本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種抗肥胖十一肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生物活性肽是對(duì)機(jī)體的功能或狀態(tài)具有積極作用并最終影響機(jī)體健康的特殊蛋白質(zhì)片段。相較于蛋白質(zhì)而言，小分子肽片段的優(yōu)越性主要體現(xiàn)在：更易被人體吸收利用；活性高，在較小濃度下即可發(fā)揮其特有的生理作用；分子量小，易于修飾和改造，能夠通過人工化學(xué)合成等。而相較于單一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸無可比擬的優(yōu)越性。已有研究證實(shí)，人體小腸存在專門的低聚肽吸收通道，人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)過多種消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸收。許多研究表明，各種來源的生物活性肽具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降壓、降血糖等多種作用，成為生物醫(yī)藥和保健品開發(fā)的熱點(diǎn)。肥胖增加動(dòng)脈粥樣硬化，冠心病，高血壓，糖尿病，痛風(fēng)，脂肪肝等疾病的發(fā)病危險(xiǎn)。因此，對(duì)具有減肥降脂作用而安全無害的生物活性肽的開發(fā)研究，變得尤為重要。目前，具有減肥降脂作用的多肽包括利拉魯肽，鱸魚活性肽，蠶蛹肽等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明選取小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1為研究對(duì)象，使用MTT法測(cè)定合成肽的體外抑制活性。本發(fā)明的目的是提供一種具有體外抗肥胖活性的合成多肽，可應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域。

本發(fā)明合成的抗肥胖十一肽縮寫為NALKCCHSCPA，分子量1146.38，序列為：Asn-Ala-Leu-Lys-Cys-Cys-His-Ser-Cys-Pro-Ala。其中，

Asn表示英文名稱為Asparagine，中文名稱為天冬酰胺酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Ala表示英文名稱為Alanine，中文名稱為丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Leu表示英文名稱為L(zhǎng)eucine，中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Lys表示英文名稱為L(zhǎng)ysine，中文名稱為賴氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Cys表示英文名稱為Cysteine，中文名稱為半胱氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Cys表示英文名稱為Cysteine，中文名稱為半胱氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

His表示英文名稱為Histidine，中文名稱為組氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Ser表示英文名稱為Serine，中文名稱為絲氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Cys表示英文名稱為Cysteine，中文名稱為半胱氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Pro表示英文名稱為Proline，中文名稱為脯氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；

Ala表示英文名稱為Alanine，中文名稱為丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基。

本發(fā)明所述的氨基酸序列采用標(biāo)準(zhǔn) Fmoc 方案，通過樹脂的篩選，合理的多肽合成方法。將目標(biāo)多肽的 C-端羧基以共價(jià)鍵形式與一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連，然后以這個(gè)氨基酸的氨基作為起點(diǎn)，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復(fù)這一過程，即可以得到目標(biāo)多肽產(chǎn)物。合成反應(yīng)完成后，去除保護(hù)基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標(biāo)產(chǎn)物。多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N 端合成。

本發(fā)明將終濃度為0.125-2 mg/mL 的合成多肽與3T3-L1混勻，孵育48 h后，經(jīng)MTT法檢測(cè)，對(duì)脂肪細(xì)胞抑制率達(dá)到29.9%-36.84%,可在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用。

所述十一肽NALKCCHSCPA在濃度為2 mg/mL 時(shí)，對(duì)3T3-L1的體外增殖抑制率為36.84%。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：

本發(fā)明首次合成了該肽，并且采用MTT方法檢測(cè)了合成多肽的體外脂肪細(xì)胞增殖抑制活性，所述合成多肽具有一定的脂肪細(xì)胞抑制能力。

附圖說明

圖1a為合成多肽Asn-Ala-Leu-Lys-Cys-Cys-His-Ser-Cys-Pro-Ala 的HPLC圖。

圖1b為合成多肽Asn-Ala-Leu-Lys-Cys-Cys-His-Ser-Cys-Pro-Ala 的MS圖。

圖2為合成多肽Asn-Ala-Leu-Lys-Cys-Cys-His-Ser-Cys-Pro-Ala對(duì)脂肪細(xì)胞3T3-L1的抑制活性柱狀圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍不限于此。

