本發明屬于基因工程及腦血管醫學技術領域。更具體地，涉及一種與抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中相關的SNP標志物及其應用。
背景技術：
缺血性腦卒中，又被稱為腦梗塞或腦梗死（中醫則稱之為中風），是指由于腦部血液供應障礙，缺血、缺氧引起的局限性腦組織的缺血性壞死或腦軟化。在我國，隨著社會發展及居民生活方式和飲食習慣的不斷改變，腦卒中已經成為目前我國人口死亡原因第二位的疾病，嚴重威脅居民健康。
目前根據循證醫學的證據，在積極干預高血壓、糖尿病、高膽固醇血病、腦血管狹隘等缺血性腦卒中的危險因素的同時，抗血小板聚集治療是有效防治腦梗死的基石，可顯著降低中風的復發率和死亡率。而氯吡格雷是繼阿司匹林之后一個重要的噻吩并吡啶類抗血小板藥物，對動脈粥樣硬化相關心腦血管疾病（如心肌梗塞、中風或血管性死亡等）具有良好的防治作用。氯吡格雷作為前體藥物，必須通過CPY450酶代謝，生成能抑制血小板聚集的活性代謝物。氯吡格雷的活性代謝產物選擇性的抑制二磷酸腺苷（ADP）與其血小板P2Y12受體的結合及繼發的ADP介導的糖蛋白GPIIb/IIIa復合物的活化，因此抑制血小板聚集。通過阻斷釋放的ADP誘導的血小板活化聚集途徑也可抑制除ADP以外的其他激動劑誘導的血小板聚集，達到良好的治療效果。
盡管服用氯吡格雷可以使大部分缺血性腦卒中患者獲得良好收益，但是近年來越多越多的研究發現，不同患者對其具有不同的藥物反應性。其中，據報道，約有4～30%患者服用氯吡格雷后未能達到充分抑制血小板聚集的作用，卻引發一系列不良后果，這種現象被稱為氯吡格雷抵抗。如何克服氯吡格雷抵抗成為廣大臨床醫生和研究者熱切關注的問題。眾多遺傳因素，如代謝酶、轉運體、核受體基因多態性被認為與其具有緊密關聯。單核苷酸多態性（SNP）被認為賦予了個體不同的表型性狀，以及對于環境暴露、藥物治療等因素的不同反應性。因此如果患者在一些重要的相關調控基因上具有不同的SNP型，則會導致不同患者對氯吡格雷的治療具有不同的反應性，因此相關SNP可能是氯吡格雷抵抗的關鍵因素。通過篩查氯吡格雷作用的相關的SNP譜，可以用來篩選氯吡格雷防治的受益人群。如果能夠通過相關的SNP組合確定哪些缺血性腦卒中患者適合服用氯吡格雷，哪些患者不適合氯吡格雷治療，就能夠在發病初期確定最佳的用藥方案，減少藥物濫用，達到良好的治療效果。然而，目前臨床上仍然缺少相關SNP用于指導合理用藥，是臨床上急需解決的問題。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是克服上述現有技術的缺陷和不足，提供一種與抗血小板藥氯吡格雷防治缺血性腦卒中相關的SNP位點，可用于采用抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中患者的臨床用藥指導，預防藥物抵抗，增強治療效果。具體是通過分離和研究服用抗血小板藥物氯吡格雷的缺血性腦卒中患者的外周血DNA中的SNP，尋找與氯吡格雷反應性差異高度相關的位點，并研制出可臨床或人群應用的氯吡格雷防治缺血性腦卒中的相關試劑盒，為缺血性腦卒中的防治藥物選擇提供指導。
本發明的目的是提供一種與抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中相關的SNP標志物。
本發明另一目的是提供上述標志物的特異性擴增引物和特異性延伸引物。
本發明的再一目的是提供上述標志物及其特異性擴增引物與特異性延伸引物在制備抗血小板藥物氯吡格雷防治缺血性腦卒中的輔助診斷試劑盒中的應用。
本發明的再一目的是提供用于缺血性腦卒中防治用藥指導的輔助診斷試劑盒。
本發明上述目的通過以下技術方案實現：
一種與抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中相關的SNP標志物，所述SNP標志物為 rs6686001、rs2302429、rs2242480、rs4244285和rs2046934的組合，其序列依次分別如SEQ ID NO.1～5所示。上述SNP標志物的特異性擴增引物為：
rs6686001特異性擴增引物的上游引物和下游引物序列分別如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7示；
rs2302429特異性擴增引物的上游引物和下游引物序列分別如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
