本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用熒光定量PCR技術(shù)快速檢測ABCB1基因C3435T多態(tài)性的核酸、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

冠狀動(dòng)脈性心臟病是我國常見的心血管疾病之一。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架介入治療(PCI)作為心肌血流重建術(shù)中創(chuàng)傷最小的一種方法，能使冠心病人群的長期預(yù)后得到較大改善，目前已成為治療冠心病的重要手段。然而PCI術(shù)后易在支架植入處形成血栓，造成不同程度的阻塞，從而導(dǎo)致不穩(wěn)定心絞痛、急性心肌梗死、甚至猝死等一系列急性并發(fā)癥。即使未植入支架的冠狀動(dòng)脈在其他病變部位也經(jīng)常會(huì)因粥樣硬化的進(jìn)展引發(fā)血栓不良事件。

為預(yù)防血栓的形成，在急性冠狀綜合征(ACS)和PCI術(shù)后的病人中目前普遍采用氯吡格雷和阿司匹林雙聯(lián)用的標(biāo)準(zhǔn)抗血小板治療，以降低心血管事件(死亡、中風(fēng)、再發(fā)心梗)的發(fā)生率。然而由于個(gè)體對藥物的反應(yīng)存在差異，仍有一部分患者在服用了標(biāo)準(zhǔn)劑量的氯吡格雷之后，仍然發(fā)生血栓栓塞等不良的心血管事件，即氯吡格雷抵抗(CR)。

CR的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，包括遺傳變異、與其他藥物的相互作用、藥物劑量、個(gè)體依從性、血小板更新速度、旁路代謝等。氯吡格雷是一種前體藥物，必需經(jīng)過腸內(nèi)吸收、肝臟代謝才能轉(zhuǎn)變成有活性的藥物成分，從而發(fā)揮其抗血小板聚集的作用。ABCB1基因編碼腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生的P糖蛋白(P-gp)，P-gp可以直接影響氯吡格雷從消化道進(jìn)入血液，不同個(gè)體間P-gp的差異可能會(huì)引起氯吡格雷在不同個(gè)體間治療效果的差異。

ABCB1基因在人類7號染色體上，包含28個(gè)外顯子，編碼一個(gè)長度為170KDa的跨膜糖蛋白P-gp。ABCB1基因的C3435T多態(tài)性位點(diǎn)，可通過密碼子的改變而影響蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)，使其對調(diào)節(jié)分子或底物的親和力發(fā)生變化，從而對藥物的代謝產(chǎn)生影響。對氯吡格雷治療患者的研究發(fā)現(xiàn)，ABCB1基因C3435T多態(tài)性位點(diǎn)的T等位基因攜帶者，與主要不良心血管事件(MACE)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。同樣地，在Tabasson simon的研究中，氯吡格雷的血清濃度和有活性的代謝產(chǎn)物，在該位點(diǎn)的TT基因攜帶人群中減少。因此通過對ABCB1基因C3435T多態(tài)性位點(diǎn)的檢測，將更好地為心血管病人提供個(gè)體化的抗血小板治療方案，對預(yù)防不良心血管事件具有積極意義。

可用于ABCB1基因多態(tài)性檢測的技術(shù)方法主要有測序法、液相芯片法、溶解曲線法等。DNA測序法雖然是基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢測靈敏度低、樣品易污染，出現(xiàn)假陽性，實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)、檢測效率低。而熔解曲線法雖然快速簡便，但假陽性率高。液相芯片法操作過程復(fù)雜，且容易污染，假陽性率高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)檢測能力的不足，本發(fā)明的目的是提供一組用于快速檢測ABCB1基因C3435T多態(tài)性的核酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于快速檢測ABCB1基因C3435T多態(tài)性的試劑盒及其檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一組用于快速檢測ABCB1基因C3435T多態(tài)性的核酸，該核酸包括檢測引物和檢測探針，其中，所述檢測引物包括野生型下游引物、突變型下游引物和公用上游引物，所述野生型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1，所述突變型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述公用上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

