本發(fā)明涉及生物分子學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及利用與股骨頭壞死相關(guān)的microRNA作為分子標(biāo)記物在預(yù)防或治療糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：股骨頭壞死因其主要病理系股骨頭血運(yùn)受阻，遭受破壞而引起的頭部骨質(zhì)缺血，故多稱為股骨頭缺血性壞死或股骨頭無菌性壞死。股骨頭缺血性壞死(avascularnecrosisofthefemoralhead,ANFH)是骨科常見病，多發(fā)病，早期診斷困難，治療效果欠佳。長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用激素致股骨頭缺血性壞死，現(xiàn)已成為臨床常見的藥源性疾病。據(jù)國(guó)內(nèi)報(bào)道，小劑量長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素致股骨頭壞死的發(fā)病率為20％，大劑量短期應(yīng)用的發(fā)病率為40％左右。股骨頭壞死病理機(jī)制復(fù)雜，其特征是因血液循環(huán)障礙導(dǎo)致股骨頭缺血壞死，由于機(jī)體對(duì)壞死區(qū)具有自然修復(fù)能力，當(dāng)新生骨細(xì)胞隨新生血管向壞死區(qū)生長(zhǎng)并形成新骨的同時(shí)，壞死骨小梁將被逐步吸收。在此過程中骨的力學(xué)性能明顯減弱，正常負(fù)重即可致股骨頭塌陷，關(guān)節(jié)間隙變窄，最后導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎，使病人髖關(guān)節(jié)功能障礙而致殘致癱。股骨頭髓腔內(nèi)骨髓脂肪化是激素性股骨頭壞死(SteroidinducedAvascularNecrosisofFemoralHead,SANFH)早期的重要病理改變。近年來研究證明，激素可引起骨髓基質(zhì)細(xì)胞大量分化成脂肪細(xì)胞，造成髓內(nèi)脂肪細(xì)胞堆積，引起骨內(nèi)壓增高，使股骨頭內(nèi)微循環(huán)障礙而引起大量骨細(xì)胞缺血壞死。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞。骨的發(fā)育隨年齡發(fā)生著動(dòng)態(tài)的變化，其中由成骨細(xì)胞引導(dǎo)的骨形成和由破骨細(xì)胞引導(dǎo)的骨吸收構(gòu)成了骨重建的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)成骨細(xì)胞分化異常時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)骨代謝疾病的發(fā)生，如骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死、關(guān)節(jié)退行性變、股骨頭壞死等。MicroRNA(miRNAs)是一類長(zhǎng)約22～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合靶基因的3’非編碼區(qū)(3’TTR)，從而抑制翻譯或降解靶基因。MicroRNA在進(jìn)化過程中高度保守，在生物體內(nèi)分布廣泛，并參與許多復(fù)雜的生物學(xué)過程，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、脂肪代謝、骨形成等。有研究表明：miRNAs通過調(diào)控成骨分化相關(guān)基因表達(dá)在骨形成中起關(guān)鍵作用，如miR-216促進(jìn)人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化、miR-494通過調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)抑制成骨細(xì)胞分化等。早期的診斷和治療是治療SANFH的關(guān)鍵。隨著生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多的和SANFH相關(guān)的基因見諸報(bào)道，證實(shí)了多種基因在ANFH的發(fā)生發(fā)展中的作用，為SANFH的早期診斷和治療提供了理論依據(jù)。因此本領(lǐng)域迫切需要開展與激素性股骨頭壞死相關(guān)聯(lián)的特異性miRNA作為早期診斷的標(biāo)記物的研究，以便提供新的有效的預(yù)防和治療靶點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了實(shí)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，本發(fā)明的目的在于提供一種新的與糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死相關(guān)的miRNAs。本發(fā)明的目的還在于提供該股骨頭壞死相關(guān)miRNAs在預(yù)防或治療糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種檢測(cè)糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死的分子標(biāo)記物，所述分子標(biāo)記物為miR-4289、miR-378g、miR-378f、miR-378d、miR-196b-5p、miR-196a-5p、miR-16-5p、miR-1268b、miR-1268a、miR-107和miR-103a-3p中的一個(gè)或多個(gè)miRNAs。本發(fā)明進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)所述的分子標(biāo)記物在糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死患者生物學(xué)樣品中表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述的分子標(biāo)記物在預(yù)防或治療糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述糖皮質(zhì)激素包括：地塞米松、倍他米松、潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、由安西龍、氫化可的松和可的松。