rs2242480特異性擴增引物的上游引物和下游引物序列分別如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；
rs4244285特異性擴增引物的上游引物和下游引物序列分別如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；
rs2046934特異性擴增引物的上游引物和下游引物序列分別如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示。
上述SNP標志物的特異性延伸引物為：
rs6686001的特異性延伸引物序列如SEQ ID NO.8所示；
rs2302429的特異性延伸引物序列如SEQ ID NO.11所示；
rs2242480的特異性延伸引物序列如SEQ ID NO.14所示；
rs4244285的特異性延伸引物序列如SEQ ID NO.17所示；
rs2046934的特異性延伸引物序列如SEQ ID NO.20所示。
本發明篩選的上述SNP位點，與抗血小板藥氯吡格雷防治缺血性腦卒中相關，可用于采用抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中患者的臨床用藥指導，預防藥物抵抗，增強治療效果。具體是通過分離和研究服用抗血小板藥物氯吡格雷的缺血性腦卒中患者的外周血DNA中的SNP，尋找與氯吡格雷反應性差異高度相關的位點，并研制出可臨床或人群應用的氯吡格雷防治缺血性腦卒中的相關試劑盒，為缺血性腦卒中的防治藥物選擇提供指導。
因此，以下所述應用在都應在本發明的保護范圍之內：
所述SNP標志物在制備與抗血小板藥物氯吡格雷防治缺血性腦卒中相關的輔助診斷試劑盒中的應用。
所述特異性擴增引物和/或所述特異性延伸引物在制備與抗血小板藥物氯吡格雷防治缺血性腦卒中相關的輔助診斷試劑盒中的應用。
所述SNP標志物及其特異性擴增引物和/或特異性延伸引物在制備指導治療缺血性腦卒的用藥方案的制劑或試劑盒方面的應用。
一種與氯吡格雷防治缺血性腦卒中相關的輔助診斷試劑盒，該試劑盒中含有檢測外周血DNA中rs6686001、rs2302429、rs2242480、rs4244285和rs2046934的組分。該試劑盒用于檢測定外周血DNA中rs6686001、rs2302429、rs2242480、rs4244285和rs2046934的SNP標志物組合。
進一步地，所述組分包括權利要求2所述特異性擴增引物和/或權利要求3所述特異性延伸引物。
更進一步，優選地，所述組分還包括基因檢測所需的試劑。
優選地，所述基因檢測所需的試劑包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、去離子水、標準品和/或對照品等。
本發明人以標準操作程序采集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口學資料、臨床資料等，采用光比濁法檢測ADP誘導的血小板聚集率來判定患者是否發生氯吡格雷抵抗，采用Sequenom MassARRAY基因分型進行單個位點的檢測等。具體地，本發明解決問題的技術方案包括：
（1）建立統一標準的標本庫和數據庫以標準操作程序（SOP）采集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口學資料和臨床資料。
（2）基因型檢測：選擇缺血性腦卒中患者將其分為氯吡格雷抵抗組和氯吡格雷非抵抗組，在與氯吡格雷相關通路范圍內找出與防治缺血性腦卒中相關的陽性SNP位點。
（3）氯吡格雷防治缺血性腦卒中的輔助診斷試劑盒的研制：將腦卒中患者根據是否發生氯吡格雷抵抗進行分層，根據檢測出的氯吡格雷相關SNP基因型分布頻率，找出層間具有顯著差異的SNP，開發輔助診斷試劑盒。
本發明選擇了313例缺血性腦卒中患者，其中抵抗組106例，非抵抗組207例。將這兩組人群經進行檢測后獲得相關結果。
根據Sequenom MassARRAY的檢測，本發明人檢測并比較得到了在氯吡格雷抵抗組和非抵抗組之間基因型分布頻率在測層間存在明顯差異的SNP包括rs6686001，rs2302429，rs2242480，rs4244285，rs2046934。
單因素和多因素回歸分析結果均表明，這5個SNP與缺血性腦卒中患者的氯吡格雷抵抗現象存在著顯著關聯。
進一步分析這5個SNP的組合用于氯吡格雷治療缺血性腦卒中輔助診斷的效果，發現其組合能夠很好的區分氯吡格雷抵抗和氯吡格雷有效的缺血性腦卒中人群。