如上所述的核酸，優(yōu)選地，所述核酸還包括內(nèi)部質(zhì)控，其包括質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

如上所述的核酸，優(yōu)選地，所述核酸還包括野生型陽性對照物、突變型陽性對照物、和/或作為所述內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控陽性對照物，其中，所述野生型陽性對照物含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，所述突變型陽性對照物含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，所述質(zhì)控陽性對照物含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

一種用于快速檢測ABCB1基因C3435T多態(tài)性的試劑盒，該試劑盒包括如上所述的核酸，其中，所述檢測探針和質(zhì)控探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，試劑盒還包括10×PCR緩沖液、DNA聚合酶、dNTPs、礦物油、陰性對照物：無核酸酶水。

一種快速檢測ABCB1基因C3435T多態(tài)性的方法，該方法包括以下步驟：

(1)從樣品中提取DNA；

(2)對提取的所述DNA，同時(shí)進(jìn)行野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；其中，在所述野生型反應(yīng)體系中檢測引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；在所述突變型反應(yīng)體系中檢測引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述檢測探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)；

(3)數(shù)據(jù)采集和分析：將閾值線調(diào)整至背景信號及陰性擴(kuò)增線以上，通過實(shí)時(shí)熒光PCR儀收集信號，計(jì)算所述野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系的△Ct值來確定所述樣品DNA的基因型。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述野生型反應(yīng)體系和所述突變型反應(yīng)體系中還包括有作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，該質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于所述檢測探針的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于所述檢測探針的淬滅基團(tuán)。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，在各自的所述野生型反應(yīng)體系和所述突變型反應(yīng)體系中，各條引物和各條探針的終濃度均為100-1000nmol/L；所述熒光基團(tuán)為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

如上所述的方法，優(yōu)選地，步驟(2)中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

第一階段：95℃5min；

第二階段：95℃5s，58℃30s，10個(gè)循環(huán)；

第三階段：95℃5s，58℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；

信號收集：第三階段72℃時(shí)收集熒光信號。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，在各自所述野生型反應(yīng)體系和所述突變型反應(yīng)體系中，所述野生型引物對的終濃度均為200nmol/L，所述突變型引物對的終濃度均為200nmol/L，所述檢測探針的終濃度為150nmol/L，所述質(zhì)控引物對的終濃度均為150nmol/L，所述質(zhì)控探針的終濃度為100nmol/L；所述檢測探針的5＇端連接FAM，3＇端連接MGB，所述質(zhì)控探針的5＇端連接JOE，3＇端連接BHQ1。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在所述步驟(3)中，檢測樣本的所述內(nèi)部質(zhì)控的JOE信號應(yīng)達(dá)到設(shè)定閾值Ct值小于25，再確定所述樣本DNA的基因型；否則應(yīng)重新進(jìn)行檢測；

確定所述樣品DNA的基因型，按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

-2.5≤ΔCt＝野生型Ct值-突變型Ct值≤2.5，判定為雜合型樣本；

ΔCt＝突變型Ct值-野生型Ct值＞2.5，判定為野生型樣本；

ΔCt＝野生型Ct值-突變型Ct值＞2.5，判定為突變型樣本。

如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，還設(shè)有陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為以含有如SEQ ID No.8核苷酸序列所示的野生型陽性對照物、含SEQ ID No.9核苷酸序列所示的突變型陽性對照物、和/或含有如SEQ ID No.10核苷酸序列所示的質(zhì)控陽性對照物為模板，進(jìn)行所述野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；所述陰性對照為以水為模板，進(jìn)行所述野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；

在步驟(3)中，所述陽性對照的野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系的FAM均有明顯的擴(kuò)增曲線，和/或JOE有明顯的擴(kuò)增曲線且JOE信號的Ct值≤25，符合要求；所述陰性對照的野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系的FAM、JOE均沒有明顯的擴(kuò)增曲線，符合要求；否則，應(yīng)重新進(jìn)行檢測。