多肽固相合成

選用高分子樹脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列Asn-Ala-Leu-Lys-Cys-Cys-His-Ser-Cys-Pro-Ala的特征，先將Ala的羧基以共價(jià)鍵的形式與一個(gè)樹脂相連，然后Pro的氨基和Ala 的羧基縮水反應(yīng)，處理后，再添加Cys，Cys的氨基和Pro的羧基反應(yīng)，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一個(gè)Asn氨基酸后，再切除樹脂即得到目標(biāo)多肽。采用高效液相色譜進(jìn)行純化，色譜柱型號(hào)為Phenomenex C₁₈，尺寸 4.6*150mm，流動(dòng)相A:含有0.1%三氟乙酸（TFA）的水；流動(dòng)相B:含有0.09%TFA 的溶液 (80%乙腈+20%水)；20 min內(nèi)B相由14.0%上升到24.0%，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。液氮速凍，冷凍干燥，得到最后的產(chǎn)品，要求純度達(dá)到98.06%以上，并經(jīng)MS 鑒定結(jié)構(gòu)（如圖1 所示）。

合成多肽的體外抑制活性

通過 MTT 比色法分析肽組分對(duì)3T3-L1的生長(zhǎng)抑制作用。具體操作步驟如下：

1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)0.25%（體積）的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相應(yīng)的完全培養(yǎng)基終止消化并重懸細(xì)胞，血球平板計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度至5×10⁴個(gè)/mL，加至96孔板中，每孔100 μL, 于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

2）培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為200 μL的含有不同濃度待測(cè)樣品的新鮮完全培養(yǎng)基，并以完全培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

3）48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養(yǎng)基180 μL；于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

4）4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑制率:

脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=((對(duì)照組OD-空白組OD)-(給藥組OD-空白組OD ))/((對(duì)照組OD-空白組OD ) )×100 。

應(yīng)用實(shí)施例1

脂肪細(xì)胞3T3-L1 100 μL 細(xì)胞懸液(5×10⁴個(gè)/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 24 h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為100 μL的125 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養(yǎng)基，并以完全培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養(yǎng)基180 μL；于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑制率。由圖2可知，125 μg/mL的多肽對(duì)脂肪細(xì)胞3T3-L1的抑制率是29.9%。

應(yīng)用實(shí)施例2

脂肪細(xì)胞3T3-L1 100 μL 細(xì)胞懸液(5×10⁴個(gè)/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為100 μL的250 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養(yǎng)基，并以完全培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養(yǎng)基180 μL；于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑制率。由圖2可知，250 μg/mL的多肽對(duì)脂肪細(xì)胞3T3-L1的抑制率是30.39%。

應(yīng)用實(shí)施例3

脂肪細(xì)胞3T3-L1 100 μL 細(xì)胞懸液(5×10⁴個(gè)/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 24 h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為100 μL的500 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養(yǎng)基，并以完全培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮基完全培養(yǎng)基180 μL；于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑制率。由圖2可知，500 μg/mL的多肽對(duì)脂肪細(xì)胞3T3-L1的抑制率是35.19%。

應(yīng)用實(shí)施例4

脂肪細(xì)胞3T3-L1 100 μL 細(xì)胞懸液(5×10⁴個(gè)/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 24 h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為100 μL的1000 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養(yǎng)基，并以完全培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養(yǎng)基180 μL；于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑制率。由圖2可知，1000 μg/mL的多肽對(duì)脂肪細(xì)胞3T3-L1的抑制率是37.11%。

應(yīng)用實(shí)施例5

脂肪細(xì)胞3T3-L1 100 μL 細(xì)胞懸液(5×10⁴個(gè)/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 24 h后細(xì)胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為100 μL的2000 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養(yǎng)基，并以完全培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養(yǎng)基180 μL；于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值并計(jì)算抑制率。由圖2可知，2000 μg/mL的多肽對(duì)脂肪細(xì)胞3T3-L1的抑制率是36.84%。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南理工大學(xué)

<120> 一種抗肥胖十一肽NALKCCHSCPA

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asn Ala Leu Lys Cys Cys His Ser Cys Pro Ala

1 5 10