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用于快速檢測ABCB1基因C3435T多態性的核酸、試劑盒及方法與流程

文檔序號:12412734閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一組用于快速檢測ABCB1基因C3435T多態性的核酸,其特征在于,該核酸包括檢測引物和檢測探針,其中,所述檢測引物包括野生型下游引物、突變型下游引物和公用上游引物,所述野生型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1,所述突變型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述公用上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.如權利要求2所述的核酸,其特征在于,所述核酸還包括內部質控,其包括質控引物對和質控探針,所述質控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示,所述質控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

3.如權利要求1或2所述的核酸,其特征在于,所述核酸還包括野生型陽性對照物、突變型陽性對照物、和/或作為所述內部質控的質控陽性對照物,其中,所述野生型陽性對照物含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列,所述突變型陽性對照物含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列,所述質控陽性對照物含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

4.一種用于快速檢測ABCB1基因C3435T多態性的試劑盒,其特征在于,該試劑盒包括如權利要求1-3中任一所述的核酸,其中,所述檢測探針和質控探針的5'端連接熒光基團,3'端連接淬滅基團。

5.如權利要求4所述的試劑盒,其特征在于,試劑盒還包括10×PCR緩沖液、DNA聚合酶、dNTPs、礦物油、陰性對照物:無核酸酶水,所述熒光基團為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種,所述淬滅基團為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

6.一種快速檢測ABCB1基因C3435T多態性的方法,其特征在于,該方法包括以下步驟:

(1)從樣品中提取DNA;

(2)對提取的所述DNA,同時進行野生型反應體系和突變型反應體系的實時熒光PCR擴增;其中,在所述野生型反應體系中檢測引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示,檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;在所述突變型反應體系中檢測引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示,檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述公用檢測探針的5'端連接熒光基團,3'端連接淬滅基團;

(3)數據采集和分析:將閾值線調整至背景信號及陰性擴增線以上,通過實時熒光PCR儀收集信號,計算所述野生型反應體系和突變型反應體系的△Ct值來確定所述樣品DNA的基因型。

7.如權利要求6所述的方法,其特征在于,在步驟(2)中,所述野生型反應體系和所述突變型反應體系中還包括有作為內部質控的質控引物對和質控探針,所述質控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示,所述質控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,該質控探針的5'端連接有不同于所述檢測探針的熒光基團,3'端連接有不同于所述檢測探針的淬滅基團。

8.如權利要求7所述的方法,其特征在于,在步驟(2)中,在各自的所述野生型反應體系和所述突變型反應體系中,各條引物和各條探針的終濃度均為100-1000nmol/L;所述熒光基團為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種,所述淬滅基團為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種;

所述實時熒光PCR擴增的反應程序為:

第一階段:95℃5min;

第二階段:95℃5s,58℃30s,10個循環;

第三階段:95℃5s,58℃30s,72℃30s,35個循環;

信號收集:第三階段72℃時收集熒光信號。

9.如權利要求7或8所述的方法,其特征在于,在步驟(2)中,在各自所述野生型反應體系和所述突變型反應體系中,所述野生型引物對的終濃度均為200nmol/L,所述突變型引物對的終濃度均為200nmol/L,所述檢測探針的終濃度為150nmol/L,所述質控引物對的終濃度均為150nmol/L,所述質控探針的終濃度為100nmol/L;所述檢測探針的5'端連接FAM,3'端連接MGB,所述質控探針的5'端連接JOE,3'端連接BHQ1;

在所述步驟(3)中,檢測樣本的所述內部質控的JOE信號應達到設定閾值Ct值小于25,再確定所述樣本DNA的基因型;否則應重新進行檢測;

確定所述樣品DNA的基因型,按照以下公式進行計算:

-2.5≤ΔCt=野生型Ct值-突變型Ct值≤2.5,判定為雜合型樣本;

ΔCt=突變型Ct值-野生型Ct值>2.5,判定為野生型樣本;

ΔCt=野生型Ct值-突變型Ct值>2.5,判定為突變型樣本。

10.如權利要求9所述的方法,其特征在于,在步驟(2)中,還設有陽性對照和陰性對照,所述陽性對照為以含有如SEQ ID No.8核苷酸序列所示的野生型陽性對照物、含SEQ ID No.9核苷酸序列所示的突變型陽性對照物、和/或含有如SEQ ID No.10核苷酸序列所示的質控陽性對照物為模板,進行所述野生型反應體系和突變型反應體系的實時熒光PCR擴增;所述陰性對照為以水為模板,進行所述野生型反應體系和突變型反應體系的實時熒光PCR擴增;

在步驟(3)中,所述陽性對照的野生型反應體系和突變型反應體系的FAM均有明顯的擴增曲線,和/或JOE有明顯的擴增曲線且JOE信號的Ct值≤25,符合要求;所述陰性對照的野生型反應體系和突變型反應體系的FAM、JOE均沒有明顯的擴增曲線,符合要求;否則,應重新進行檢測。

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