本發(fā)明提供了一組用于快速檢測ABCB1基因C3435T位點(diǎn)多態(tài)性的核酸，同時(shí)建立了一種比較高效、靈敏的ABCB1基因C3435T多態(tài)性位點(diǎn)的檢測試劑盒及快速檢測方法。其檢測試劑盒，使用方便，操作簡便，自動(dòng)化程度高，大大簡化了操作過程，并減少了在操作過程的污染，檢測效果好，具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度的特點(diǎn)。提供的檢測方法采用完全閉管操作，操作簡單、方便快捷、通過直接探測PCR過程中熒光信號值的獲得檢測的結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測，克服了常規(guī)PCR技術(shù)的易污染、出現(xiàn)假陽性，能有效避免非特異性擴(kuò)增難題，并且適合大批量樣本的檢測。

本發(fā)明提供的檢測試劑盒及方法，用于檢測ABCB1基因C3435T多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)，為了避免漏檢、及初步判斷樣本DNA量是否在允許范圍內(nèi)，設(shè)有內(nèi)部質(zhì)控，為了判斷檢測體系是否正常，還設(shè)有陰性對照和檢測引物的陽性對照；為了避免假陰性及漏檢，設(shè)有野生型、突變型和內(nèi)部質(zhì)控的陽性對照，其陽性對照檢測呈陽性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果及漏檢，如陽性對照檢測呈陰性結(jié)果，說明檢測體系有問題，或試劑已經(jīng)失效，應(yīng)重新配置體系進(jìn)行檢測；為了避免假陽性及漏檢，設(shè)有陰性對照，其陰性對照檢測呈陰性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果及漏檢，如陰性對照檢測呈陽性結(jié)果，說明檢測體系有問題，已被污染，應(yīng)重新配置體系進(jìn)行檢測；本發(fā)明提供檢測試劑盒及方法設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，有效避免漏檢、錯(cuò)檢的可能。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明運(yùn)用ARMS引物區(qū)分野生型和突變型基因，進(jìn)而設(shè)計(jì)的引物、探針及由其構(gòu)成的試劑盒，還有如下有益效果和顯著進(jìn)步：

(1)靈敏度高，可以準(zhǔn)確檢出低至10copies/μL基因的穩(wěn)定檢出，檢測結(jié)果可信。

(2)特異性強(qiáng)，對于高至200ng的基因組DNA不會(huì)出現(xiàn)非特異性的結(jié)果，可以減少稀釋樣本的過程。

(3)成本低，ARMS分型法相對于Taqman探針分型法，不僅能保留Taqman的高靈敏度和高特異性，而且還能節(jié)約成本，ARMS引物合成快速簡單，合成成本低，擴(kuò)增效果更佳。

(4)檢測速度快，整個(gè)檢測過程只需要90分鐘。

(5)應(yīng)用Fast master Premix預(yù)混在反應(yīng)體系中，減少了酶與樣本混合的步驟，減少了樣本的污染，操作更簡單，一步加樣，避免了氣溶膠污染引起的假陽性。

(6)安全：整個(gè)試劑盒不包含有毒有害物質(zhì)，對操作人員和環(huán)境無危害。

總之，本發(fā)明涉及的ABCB1基因多態(tài)性檢測試劑盒適用于臨床多種樣本類型選擇，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)周期短，操作簡單，安全無毒，成本低等顯著優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明優(yōu)選地試劑盒中野生型體系檢測靈敏度的擴(kuò)增曲線。