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種治療糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死的藥物，其特征在于，所述的藥物包含miR-16-5p抑制劑。優(yōu)選的，所述miR-16-5p抑制劑是miR-16-5p的反義寡核苷酸或拮抗劑，所述的miR-16-5p的反義寡核苷酸序列為SEQIDNO.4。優(yōu)選的，所述的藥物能夠抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種診斷糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死的試劑，所述試劑盒包括用于檢測(cè)miR-16-5p的表達(dá)水平的試劑。優(yōu)選的，所述的試劑包括特異性擴(kuò)增miR-16-5p的引物或探針。優(yōu)選的，所述的引物序列包括正向引物序列如SEQIDNO.1所示和反向引物為通用引物。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了與糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死相關(guān)的分子標(biāo)記物，并進(jìn)一步證實(shí)所述分子標(biāo)記物在糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死患者生物學(xué)樣本中表達(dá)上調(diào)。利用這些分子標(biāo)記物檢測(cè)糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死不僅能夠快速有效的做到早期檢測(cè)，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點(diǎn)和重要依據(jù)。附圖說明圖1miR-16-5p在不同濃度地塞米松刺激的MSCs中表達(dá)情況。圖2miR-16-5p抑制劑對(duì)MSCs細(xì)胞凋亡的影響。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第三版)(科學(xué)出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)25例股骨頭壞死患者樣本及22例對(duì)照樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)行差異性表達(dá)miRNA的篩選，再進(jìn)行GO功能富集合和信號(hào)通路分析，挑選了差異表達(dá)上調(diào)的miRNAs：miR-4289、miR-378g、miR-378f、miR-378d、miR-196b-5p、miR-196a-5p、miR-16-5p、miR-1268b、miR-1268a、miR-107和miR-103a-3p。現(xiàn)有研究中并沒有上述miRNAs和股骨頭壞死相關(guān)的報(bào)道，進(jìn)一步，發(fā)明人進(jìn)行了分子生物學(xué)方法驗(yàn)證，采用RT-PCR方法檢測(cè)上述miRNAs在不同濃度地塞米松刺激的MSCs中的表達(dá)，并驗(yàn)證了上述miRNAs在高濃度地塞米松刺激的MSCs中表達(dá)上調(diào)。此外還驗(yàn)證了miR-16-5p可以引起細(xì)胞凋亡，其相關(guān)制劑可用于治療糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死。本文使用的“股骨頭壞死”未做說明時(shí)，一般特指激素性股骨頭缺血性壞死。本文使用的“糖皮質(zhì)激素”是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體激素，目前也可由化學(xué)方法人工合成。糖皮質(zhì)激素可用于一般的抗生素或消炎藥所不及的病癥，如SARS、敗血癥等，具有調(diào)節(jié)糖、脂肪、蛋白質(zhì)的生物合成和代謝的作用，還具有抗炎作用。代表性的糖皮質(zhì)激素例子包括(但并不限于):地塞米松、倍他米松、潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、由安西龍、氫化可的松和可的松。一類與使用糖皮質(zhì)激素藥物相關(guān)的常見副作用是會(huì)導(dǎo)致不利的骨病，其中包括(但并不限于):骨質(zhì)疏松、骨髓脂肪化、股骨頭壞死。本文使用的“地塞米松”是一種人工合成的腎上腺皮質(zhì)激素，其衍生物有氫化可地松、潑尼松等，具有抗炎、抗內(nèi)毒素、抑制免疫、抗休克及增強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)等藥理作用，廣泛應(yīng)用于各科治療多種疾病，如自身免疫性疾病，過敏，炎癥，哮喘，及皮膚科、眼科疾病。地塞米松的藥理作用主要包括:抗炎作用和免疫抑制作用。抗炎作用表現(xiàn)在，減輕和防止組織對(duì)炎癥的反應(yīng)，抑制巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞在炎癥部位的集聚，抑制吞噬作用、溶酶體酶的釋放以及炎癥化學(xué)中介物的合成和釋放，減輕和防止組織對(duì)炎癥的反應(yīng)，從而減輕炎癥的表現(xiàn)。其免疫抑制作用表現(xiàn)在:防止或抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，延遲性的過敏反應(yīng)，減少T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞的數(shù)目，降低免疫球蛋白與細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力，抑制白介素的合成與釋放，降低T淋巴細(xì)胞向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并經(jīng)原發(fā)免疫反應(yīng)的擴(kuò)展；可降低免疫復(fù)合物通過基底膜，并能減少補(bǔ)體成份及免疫球蛋白的濃度。臨床發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期使用地塞米松(Dex)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的股骨頭壞死。