏈RNA，大小約7.2kb，具有3個開放閱讀框（open reading frame, ORF）：ORF1、ORF2和ORF3。ORF2為HEV主要的結構基因編碼區，編碼衣殼蛋白，該蛋白富含多個抗原表位，結構復雜，除N端有少數幾個外，其余抗原表位主要分布在C端2/3處。

ORF2 C 末端編碼的452aa～617aa是HEV中和抗原表位的位置，且不同基因型能夠發生交叉中和反應，提示存在共同中和抗原表位。因此，本研究選取ORF2 C段337～654aa片段進行原核表達，成功表達了具有免疫原型的ORF2蛋白，以期建立豬戊型肝炎病毒檢測方法。

使用pMAL-C5X載體的目的是增加目的重組蛋白的可溶性，借以保持其天然空間結構及抗原性。但用于純化含有MBP標簽重組蛋白的Amylose 樹脂純化效率較低（即重組蛋白的純化效率和純化度低），因此在上述pMAL-c5X重組質粒的基礎上，在ORF2基因下游引入6*His標簽基因。其目的是在后期純化過程中使用Ni²⁺純化填料，提高目的蛋白的純化效率。

優選地，S2所述誘導表達條件為：IPTG終濃度0.8 mmol/L，溫度30℃，時間5h。

本發明還提供所述方法獲得的豬戊型肝炎病毒重組蛋白。

本發明還提供所述豬戊型肝炎病毒重組蛋白作為免疫原在制備檢測豬戊型肝炎病毒的試劑中的應用。

本發明以液相芯片技術為基礎，以ORF2重組蛋白作為抗原，建立一種檢測豬戊型肝炎病毒的新方法，因此，本發明還提供一種檢測豬戊型肝炎病毒的羧基化熒光微球12-ORF2，是將所述豬戊型肝炎病毒重組蛋白與羧基化熒光微球012偶聯獲得。

具體地，所述豬戊型肝炎病毒的羧基化熒光微球12-ORF2的制備方法，包括以下步驟：

S1. 羧基化熒光微球的活化：將清洗后的羧基化熒光微球012分別依次重懸于磷酸氫二鈉緩沖液、Sulfo-NHS溶液和EDC溶液中進行活化；

S2. 活化后的羧基化熒光微球012懸液中加入豬戊型肝炎病毒重組蛋白進行孵育，并用PBS-TBN重懸即得。

本發明還提供一種檢測豬戊型肝炎病毒的試劑盒，所述試劑盒含有所述的豬戊型肝炎病毒重組蛋白，該重組蛋白可用于基于抗原抗體原理的免疫反應。

優選地，所述檢測豬戊型肝炎病毒的試劑盒含有所述的豬戊型肝炎病毒的羧基化熒光微球12-ORF2。

具體地，針對利用羧基化熒光微球12-ORF2進行液相芯片檢測的技術，所述試劑盒還含有生物標記的雞抗鼠IgG抗體或者兔抗豬IgG抗體、鏈霉素-藻紅蛋白。

優選地，所述生物標記的雞抗鼠IgG抗體的稀釋度為1：1000，兔抗豬IgG抗體的稀釋度為1：5000，鏈霉素-藻紅蛋白的稀釋度為1：1000。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

本發明首先提供了豬戊型肝炎病毒重組蛋白的制備方法：以表達HEV ORF2 C段第337個到第645個氨基酸片段的核苷酸序列為目的片段，利用上游引物F和下游引物R擴增該目的片段；上游引物F和下游引物R的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；連接pMAL-c5X載體，獲得pMAL-c5X-ORF2重組質粒，轉入原核表達菌誘導表達獲得重組蛋白。該蛋白能夠與豬戊型肝炎病毒抗體發生反應，說明了重組蛋白具有良好的抗原性，利用該重組蛋白建立液相芯片檢測技術，液相蛋白芯片檢測方法對豬常見的其他疾病陽性血清無交叉反應，其批內、批間變異系數分別為5%、6.6%。對102份臨床血清樣本檢測結果顯示，該方法與商品化ELISA試劑盒符合率為93.1%，關聯性卡方檢驗顯示兩個方法具有一致性（P<0.01）。本研究為臨床HEV血清抗體的檢測提供了一種特異、靈敏的新型快速檢測技術，為建立豬病多重檢測方法提供了基礎。