圖2為本發(fā)明優(yōu)選地試劑盒中突變型體系檢測靈敏度的擴(kuò)增曲線。

圖3為本發(fā)明優(yōu)選地試劑盒對實(shí)施例6中DTA抗凝的全血提取的ABCB1C3435T突變型基因組DNA樣本的擴(kuò)增曲線。

圖4為本發(fā)明優(yōu)選地試劑盒對實(shí)施例6中DTA抗凝的全血提取的ABCB1C3435T雜合型基因組DNA樣本的擴(kuò)增曲線。

圖5為本發(fā)明優(yōu)選地試劑盒對實(shí)施例6中DTA抗凝的全血提取的ABCB1C3435T野生型基因組DNA樣本的擴(kuò)增曲線。

圖6為本發(fā)明優(yōu)選地試劑盒中A1和A2體系的雜合樣本上樣量擴(kuò)增曲線。其中，圖1-5中W表示野生型，M表示突變型，WM表示雜合型。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，并非對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，本發(fā)明提供的核苷酸序列的互補(bǔ)序列也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，如無特殊說明，所用試劑為常規(guī)試劑，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1引物、探針、驗(yàn)證模板設(shè)計(jì)

本發(fā)明所選的引物針和探針針對ABCB1基因C3435T位SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)。引物及探針使用的具體原理是：針對突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)野生型和突變型ARMS引物和Taqman探針，結(jié)合熒光定量PCR反應(yīng)，對從人外周血細(xì)胞提取的基因組DNA進(jìn)行檢測，通過實(shí)時(shí)熒光PCR儀上收集信號，計(jì)算野生型和突變型的△Ct值來確定樣本DNA的基因型。

經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，最終確定檢測ABCB1基因C3435T多態(tài)性位點(diǎn)的特異性檢測引物包括野生型下游引物(ABCB1-RW)、突變型下游引物(ABCB1-RM)、公用上游引物(ABCB1-F)和公用檢測探針(ABCB1-P)，核苷酸序列如下：

ABCB1-RW(SEQ ID No.1):

5’-TCCTTTGCTGCCCTCTCG-3’；

ABCB1-RM(SEQ ID No.2):

5’-CCTCCTTTGCTGCCCTCATA-3’；

ABCB1-F(SEQ ID No.3):

5’-TCGTGTCCCAGGAGCCC-3’；

ABCB1-P(SEQ ID No.4):

5’-CCTGTGACACCACCC-3’。

野生型下游引物與公用上游引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物可作為野生型陽性模板，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的序列，而包含如SEQ ID No.8所示的序列即可作為野生型陽性對照物；突變型下游引物與公用上游引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物可作為突變型陽性模板，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的序列，而包含如SEQ ID No.9所示的序列即可作為突變型陽性對照物，序列如下：

SEQ ID No.8：

5’-TCGTGTCCCAGGAGCCCATCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGAGAACATTGCCTATGGAGACAACAGCCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATTGTGAGGGCAGCAAAGGA-3’；

SEQ ID No.9：

5’-TCGTGTCCCAGGAGCCCATCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGAGAACATTGCCTATGGAGACAACAGCCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATCGTGAGGGCAGCAAAGGAGG-3’。

進(jìn)一步，為了對實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和實(shí)驗(yàn)操作過程進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)控，同時(shí)檢測樣本的質(zhì)量，避免漏加檢測樣本，本發(fā)明選用的內(nèi)部質(zhì)控為NCBI數(shù)據(jù)庫中基因序列編號NM_000927.4第3578到3775位進(jìn)行設(shè)計(jì)引物與探針，這段序列是ABCB1基因第25外顯子上的一段序列，與目的基因是同一個(gè)基因，不僅可以作為試劑盒的質(zhì)控，還可以作為樣本DNA的質(zhì)控，保證提取出來的DNA包含ABCB1基因，可以排除其他序列的非特異交叉反應(yīng)，同時(shí)它也不會(huì)對目的基因產(chǎn)生交叉反應(yīng)，確保試劑盒的準(zhǔn)確性通過對內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對、質(zhì)控探針的篩選和體系優(yōu)化，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR內(nèi)部質(zhì)控檢測體系，優(yōu)選地，質(zhì)控引物對(IC-F、IC-R)、質(zhì)控探針(IC-P)如下：