本文使用的“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞”以及“BMSCs”含義相同，可以互換使用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種存在于骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有定向或多向分化的潛能。成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞都來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，而且二者的分化存在一種競(jìng)爭(zhēng)性的平衡，因而股骨頭壞死病人骨髓中出現(xiàn)大量的脂肪提示BMSCs轉(zhuǎn)向脂肪細(xì)胞分化而成骨分化受到抑制。BMSCs具有強(qiáng)大的自我增殖能力和分化多潛能性，可通過調(diào)節(jié)向成骨方向分化。BMSCs的分化方向受到轉(zhuǎn)錄因子的嚴(yán)格調(diào)控，Runx2是啟動(dòng)成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經(jīng)皮、粘膜、口頰、舌下或經(jīng)口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預(yù)防效果即可，包括但不限于口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直腸灌注、鼻腔噴霧、口腔噴霧、皮膚局部或全身經(jīng)皮用藥。本發(fā)明的藥物的劑量可隨給藥模式和待治療的疾病程度等而變化，可以依據(jù)癥狀、性別、年齡等來恰當(dāng)?shù)拇_定。優(yōu)選的本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物的劑量可以使用對(duì)疾病的治療效果或者預(yù)防效果作為指標(biāo)來確定。本文使用的“生物學(xué)樣品”包括但不限于血、血清、唾液、尿、滑液、軟骨、滑膜組織等樣品。用于本發(fā)明的生物學(xué)樣品得自任何受試者的任何組織樣品(如椎間盤、關(guān)節(jié)突、脊髓、椎旁肌或血樣)或細(xì)胞樣品(如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或血細(xì)胞樣品)均可以根據(jù)本發(fā)明方法使用。可以從中獲得這些樣品并根據(jù)本發(fā)明方法使用這些樣品的受試者實(shí)例包括但不限于無癥狀受試者、表現(xiàn)或更多股骨頭壞死癥狀的受試者、臨床診斷為患有股骨頭壞死的受試者、易患股骨頭壞死的受試者(如有股骨頭壞死家族史的受試者、有股骨頭壞死遺傳易感性的受試者以及生活方式使其易感股骨頭壞死或提高患股骨頭壞死可能性的受試者)、懷疑患有股骨頭壞死的受試者、正接受股骨頭壞死治療的受試者、患有股骨頭壞死和非接受股骨頭壞死治療的受試者、開業(yè)醫(yī)生(如醫(yī)師)確定為健康或無股骨頭壞死的受試者(即正常)、已治愈股骨頭壞死的受試者、正在控制其股骨頭壞死的受試者和未診斷為股骨頭壞死的受試者。本文使用的“對(duì)照”指未顯示任何股骨頭壞死癥狀(包括創(chuàng)傷性性股骨頭壞死和非創(chuàng)傷性股骨頭壞死)并且未診斷為股骨頭壞死的個(gè)體或個(gè)體組。優(yōu)選地，所述對(duì)照個(gè)體未使用影響股骨頭壞死的藥物。更優(yōu)選地，對(duì)照個(gè)體具有與測(cè)試樣本相比相似的性別、年齡和體重指標(biāo)(BMI)。根據(jù)本發(fā)明，“對(duì)照”還指分離自正常個(gè)體的樣品，包括分離自正常個(gè)體的總RNA或mRNA。取自對(duì)照個(gè)體的樣品可包括分離自樣本組織的RNA，其中RNA分離自樣本組織，所述樣本組織分離自組織移除時(shí)未診斷為股骨頭壞死并且未顯示任何股骨頭壞死癥狀的個(gè)體。在根據(jù)本發(fā)明方法使用前，任選地(但優(yōu)選)將收集的生物學(xué)樣品保存在低溫如4℃下。在一些實(shí)施方案中，在第一時(shí)間根據(jù)本發(fā)明方法使用樣品的一部分，而將一個(gè)或多個(gè)剩余的樣品部分保存一段時(shí)間以備后用。該段時(shí)間可以是1小時(shí)或更長(zhǎng)、1天或更長(zhǎng)、1周或更長(zhǎng)、1月或更長(zhǎng)、1年或更長(zhǎng)或不確定。就長(zhǎng)期保存而言，可以使用本領(lǐng)域熟知的保存方法，例如在冷凍溫度(如低于-80℃)保存。實(shí)施例1高通量測(cè)序篩選差異表達(dá)基因1、取樣收集25例行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的股骨頭壞死患者骨髓組織樣本，取樣來源于2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院骨科就診的患者，所有患者均確診為由長(zhǎng)期或大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素致股骨頭缺血性壞死。對(duì)照來源于同時(shí)期骨科住院的髖關(guān)節(jié)粉碎性骨折患者的髖關(guān)節(jié)處骨髓組織樣本，共收集22例。采集所有研究對(duì)象的樣本，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。本研究的所有臨床樣本，均對(duì)患者進(jìn)行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。2、對(duì)組織樣本進(jìn)行總RNA提取采用Reagent(invitrogen，貨號(hào)15596-018)進(jìn)行樣本RNA提取，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①加入Trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按ImL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時(shí)后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。