根據上述實驗結果，本發明人制備了一種能用于氯吡格雷防治缺血性腦卒中的輔助診斷的試劑盒，包含測定受試者血DNA標本中上述SNP的特異性引物、特異性熒光探針對和其他檢測試劑。
具體而言，這5個SNP的組合，或者這5個SNP的特異性引物及特異性熒光探針對的組合構成的相關診斷試劑盒有助于氯吡格雷治療缺血性腦卒中的輔助診斷，為臨床醫生快速準確掌握患者的自身狀況，采取更具個性化的防治方案提供支持。
另外，本發明還提供了一種抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中患者的臨床用藥指導方法，是對每個SNP的基因型進行評分，以野生純合型=“0”，其它=“1”，根據如下公式計算危險分值：
危險分值=（0.749 × rs6686001評分）+（0.810 × rs2302429評分）-（0.543 × rs2242480評分）+（0.671 × rs4244285評分）-（0.714 × rs2046934評分）；
根據危險分值來評估受試者是否適合服用氯吡格雷進行缺血性腦卒中的防治；cutoff值為0.2275，危險分值小于0.2275為氯吡格雷抵抗的低風險人群，可以服用氯吡格雷防治缺血性腦卒中；而危險分值大于0.2275為氯吡格雷抵抗的高風險人群，不宜服用氯吡格雷防治缺血性腦卒中。
本發明具有以下有益效果：
本發明提供的標志物序列改變作為氯吡格雷治療缺血性卒中的輔助判斷的標志物的優越性在于：
（1）SNP標志物是一種新型基因生物標志物，穩定、微創、易于檢測，在疾病初期就可檢出結果，可以有效提高疾病診斷及治療相關的敏感性和特異性，該類生物標志物的成功開發將為缺血性腦卒中患者的診斷和治療開創全新局面，為其他疾病生物標志物的研制提供借鑒。
（2）采用科學系統的評價體系，本發明人應用Sequenom MassARRAY基因分型方法以獲取疾病候選基因相關的SNP組合，以上方法保證了SNP生物標志物和診斷試劑盒在臨床上的應用。
（3）本發明獲得的與缺血性腦卒中患者的氯吡格雷抵抗現象相關的SNP標志物和特異性引物，并進行了相關輔助診斷試劑盒的研制。根據檢測情況，與臨床的氯吡格雷抵抗現象關聯分析，綜合考慮了每個SNP與氯吡格雷抵抗的正、負關聯情況和聯系強度，通過危險分值來評估受試者是否適合服用氯吡格雷進行結缺血性卒中的預防和治療，對于具有高抵抗風險的患者采取替代藥物（如替格瑞洛，阿司匹林等），指導臨床用藥，提高藥物療效。
附圖說明
圖1是缺血性腦卒中患者發生氯吡格雷抵抗的ROC曲線圖。
具體實施方式
以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。
除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
實施例1 研究樣本的選擇收集和樣品資料的整理
1、樣本選擇
（1）年齡 40～80歲，性別不限；
（2）符合全國第四屆腦血管病會議修訂的診斷標準，并經CT或MRI證實；
（3）以75mg/天（含首次以300mg負荷劑量服用）口服氯吡格雷5天以上 （含5天）。
2、發明人共選擇了313例符合標準的樣本進行單個Sequenom MassARRAY基因分型的實驗樣品，并系統采集了這些樣本的人口學資料和臨床資料等情況。
實施例2 樣品的血小板聚集率的檢測——氯吡格雷抵抗的判定
1、采用光比濁法進行血小板聚集試驗。取EDTA抗凝全血（1：9）2.7 ml，以800rpm離心5min，提取富含血小板血漿，再以3000rpm離心15min，提取貧血小板血漿，血小板計數為10～20×109/L，用PPP 調整 PRP至200～300×109/L，以PPP作空白對照，37℃預熱3min，以10μM ADP為誘導劑，光比濁法測定患者的血小板聚集率。
2、測定缺血性腦卒中患者服服用氯吡格雷前（day0）和服用氯 吡格雷后（day5）血小板聚集率。若服藥后血小板抑制率小于 10% 或 服用后血聚值 >50%，則認為發生氯吡格雷抵抗；按照此標準將納入患者分為氯吡格雷抵抗組和非抵抗組。
3、通過臨床檢測患者服用氯吡格雷前后的血小板聚集率的變化，得出有106例病人存在氯吡格雷抵抗現象，207例病人不抵抗。
實施例3外周血DNA中SNP標志物的分型掃描
在上述符合條件的313例缺血性腦卒中患者（其中抵抗組106例，非抵抗組207例）經Sequenom MassARRAY分型檢測獲得相關結果。具體步驟為：
1、酚-氯仿法提取外周血基因組DNA
（1）取 EDTA 抗凝全血 100 μl，加無菌雙蒸水 200 μl 混勻；