附圖說明

圖1為ORF2基因的PCR擴增結果，其中，M：DL-2000Marker，1：PCR擴增產物。

圖2為重組質粒pMAL-c5X－ORF2酶切鑒定，其中，M：1kb Marker，1：pMAL-c5X－ORF2雙酶切。

圖3為重組蛋白表達的SDS-PAGE結果，其中，M：蛋白分子量標準，1：pMAL-c5X空載體誘導前，2. pMAL-c5X空載體誘導后，3. 重組質粒pMAL-c5X－ORF2誘導前，4. 重組質粒pMAL-c5X－ORF2誘導后，5.菌液超聲后上清，6.菌液超聲后沉淀。

圖4為ORF2蛋白的純化，其中，M：蛋白分子量標準；1：誘導后全菌液；2：ORF2蛋白純化后。

圖5為ORF2蛋白 Western Blotting分析，其中M：蛋白分子量標準；1：重組質粒pMAL-c5X－ORF2未誘導；2：重組質粒pMAL-c5X－ORF2誘導后。

圖6為液相檢測方法可行性結果。

圖7為血清最佳稀釋濃度檢測圖。

圖8為液相蛋白芯片檢測方法的特異性試驗。

具體實施方式

下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

實施例1 抗原的制備

一、重組表達質粒pMAL-c5X-ORF2的構建和鑒定

應用Oligo7.0生物學軟件，選取ORF2蛋白C段337～654aa片段，根據ORF2基因的序列（accession No. JX855794，第1009 bp到第1926 bp的序列）設計一對特異性引物，上游引物F加入Not I 酶切位點，下游引物R加入Sal I酶切位點和6×HIS標簽，以 pET32a-ORF2質粒為模板，經PCR擴增ORF2基因，PCR產物經純化、酶切后連接至pMAL-c5X原核表達載體，并轉化至Rosetta（DE3）感受態細胞，挑取單菌落進行PCR鑒定，對陽性菌進行酶切鑒定， 并送英濰捷基貿易有限公司測序。

上游引物F：5'-GGGGTCGACTATTCG AGTAGTGCGCGTC-3'

下游引物R：

5'- GAGGAATTCATGATGATGATGATGATGGAAGGCACAGCCCTGGAGG -3'

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后可見與目的條帶一致大小為990 bp的條帶（圖1），pMAL-c5X-ORF2質粒用Not I、Sal I雙酶切后經瓊脂糖凝膠電泳后與目的條帶一致（圖2），且將質粒送公司測序結果與目的序列一致，說明原核表達質粒構建成功。

二、重組表達質粒pMAL-c5X-ORF2的誘導表達和可溶性分析

將陽性菌于37 ℃培養至OD600 nm為0.5～0.6 時，加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L于30℃進行誘導5 h，離心收集菌體冰浴條件下超聲破碎，取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析。

菌液經IPTG誘導后，SDS-PAGE電泳分析在約74 KD處有一條目的條帶，與預期相符，且目的蛋白在上清和沉淀中均有表達，說明該蛋白具有可溶性（圖3）。

三、目的蛋白的純化

采用GE填料填充的Ni²⁺親和層析柱進行蛋白純化，具體操作按其產品說明書進行。主要操作步驟如下：誘導后的菌液超聲破碎、離心后，上清用濾器（0.45 μm）過濾；用6倍柱體積的去離子水沖洗層析柱；用6倍柱體積的結合緩沖液過柱；上清過柱，3遍；用10倍柱體積的洗脫緩沖液A和B洗脫雜蛋白；最后用5倍柱體積的洗脫緩沖液C洗脫目的蛋白，分段收集洗脫液，流速均為1 mL/min。測定目的蛋白的濃度并做SDS-PAGE進行純度分析。

上清經Ni²⁺親和層析柱后，收集的洗脫液經SDS-PAGE電泳分析可見一條74 KD的特異性條帶即ORF2蛋白（圖4）。

四、Western Blotting驗證目的蛋白的抗原性

ORF2目的蛋白經SDS-PAGE后轉印至硝酸纖維素膜（NC）上，用5%脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h，與1：1 000 000稀釋的鼠源抗體4 ℃過夜孵育，再與1：8 000稀釋的羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，將NC膜放入雙色激光分析系統Odyssey（LI-COR公司生產）中進行掃膜分析。