4、高通量測(cè)序測(cè)序平臺(tái)為IllTmina公司的HiSeq2500高通量測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，測(cè)序后我們運(yùn)用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.Tk/projects/fastqc/)軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCRdTplication含量，kmer的freqTency等。在差異基因表達(dá)分析時(shí)，根據(jù)得到的FPKM值，采用國(guó)際公認(rèn)算法EBSeq進(jìn)行差異篩選。其中，篩選時(shí)，LOG2FC>1或<-1，F(xiàn)DR<0.05。為了更好的理解差異表達(dá)基因的功能，我們對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GeneOntology和信號(hào)通路分析，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)分析，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了差異表達(dá)miRNAs:miR-4289、miR-378g、miR-378f、miR-378d、miR-196b-5p、miR-196a-5p、miR-16-5p、miR-1268b、miR-1268a、miR-107和miR-103a-3p，所述miRNAs在股骨頭壞死患者組織樣本中表達(dá)上調(diào)。實(shí)施例2RT-PCR檢測(cè)不同濃度地塞米松處理的細(xì)胞has-miR-16表達(dá)情況1、取樣收集3例行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的患者骨髓樣本，取樣來源于2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院骨科就診的髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者。采集所有研究對(duì)象的樣本，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。本研究的所有臨床樣本，均對(duì)患者進(jìn)行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)(1)使用無菌骨髓穿刺針和注射器來提取股骨側(cè)骨的骨髓組織。(2)將提取的骨髓組織移入含有培養(yǎng)基和肝素抗凝劑(4000T/ml)的試管中，用等體積的PBS進(jìn)行稀釋。靜置30s，棄去沉淀后加入等量的1.077μg/ml淋巴細(xì)胞分離液，以778xg離心20分鐘，在白色中間層收集單核細(xì)胞。(3)單核細(xì)胞用10mlD-Hanks液洗滌，280xg離心6分鐘后收集。加入含58％的DMEM的DMEM/F12培養(yǎng)液、40％MCDB-201、2％胎牛血清、10ng/mlEGF、10ng/mlPDGF、1X胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑、1X亞油酸-牛血清白蛋白、50μMβ-巰基乙醇、2mML-谷氨酰胺、100μg/ml青霉素和100μg/ml硫酸鏈霉素培養(yǎng)，細(xì)胞密度為2x106/ml。(4)每2天更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞匯合成片且貼壁率達(dá)到70-80％后，加0.25％胰蛋白酶和0.01％的EDTA制成細(xì)胞懸液，然后按照1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(5)培養(yǎng)至第三代時(shí)，將MSCs以2×104/cm2接種于25CM2(T25)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。當(dāng)它們達(dá)到70％-80％的匯合率時(shí)，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液：含10％胎牛血清、10nm的地塞米松，0.2mM抗壞血酸和10mMβ-甘油磷酸鈉的H-DMEM培養(yǎng)基。地塞米松的濃度分別采用10-7mol/L和10-9mol/L兩種濃度分組進(jìn)行培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)液。3、RT-PCR檢測(cè)于成骨誘導(dǎo)后6天，采用RT-PCR檢測(cè)兩組不同濃度地塞米松刺激處理后的MSCs中has-miR-16的表達(dá)情況。3.1總RNA提取同實(shí)施例1的方法進(jìn)行RNA提取。3.2逆轉(zhuǎn)錄使用OneStepPrimeScriptmiRNAcDNASynthesisKit(Takara，CodeNo.D350A)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，采用20μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總RNA作為模板。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。3.3Real-TimePCR使用SYBRPrimeSciptmiRNART-PCRKit(Takara，CodeNo.RR716)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系如表1所示。表1miRNA的RT-PCR反應(yīng)體系組分加入量SYBRPremixExTaqII(2×)10μLPCRForwardPrimer(10μM)0.5μLTni-miRqPCRPrimer(10μM)0.5μLROXReferenceDyeII(50×)2μL模板(cDNA溶液)2μLdH2O至20μLmiRNAs的表達(dá)檢測(cè)每次設(shè)置3個(gè)平行管反應(yīng)。擴(kuò)增miR-16-5p正向引物序列如SEQIDNO.1所示，以snRNAT6作為內(nèi)參，其上游引物為SEQIDNO.2所示，下游引物為SEQIDNO.3所示。擴(kuò)增程序：95℃30s；40x(95℃5s，60℃34s)。