（2）加入 6 M 碘化鈉 200 μl，混勻；
（3）加入氯仿/異戊醇（24：1，v/v）400 μl，反復混勻，靜置 10 min； 12000 rpm 離心 10 min，吸取上層清液置另一離心管；
（4）向上清液加入異丙醇 300 μl 混勻，靜置 3 min，12000 rpm 離心 10 min， 棄上清；
（5）加入預冷的 70% 乙醇 500 μl，靜置 3 min，12000 rpm 離心 3 min，棄 去乙醇；
（6）重復步驟（5）一次，倒置片刻；
（7）樣品放入真空干燥器至完全干燥后，加入TE緩沖液 40 μl 重懸 DNA， 待 DNA 充分溶解后，進行純度和濃度的測定，以- 20℃條件保存。
通常能得到50～100ng/μl DNA，純度(紫外260D與280D比值)在1.6～2.0。
2、DNA 濃度及純度測定
（1）取樣品20 μl，加超純水至600 μl，充分混勻，用紫外分光光度計測定波長分 別為260 nm、280 nm、320 nm 時的OD值，計算DNA的濃度和純度。
（2）DNA濃度(μg/ml)= (OD260－OD320)×50μg/ml×稀釋倍數（稀釋30倍）
（3）DNA 純度= (OD260－OD320) / (OD280－OD320)
標準 DNA 純度比值為1.8；比值>1.9，表明有RNA污染；比值< 1.6，表 明有蛋白質等污染，可用氯仿/異戊醇再次抽提純化。本次所用DNA全部合格。
實施例4 SNP的Sequenom MassARRAY基因分型：
1、取受試者樣本，設計特異性引物，PCR反應和SNP測定，檢測并比較氯吡格雷抵抗組和非抵抗組的缺血性腦卒中患者不同基因型的分布差異。
具體方法如下：
（1）引物設計：
登錄 Sequenom 網站，利用在線 Assay Design Suite 設計 Sequenom IPLEX 引（https://seqpws1.sequenom.com/AssayDesignerSuite.html#design:new = Genotyping）
（2）PCR 反應體系:
DNA陣列質譜基因分型PCR體系為7 μL，其中包括DNA 2 μL，去離子水3.3 μL，10×PCR Buffer with 20 mM MgCl2 0.5 μL，25 mM MgCl2 0.4 μL，25 mM dNTP Mix 0.1 μL，1 μM Primer Mix 0.5 μL，5 U/μL PCR Enzyme 0.2 μL。
（3）PCR反應條件如表1：
表1 PCR反應條件
（4）SAP反應體系：SAP反應體系為9 μL，其中包括7 μL PCR產物，去離子水1.53 μL，SAP buffer 0.17 μL，SAP enzyme 0.3 μL。
（5）SAP反應條件如表2：
表2 SAP反應條件
（6）延伸反應體系延伸反應體系為11 μL，其中包括9 μL SAP產物，去離子水0.619 μL，iPLEX buffer 0.2 μL，iPLEX termination mix 0.2 μL，Extension primer mix 0.94 μL，iPLEX enzyme 0.041 μL。
（7）延伸反應條件如表3：
表3 延伸反應條件
（8）芯片點樣及數據獲取：用15mg CLEAN 樹脂為樣本除鹽后，應用MassARRAY RS1000 將反應液轉移到96-pad Spectro CHIP上，使用MassARRAY Typer工作站進行打譜操作，通過Typer 4軟件獲取數據及圖譜。
2、數據處理和分析：
利用logistic回歸模型比較在氯吡格雷抵抵抗組和非抵抗組中目標基因頻率的分布差異，篩選出存在顯著性差異的5個陽性關聯SNP。具體5個SNP標志物及其擴增引物序列見表4和表5。
表4 5個SNP標志物序列
表5 SNP標志物的擴增引物序列
注：F：Fowward Primer，上游引物序列；R：Reverse Primer，下游引物序列；E：Extended Primer，延伸引物序列。
實施例5 利用危險度評分方法分析SNP與氯吡格雷抵抗的關系
1、根據上述結果，本發明人通過對抵抗組和非抵抗組樣品進行基因型分布頻率的比較，最終選擇出5個陽性關聯的，以單個回歸系數為權重，進一步求得危險分值，繪制ROC來評價診斷的靈敏性和特異性，進而分析這些對服用抗血小板藥物氯吡格雷發生抵抗的情況進行診斷。對5個標志物的聯合分析發現，這5個SNP以70.9%的AUC將適合服用氯吡格雷和不適合服用氯吡格雷的腦卒中患者分開（如圖1所示）。