IC-F(SEQ ID No.5)：5’-ACTGAGCCTGGAGGTGAAGAAG-3’；

IC-R(SEQ ID No.6)：5’-CCTGCCAAGGGGTCGTAGA-3’；

IC-P(SEQ ID No.7)：5’-CTGTGGGAAGAGCACAGTGGTCCAGC-3’。

作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增序列的大小為111bp，將擴(kuò)增序列作為內(nèi)部質(zhì)控陽性對照物，即包含如SEQ ID No.10所示序列，作為驗(yàn)證是否漏加檢測樣品的質(zhì)控陽性對照物，SEQ ID No.10：

5’-ACTGAGCCTGGAGGTGAAGAAGGGCCAGACGCTGGCTCTGGTGGGCAGCAGTGGCTGTGGGAAGAGCACAGTGGTCCAGCTCCTGGAGCGGTTCTACGACCCCTTGGCAGG-3’。

實(shí)施例2采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測ABCB1基因C3435T多態(tài)性位點(diǎn)的方法

根據(jù)實(shí)施例1篩選設(shè)計(jì)的野生型上游引物、突變型上游引物、公用下游引物和公用檢測探針進(jìn)行合成，可在公用檢測探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)，其中，熒光基團(tuán)為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

應(yīng)用本發(fā)明設(shè)計(jì)的野生型引物對、突變型引物對及公用檢測探針，對檢測樣品的DNA模板，進(jìn)行ABCB1基因C3435T多態(tài)性位點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測，采用野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系，均用40μL反應(yīng)體系，其中30μL的反應(yīng)體系如表1配置，再加入10μL待測樣品DNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；

表1 PCR反應(yīng)液配置

應(yīng)用Fast master premix預(yù)混在反應(yīng)體系中，一步加樣，無需將樣本與酶混合，減少了酶與樣本混合的步驟，減少了樣本的污染，操作更簡單。

第一階段：95℃5min；

第二階段：95℃5s，58℃30s，10個(gè)循環(huán)；

第三階段:95℃5s，58℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；

第三階段:35個(gè)循環(huán)時(shí)，收集熒光信號。

結(jié)果分析：將閾值線調(diào)整至背景信號及陰性擴(kuò)增線以上，再根據(jù)熒光定量PCR儀器，得到樣本的突變型Ct值和野生型Ct值，通過差值判斷檢測樣品的基因型。

將ABCB1基因的C3435T位點(diǎn)的野生型陽性對照物和突變型陽性對照物進(jìn)行上述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)的檢測引物及反應(yīng)體系可有效擴(kuò)增出ABCB1基因的C3435T位點(diǎn)的野生型和突變型。

對樣品進(jìn)行檢測時(shí)，避免漏檢，如避免有的反應(yīng)孔中未加檢測樣本的情況出現(xiàn)，在每個(gè)反應(yīng)孔中設(shè)置有內(nèi)部質(zhì)控，應(yīng)當(dāng)注意的是公用檢測探針與質(zhì)控探針熒光基團(tuán)標(biāo)記為不同檢測模式的熒光基團(tuán)。具體的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成按表1配置。對于人血液樣品或咽拭子樣品的DNA檢測時(shí)，質(zhì)控探針的信號有明顯的擴(kuò)增曲線。