3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，極限平而無上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴(kuò)增效率較高；樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增；根據(jù)qRT-PCR的相對(duì)定量公式：2-△△Ct×100％，比較has-miR-16在10-7mol/L地塞米松刺激的MSCs中和10-9mol/L地塞米松刺激的MSCs中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：miR-16-5p在10-7mol/L地塞米松刺激的MSCs中表達(dá)上調(diào)，如圖1所示。實(shí)施例3抑制miR-16-5p表達(dá)1、細(xì)胞來源實(shí)施例2培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。2、設(shè)計(jì)合成針對(duì)miR-16-5p的反義寡核苷酸(anti-miR-16-5p)根據(jù)miR-16-5p的序列信息由大連寶生物生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成miR-16-5p的反義寡核苷酸序列和隨機(jī)對(duì)照序列，miR-16-5p的反義寡核苷酸序列為SEQIDNO.4。3、轉(zhuǎn)染采用陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，操作按照LipofectamineTM2000TransfectionReagent試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前24h將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞計(jì)數(shù)約5×104，常規(guī)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染當(dāng)天，細(xì)胞融合度為50-60％時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。將80nManti-miR-16-5p加入到100TLDMEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻；另用100TLDMEM培養(yǎng)基稀釋2TLLipofectaminTM2000脂質(zhì)體，輕柔混勻，室溫孵育5min；混合DMEM-脂質(zhì)體與DMEM-miRNAs，室溫孵育20min，以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；然后將上述混合物加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，使他們充分混合。其中，非特異性序列作為陰性對(duì)照(anti-NC)，同期設(shè)有空白對(duì)照組。培養(yǎng)48h后提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。4、anti-miR-16-5p對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞miR-16-5p表達(dá)的作用：細(xì)胞總RNA提取和PCR步驟同實(shí)施例2。Real-timePCR結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中miR-16-5p表達(dá)無明顯抑制作用，和空白對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，轉(zhuǎn)染的anti-miR-16-5p組對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中miR-16-5p表達(dá)起到一定抑制作用抑制率為54％。實(shí)施例4miR-16-5p抑制劑對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響按照實(shí)施例3的方法對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行anti-miR-16-5p和anti-NC的轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集(注：胰酶消化時(shí)間不易過長(zhǎng)，否則容易引起假陽性)；用PBS洗滌細(xì)胞二次(2000rpm離心5min)收集1～5×105細(xì)胞；按照AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒(購自Invitrogen公司)的操作說明進(jìn)行細(xì)胞處理。加入500μL的BindingBTffer(凱基，南京)懸浮細(xì)胞；加入5μLAnnexinV-FITC(凱基，南京)混勻后，加入5μLPropidiTmIodide(凱基，南京)，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5-15min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果如圖2所示，與轉(zhuǎn)染anti-NC細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)染anti-miR-16-5p的細(xì)胞凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>邊焱焱<120>MicroRNA在預(yù)防或治療糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死中的應(yīng)用<130>P16ghs125<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1tagcagcacgtaaatattggcg22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2gtgctcgcttcggcagcacatat23<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3aaaatatggaacgcttcacgaa22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4atcgtcgtgcatttataaccgc22當(dāng)前第1頁1 2 3