2、因此，本發明人證明了采用rs6686001， rs2302429， rs2242480， rs4244285， rs2046934的組合能夠很好地區分適合服用氯吡格雷和不適合服用氯吡格雷的人群。
也就是說，這5個SNP的組合區分出的適合服用氯吡格雷的人群適合用這類藥物進行預防或者治療，區分出的不適合服用氯吡格雷的人群則建議更換其他抗血小板藥物（如替格瑞洛，阿司匹林等）進行防治。
實施例6
運用卡方檢驗用于分類變量或者t檢驗用于連續性變量比較人口學特征等在研究對象組間分布的差異。用logistic回歸分析模型進行關聯分析。
為了進一步研究這5個SNP構成的綜合指征用于評價輔助診斷的效果，我們構建了一個數學模型，綜合考慮每個SNP與氯吡格雷抵抗發生的聯系強度。具體來說，我們對每個SNP的基因型進行評分，以野生純合型=“0”，其它=“1”，以單個SNP分析時的logistic回歸系數為權重，綜合考慮每個SNP的情況給每個研究對象確定一個危險分值。
危險分值的計算方法如下：
危險分值=（0.749 × rs6686001評分）+（0.810 × rs2302429評分）-（0.543 × rs2242480評分）+（0.671 × rs4244285評分）-（0.714 × rs2046934評分）。
獲得的危險分值系數以及界限值被直接應用于關聯研究的313例樣本中。根據危險分值來評估受試者是否適合服用氯吡格雷進行缺血性腦卒中的防治，cutoff值為0.2275，并據此估算風險，評估危險分值為小于0.2275為氯吡格雷抵抗的低風險人群，可以服用氯吡格雷防治中風。而危險分值大于0.2275為氯吡格雷抵抗的高風險人群，建議換用其它藥物治療。
表6 病例組與對照組關聯分析結果
統計學分析均通過專門的統計學分析軟件（SPSS 21.0）完成工。統計學顯著性水平P值設為0.05，所有統計學檢驗均為雙側檢驗。
實施例7吡格雷防治缺血性腦卒中相關的輔助診斷試劑盒的制作
1、試劑盒的制作和操作流程是基于Sequenom MassARRAY基因分型技術。
Sequenom MassARRAY對候選基因通路上單個檢測后，在是否發生氯吡格雷抵抗這一因素下，確定缺血性腦卒中患者基因型分布頻率層間具有顯著差異的，以此作為氯吡格雷防治缺血性腦卒中輔助診斷的指標。最后篩選出的與非氯吡格雷防治缺血性腦卒中輔助診斷相關的SNP（rs6686001，rs2302429，rs2242480，rs4244285，rs2046934）組成相應試劑盒。
試劑盒含有一批SNP特異性引物包括下列引物的引物序列（rs6686001的引物序列為SEQ ID NO.1-3，rs2302429的引物序列為SEQ ID NO.4-6，rs2242480的引物序列為SEQ ID NO.7-9，rs4244285的引物序列為SEQ ID NO.10-12，rs2046934的引物序列為SEQ ID NO.13-15）。
試劑盒還可以含有相應技術所需的常用試劑，如：dNTPs，MgCl2，雙蒸水，Taq酶等，以及用于確定基因型的標準品和空白對照等。
2、此試劑盒的價值在于只需要外周血而不需要其它組織樣品，通過最精簡和特異的引物檢測SNP，再通過SNP譜指導缺血性腦卒中患者中氯吡格雷的使用，不僅穩定，檢測方便，且精確，可以輔助提高藥物治療的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實踐，可以幫助指導診斷和更有效的個體化治療。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大學，廣州中大南沙科技創新產業園有限公司
<120> 一種與抗血小板藥物氯吡格雷治療缺血性腦卒中相關的SNP標志物及其應用
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<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<213> rs2046934下游引物
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acgttggatg gaatcaattt cacttatctc 30
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> rs2046934延伸引物
<400> 20
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