其中，在探針合成時(shí)，探針與熒光和淬滅基團(tuán)相連，檢測探針的熒光-淬滅基團(tuán)為優(yōu)選為FAM-MGB，質(zhì)控探針的熒光-淬滅基團(tuán)優(yōu)選為JOE-BHQ1，此時(shí)，F(xiàn)AM是檢測信號，用于檢測樣本的基因多態(tài)性，通過反應(yīng)體系的突變型和野生型FAM信號的熒光強(qiáng)度差異來判斷檢測結(jié)果；JOE是內(nèi)控信號，用于檢測體系是否正常，樣本是否漏加及初步判斷樣本DNA量是否在允許范圍內(nèi)，JOE信號應(yīng)達(dá)到設(shè)定閾值(Ct值小于25)；在內(nèi)控信號達(dá)到要求后，以SNP位點(diǎn)的突變型和野生型FAM信號達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)次數(shù)Ct值的差值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。具體如下：△Ct＝|野生型Ct值-突變型Ct值|≤2.5為雜合型樣本，△Ct＝野生型Ct值-突變型Ct值>2.5為突變型樣本，△Ct＝突變型Ct值-野生型Ct值>2.5為野生型樣本。

當(dāng)然，檢測探針和質(zhì)控探針采用其它熒光-淬滅基團(tuán)組合也同樣適用，比如，HEX-BHQ1、HEX-TAMRA、FAM-TAMRA、FAM-BHQ1、CY3-BHQ1、CY3-BHQ2等，檢測時(shí)選擇相應(yīng)的熒光檢測模式。

上述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)可使用的儀器包括ABI實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)、Stratagene定量多聚酶鏈反應(yīng)儀(例如MX4000，MX3000，MX3005)。

實(shí)施例3用于檢測ABCB1基因C3435T多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒

用于快速檢測ABCB1基因C3435T多態(tài)性位點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒包括以下成分：

野生型下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

突變型下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

公用上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示

公用檢測探針：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述公用檢測探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)；

野生型陽性對照物：含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

突變型陽性對照物：含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

為了避免漏檢，錯(cuò)檢，還包括：作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對、質(zhì)控探針和質(zhì)控陽性對照物，

其中，質(zhì)控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，該質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于所述公用檢測探針的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于所述公用檢測探針的淬滅基團(tuán)，質(zhì)控陽性對照物含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

為了防止反應(yīng)體系在PCR擴(kuò)增過程中揮發(fā)，影響檢測效果，試劑盒還包括有礦物油。

為了便于反應(yīng)體系的配置，試劑盒還包括10×PCR緩沖液、DNA聚合酶、dNTPs、陰性對照物：無核酸酶水。其中DNA聚合酶可采用Fast master premix，采用ABI(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；10×PCRbuffer(Mg²⁺Plus)采用TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司，也可應(yīng)用市場上其他公司的緩沖液與DNA聚合酶。

實(shí)施例4檢測試劑盒的制備

本實(shí)施例的試劑盒是在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，制備成可以直接加入檢測樣品后，進(jìn)行檢測的試劑盒。該試劑盒有ABCB1 8聯(lián)PCR反應(yīng)條以及ABCB1陽性對照物組成，各成分如表2所示，反應(yīng)液的配置見表3。每條ABCB1 8聯(lián)PCR反應(yīng)條的奇數(shù)管(1/3/5/7或A/C/E/G)對應(yīng)檢測體系為A1反應(yīng)液，檢測ABCB1C3435T野生型；偶數(shù)管(2/4/6/8或B/D/F/H)對應(yīng)的檢測體系為A2反應(yīng)液，檢測ABCB1C3435T突變型。每管主要成分為特異性引物、熒光探針和PCR反應(yīng)液等，其中公共檢測探針的5＇端連接FAM，3＇端連接MGB，則檢測樣品信號類型為FAM信號和內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控探針5＇端連接JOE，3＇端連接BHQ1，內(nèi)部質(zhì)控為JOE信號(內(nèi)控作為對試劑盒、DNA質(zhì)量以及操作本身的質(zhì)控)；檢測引物、公用檢測探針、質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針可委托上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

表2試劑盒組成

表3各PCR反應(yīng)液配置

在本實(shí)施例中Fast master premix，購自ABI(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；該mix中已經(jīng)含有DNA聚合酶，試劑盒的組份中由于采用這種mix,使用時(shí)不再需要先將酶和樣本混合后再加入體系，而只需要加入待測樣本，操作更簡單快捷，省時(shí)的同時(shí)避免了樣本長時(shí)間操作而導(dǎo)致的氣溶膠污染。10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。實(shí)施例5：檢測實(shí)施例4中制備的試劑盒的靈敏度、精密度和特異性