ORF2蛋白與單抗反應后在NC膜上有一條約為74KD的特異性條帶，且陰性對照沒有條帶（圖5），說明了ORF2蛋白具有反應原型。

實施例2 應用ORF2蛋白建立HEV液相蛋白芯片檢測方法

一、ORF2蛋白與微球的偶聯

參照Luminex公司的xMAP^?技術大全：兩步酰胺反應：首先磷酸化微球經磷酸氫二鈉緩沖液、Sulfo-NHS和EDC溶液成為活化狀態，其次利用實施例1制備得到的ORF2蛋白作為抗原與12號微球形成共價酰胺鍵，偶聯上抗原的微球用PBS-TBN 溶液重懸于4℃避光保存，具體操作步驟如下：

（1）漩渦儀振蕩微球懸液1 min，使微球均勻散開；

（2）取微球100 μL 轉移到1.5 mL離心管中，8000 g/min，2 min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清（不要吸走微球）；

（3）加入100 μL ddH₂O，渦旋1min，再8000 g/min，2 min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清；

（4）加入80 μL 100 mMol/L、pH=6.2的磷酸二氫鈉鹽溶液（NaH₂PO₄），渦旋1 min，重懸微球；

（5）加入10 μL、50 mg/mL的N-羥基硫代琥珀酰亞胺 （N-Hydroxysulfosuccinimie sodium salt-Sulfo-NHS，N-Sulfo-NHS），和10 μL 50mg/mL 1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亞胺[1-thyl-3-(3-Dimethylaminoproy) carbodimide Hydrochloride，EDC]，渦旋1min。

（6）室溫孵育20 min（每隔10 min用漩渦儀輕振），8000 g/min，2 min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清；

（7）加入250 μL 50 mMol/L、pH=5.0的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸2-(N-Moropholino) ethanesulfonic acid，MES），渦旋1min，并放于磁力架上，輕輕移走上清；

（8）步驟（7）一次；

（9）將上述活化后的微球中加入100 μL 50 mMol/L、pH=5.0的MES，渦旋1min，在混勻的微球中加入10 μg的ORF2蛋白抗原，再用MES定容至500 μL，渦旋1min；

（10）在室溫下放在搖床上孵育2 h，8000 g/min，2～3 min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清；

（11）并放于磁力架上，輕輕移走上清，渦旋1min，再在搖床上孵育30 min，8000 g/min，2～3 min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清；

（12）再加入1 mL PBS-TBN，8000 g/min，2～3 min離心，沉淀微球，棄上清，再重復一次；

（13）加入1 mL PBS-TBN，重懸微球，即得偶聯抗原的微球：12-ORF2（即第12號羧基化微球，或者羧基化熒光微球012與ORF2蛋白偶聯），4℃避光保存。

液相蛋白芯片檢測方法的操作流程：參照Luminex公司的xMAP^?技術大全，每孔加入50 μL（2 500個/孔）已偶聯上抗原的12號微球和50 μL ORF2單抗或待檢測已稀釋的血清（1：200），室溫震蕩（500 r/min）避光孵育1 h；用PBST洗滌96孔板，300 μL/孔，2次；加入生物素標記的雞抗鼠（1：1 000）或兔抗豬（1：5 000）IgG抗體100 μL/孔，室溫震蕩（500 r/min）避光孵育1 h，洗滌；加入1：1 000稀釋的鏈霉素-藻紅蛋白（SA-PE）100 μL/孔，室溫震蕩（500 r/min）避光孵育0.5 h，洗滌；每孔加入125 μL鞘液重懸，于Flex 3D液相芯片檢測系統讀取每孔微球的平均熒光強度（Median Fluorescent Intensity，MFI）。

二、偶聯效率的驗證

HEV陽性血清、HEV陰性血清、PBS作為陽性對照、陰性對照、空白對照以驗證偶聯是否成功。

ORF2鼠源單抗1：10梯度稀釋檢測偶聯效率，3個重復，同時確定抗體的最低檢測量。

偶聯上ORF2抗原的微球分別于HEV標準陽、陰性血清、PBS進行雜交，結果表明陽性對照的MFI大于10 000，空白對照的MFI小于100（圖6a），說明該偶聯方法和檢測方法是可行的。