(1)靈敏度實(shí)驗(yàn)

ABCB1重組質(zhì)粒購自南京金斯瑞生物科技有限公司，以現(xiàn)有基因工程技術(shù)人工合成的ABCB1基因C3435T多態(tài)性位點(diǎn)含有SEQ ID NO.8所示序列為野生型質(zhì)粒，含有SEQ ID NO.9所示序列為突變型質(zhì)粒，人工合成含有SEQ ID NO.10所示序列為內(nèi)控質(zhì)粒。各質(zhì)粒干粉用TE(10mmol/L，PH8.0)復(fù)溶，定量后稀釋。

取2×10¹copies/μL的野生型質(zhì)粒(W)和內(nèi)控質(zhì)粒(M)1:1混合，配置成終濃度為10copies/μL的ABW-1參考品；取2×10¹copies/μL的突變型質(zhì)粒和內(nèi)控質(zhì)粒1:1混合，配置成終濃度為10copies/μL的ABM-1參考品；取2×10¹copies/μL的野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒、內(nèi)控質(zhì)粒(IC)1:1:2體積比混合，配置成終濃度為10copies/μL的ABWM-1雜合參考品，以這三種參考品為模板，在實(shí)施例4中制備A1(ABW)和A2(ABM)體系中分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)的程序采用實(shí)施例2中方法，具體結(jié)果見圖1和圖2所示。檢測結(jié)果表明，本發(fā)明的熒光PCR方法靈敏度高，10copies/μL濃度的三種基因型DNA在兩種體系中均可檢出，能有效避免假陰性。

實(shí)施例6：用本發(fā)明制備的試劑盒檢測臨床樣本中的ABCB1的C3435T多態(tài)性

本實(shí)施例是從湖北省人民醫(yī)院采集的臨床樣本84例EDTA抗凝血中提取基因組DNA，并對其進(jìn)行定量，作為PCR檢測的模板。采用天根(QIAGEN)公司的血液基因組DNA提取試劑盒，具體操作詳見說明書。最后將提取的DNA用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，稀釋DNA濃度到2ng/μL。

采用實(shí)施例4制備的試劑盒，具體檢測方法如下：

(1)每次PCR反應(yīng)中，同時(shí)進(jìn)行非模板對照(NoTemplate Control；NTC，本實(shí)施例用超純水)、陽性對照和待測樣本的檢測。

(2)將陽性對照取出解凍后震蕩混勻，并離心30s。

(3)將8聯(lián)PCR反應(yīng)條取出解凍后離心30s，防止反應(yīng)液在開蓋時(shí)濺出。

(4)將超純水(NTC)、待測樣本、陽性對照分別加入A1反應(yīng)液和A2反應(yīng)液中，每孔10μL。

(5)將以上8聯(lián)PCR反應(yīng)條蓋好管蓋于離心機(jī)上離心30S，確保管壁上不沾有液滴。

(6)將8聯(lián)PCR反應(yīng)條放于實(shí)時(shí)PCR儀器中。

反應(yīng)條件的設(shè)置：

第一階段：95℃5min；

第二階段：95℃5s，58℃30s，10個(gè)循環(huán)；

第三階段：95℃5s，58℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；

信號收集：第三階段72℃時(shí)收集FAM和JOE信號。

檢測結(jié)果時(shí)，先判斷陽性對照的野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系的FAM均有明顯的擴(kuò)增曲線，JOE有明顯的擴(kuò)增曲線且JOE信號的Ct值≤25，符合要求；所述陰性對照的野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系的FAM、JOE均沒有明顯的擴(kuò)增曲線，符合要求；否則，應(yīng)重新進(jìn)行檢測。對于檢測樣本時(shí)，F(xiàn)AM是檢測信號，用于檢測樣本的基因多態(tài)性，通過反應(yīng)體系的突變型和野生型FAM信號的熒光強(qiáng)度差異來判斷檢測結(jié)果；JOE是內(nèi)控信號，用于檢測體系是否正常，樣本是否漏加及初步判斷樣本DNA量是否在允許范圍內(nèi)，JOE信號應(yīng)達(dá)到設(shè)定閾值(CT值小于25)；在內(nèi)控信號達(dá)到要求后，以SNP位點(diǎn)的突變型和野生型FAM信號達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)次數(shù)CT值的差值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)?！鰿t＝|野生型CT值-突變型CT值|≤2.5為雜合型樣本，△Ct＝野生型CT值-突變型CT值>2.5為突變型樣本，△Ct＝突變型CT值-野生型CT值>2.5為野生型樣本，樣本結(jié)果判定具體見表4。

表4 ABCB1基因多態(tài)性檢測結(jié)果判定

利用本發(fā)明方法對湖北省人民醫(yī)院采集的臨床84例樣本提取的DNA進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果如下表5，樣本的擴(kuò)增曲線圖此處不再全部例出，僅例出代表的三個(gè)樣品的擴(kuò)增曲線圖，具體如圖3、圖4、圖5所示。

表5 84例樣本的DNA ABCB1C3435T多態(tài)性檢測結(jié)果

同時(shí)將84例樣本DNA采用Sanger金標(biāo)準(zhǔn)(武漢艾康健公司測序)進(jìn)行測序檢測，將兩者的檢測能力進(jìn)行比較，結(jié)果見表6。EDTA抗凝血提取的基因組DNA用本發(fā)明的試劑盒檢測的結(jié)果和“金標(biāo)準(zhǔn)”sanger測序的結(jié)果完全一致，說明本發(fā)明制備的試劑盒準(zhǔn)確度高，操作簡單、耗時(shí)短。

表6本發(fā)明檢測結(jié)果和sanger測序金標(biāo)準(zhǔn)比較

實(shí)施例7本發(fā)明試劑盒及方法對樣本上樣量的檢測

本實(shí)施例為采用本發(fā)明所提供的引物、探針擴(kuò)增實(shí)施例6所提取的湖北省人民醫(yī)院的臨床血液DNA樣品，根據(jù)定量結(jié)果將樣本分別稀釋到20ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL，按照實(shí)施例2中的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)。雜合樣本在A1和A2體系中上樣總量分別為200ng、100ng、10ng、1ng時(shí)的擴(kuò)增曲線見圖6。結(jié)果說明對于高至200ng的基因組DNA不會(huì)出現(xiàn)非特異性的結(jié)果，可以減少稀釋樣本的過程。

以上所述實(shí)施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢海吉力生物科技有限公司

<120> 用于快速檢測ABCB1基因C3435T多態(tài)性的核酸、試劑盒及方法

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tcctttgctg ccctctcg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cctcctttgc tgccctcata 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tcgtgtccca ggagccc 17

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cctgtgacac caccc 15

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

actgagcctg gaggtgaaga ag 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cctgccaagg ggtcgtaga 19

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ctgtgggaag agcacagtgg tccagc 26

<210> 8

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tcgtgtccca ggagcccatc ctgtttgact gcagcattgc tgagaacatt gcctatggag 60

acaacagccg ggtggtgtca caggaagaga ttgtgagggc agcaaagga 109

<210> 9

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tcgtgtccca ggagcccatc ctgtttgact gcagcattgc tgagaacatt gcctatggag 60

acaacagccg ggtggtgtca caggaagaga tcgtgagggc agcaaaggag g 111

<210> 10

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

actgagcctg gaggtgaaga agggccagac gctggctctg gtgggcagca gtggctgtgg 60

gaagagcaca gtggtccagc tcctggagcg gttctacgac cccttggcag g 111