將ORF2單抗從0.03 mg/mL開始進行10倍梯度稀釋，用液相蛋白芯片檢測方法檢測，結果采用SPSS軟件進行擬合三次方程，其R²=0.994，S=0.117，說明了曲線相關性好。當單抗濃度低至0.003 ng/mL時，該方法仍具有高靈敏度（圖6b）。

四、臨界值的確定

取20份HEV陰性血清，每份血清3個重復，根據其MFI計算平均數（）和標準差（SD），Cutoff=+3SD，MFI值大于Cutoff為陽性。

結果顯示，其平均值 = 2 579.0，標準差SD= 737.9，臨界值=4793，即當樣品的MFI大于等于 4793時為陽性。

五、HEV血清稀釋度的確定

HEV陽、陰性血清用PBS-1%BSA進行1：2梯度稀釋，每個稀釋度3個重復，以確定血清最佳稀釋倍數。

HEV標準陽、陰性血清不同倍數的稀釋結果顯示血清的最佳稀釋倍數為1:200，當血清稀釋至1：800時，陽性血清的MFI大于Cutoff值，仍可檢測出陽性（圖7）。

六、特異性試驗

采用建立的檢測方法檢測豬戊型肝炎、藍耳病、豬瘟、圓環、口蹄疫、偽狂犬、豬流感陽性血清和豬戊型肝炎陰性血清，每組3個重復，以驗證該檢測方法的特異性。

本檢測方法對豬常見疾病的陽性血清和豬戊型肝炎陰性血清檢測結果為陰性，戊型肝炎陽性血清為陽性（圖8），說明該檢測方法特異性好，無交叉反應，可與豬常見的其他疾病區分。

七、重復性試驗

批內重復：取4份陽性血清、1份陰性血清，每份血清10個重復，通過計算其變異系數以評價該方法的批內精密度。

批間重復：取11份陽性血清、1份陰性血清，每份血清3個重復，不同時間做3次。通過計算變異系數以評價該方法的批間精密度。

結果表明：液相蛋白芯片檢測方法的批內變異系數為3.3%～8.3%（表1），批間變異系數為2.3%～11.8%（表2）。符合Luminex精密度的要求：批內CV為不大于10%，批間CV不大于20%，說明本研究建立的該檢測方法具有良好的重復性。

八、液相蛋白芯片與ELISA的比較

采用本研究建立的液相蛋白芯片法和ELISA（北京萬泰）同時檢測臨床102份血清，評價其符合率。

結果表明：其陽性符合率為90.5%，陰性符合率為95%，總符合率為93.1%（表3）。同時關聯性卡方檢驗結果說明液相蛋白芯片法與ELISA的關聯極著（卡方值=71.58，P<0.01），兩個方法均可反應同一指標。

本研究首次建立了液相蛋白芯片檢測方法，該檢測方法具有較好的靈敏度，當血清稀釋至1：800時仍可檢測為陽性；此外，MFI值隨著血清濃度降低呈先升高后降低的趨勢，液相蛋白芯片和ELISA試劑盒對102份臨床血清樣品的檢測陽性率分別為40.2%、41.2%，表明液相蛋白芯片的靈敏度低于ELISA。同時優勢卡性方檢驗結果（P>0.05）說明：與ELISA相比，液相蛋白芯片法沒有優勢。理論上液相蛋白芯片的靈敏度高，陽性率應高于ELISA檢測結果，這可能是由于以1型HEV作為抗原的雙抗原夾心法ELISA試劑盒檢測的是血清中的總抗體（IgM和IgG），而以4型HEV為抗原建立的液相蛋白芯片法檢測的是IgG。此外，目前無HEV檢測的“金標準”，以至于特異性和靈敏度的評價沒有參照標準，因此，不同檢測方法具有差異性是避免不了的。但是兩者的符合率為93.1%，且關聯性卡方檢驗說明液相蛋白芯片法和ELISA可反應同一指標。因此，液相蛋白芯片檢測方法可以應用于HEV抗體檢測，并為下一步建立豬病多重檢測提供了基礎。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農業大學

<120> 一種豬戊型肝炎病毒ORF2重組蛋白的制備方法及其ORF2蛋白和檢測試劑盒

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 上游引物F

<400> 1

ggggtcgact attcgagtag tgcgcgtc 28

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 下游引物R

<400> 2

gaggaattca tgatgatgat gatgatggaa ggcacagccc tggagg 46