本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種能夠高效表達造紙用甾醇脂酶的基因、表達載體、菌株及其應用。

背景技術：

造紙工業是支撐我國國民經濟的重要產業之一，但是資源匱乏、能源短缺和污染嚴重等問題正制約造紙工業的發展，擴大廢紙利用正是解決這些問題的有效途徑。但是廢紙因其成分復雜，含有大量的細小組分和陰離子雜質，在這些雜質中尤其是膠黏物很難除去，一方面膠黏物的存在會增加紙張上的孔洞、塵埃點，降低紙張質量；另一方面，其在成形網、壓榨部以及干燥部沉積易引起斷紙，導致濾水性能變差，紙機的車速減低，因而膠黏物的處理也是廢紙制漿中的重大課題。

在廢紙制漿中，膠黏物的來源比較復雜，主要有以下幾個來源：(1)天然樹脂。在廢紙漿中主要是一些殘余脫墨劑；(2)熱融物。一部分來源于用于封裝紙箱、紙袋和書本雜質的膠黏劑，另一部分來源于某些具有特殊用途紙品中的防水、防油劑，如蠟和蠟質化合物；(3)壓敏膠黏劑。來源于各種包裝用標簽和自封袋；(4)涂布粘合劑。來源于加工紙生產過程中所使用的各種涂布黏合劑；(5)施膠劑。來源于各種施膠紙；(6)油墨聯接料和殘余油墨；(7)無機填料和細小纖維。

目前，去除和控制漿料中膠黏物的方法主要有機械法和化學法。篩選、凈化、洗滌、熱分散和浮選等物理機械法能去除大部分原生膠黏物。而化學法主要是通過化學吸附、改性、分散、固定、表面鈍化等作用來達到控制膠黏物的目的。隨著生物技術的發展，具有高效性、專一性、對環境無污染性等優點的生物酶在制漿造紙領域中得到了越來越廣泛的應用。生物酶控制紙漿中膠黏物也成為一個新的研究方向。大多數膠黏物都含有大量能將膠黏物的基本結構組分連接在一起的酯鍵，酯類酶能催化酯鍵斷裂，把膠黏物分解成較小的基本組分。而且酯鍵一旦斷裂，膠黏物的基本組分就很難在系統中重新聚合。

巴克曼實驗室化工(上海)有限公司創造了用于解決二次纖維中膠黏物問題的最新技術—生物酶Optimyze。該酯類酶制劑能使膠黏物中的酯鍵斷裂，不僅將大膠黏物分解為微小膠黏物，而且使膠黏物的基本組分失去或降低黏性，使微小膠黏物很難在系統中重新聚合，從根本上解決了利用二次纖維的造紙過程由于膠黏物而引起的一系列問題。

采用生物酶法是近年來處理廢紙漿膠黏物研究的熱點。油墨中一般含有天然或合成的樹脂成分，使顏料和紙頁結合。因此可以利用酯類酶來部分水解油墨中所含有的樹脂或粘結劑，碎解油墨，使其與纖維分離。處理過程中主要是以分解油墨與纖維表面的連接料的方式釋放出油墨粒子，對纖維強度和紙漿得率的影響較小，同時對去除廢紙漿中其他黏性物質也有一定的效果。

技術實現要素：

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種能夠高效表達造紙用甾醇脂酶的基因。該基因能夠編碼耐高溫、耐堿、高效穩定的甾醇脂酶。

本發明的另一目的在于提供一種表達載體。

本發明的另一目的在于提供一種生產菌株。

本發明的另一目的在于提供一種重組甾醇脂酶。

本發明的再一目的在于提供上述重組甾醇脂酶的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種能夠高效表達造紙用甾醇脂酶的基因，所述的甾醇脂酶CHE的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO：1所示。

M.Nishimura等在1994年首次克隆了淡紫鏈霉菌(Streptomyces lavendulae H646-SY2)的甾醇脂酶(CHE)基因，Hongyu Xiang等在2006年將其在大腸桿菌中成功表達并研究了其主要的酶學性質，發現該甾醇脂酶具有耐熱性、耐弱堿性，可能具有應用于造紙工業的理想特性。但此后并沒有看到關于該酶應用于生產的報道。其原因可能在于，其一，在原始菌株的表達量低；其二，盡管Gashaw Mamo等將其基因在大腸桿菌中表達，但表達的酶活相對較低，分泌的酶活不足0.05U/mL，該酶不能完全分泌，有部分分布在在胞內及周質空間而且表達量不高，因而限制了其作為造紙工業用酶制劑的進一步開發。

本發明采用密碼子優化、基因全合成等方法，實現對CHE(淡紫鏈霉菌的甾醇脂酶)基因的分子改造和人工組建，得到一種能夠高效表達甾醇脂酶的基因。發明人根據美國國立生物技術信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的CHE基因序列，對序列進行優化，替換成畢赤酵母偏好的密碼子，再將優化后的基因序列用DNAWORKS軟件(http://mcl1.ncifcrf.gov/lukowski.html)，設計全基因合成的引物，設計了2條引物來合成CHE基因序列，得到的甾醇脂酶基因的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO：1所示。

本發明提供一種攜帶上述CHE基因的表達載體；

所述的表達載體是適用于畢赤酵母中表達的載體。

所述的表達載體是將上述CHE基因插入至pPICZαA中。

所述的表達載體是將上述CHE基因插入至pPICZαA中EcoRI和NotI酶切位點之間；命名為pPICZαA-CHE。

通過在商用畢赤酵母分泌表達載體pPICZαA中連入CHE基因，構成重組質粒pPICZαA-CHE。

表達載體pPICZαA-CHE可以通過以下技術措施實現：

采用第一個發明目的所述方法全基因合成CHE時，在上游和下游已分別引入了限制性內切酶EcoRI和NotI酶切位點。因此將全基因PCR產物和畢赤酵母分泌表達載體pPICZαA質粒(invitrogen)都用EcoRI和NotI雙酶切，體外連接構建重組質粒pPICZαA-CHE，得到重組表達載體pPICZαA-CHE。

本發明又提供一種含有上述CHE基因的畢赤酵母菌株；

所述的畢赤酵母菌株含有上述表達載體之一所述的表達載體。

畢赤酵母是甲醇營養型酵母中的一類酵母菌，可以利用甲醇作為唯一碳源和能源。作為真核表達系統，具有許多其它蛋白表達系統所不具備的優點：具有強有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因啟動子，可嚴格調控外源蛋白的表達；酵母生長繁殖速度快、營養要求低、培養基廉價；外源基因能通過質粒整合到巴斯德畢赤酵母基因組上，外源基因不會發生隨生長繁殖而丟失；表達量高，許多蛋白可達到每升克級以上；同時，畢赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于純化。

畢赤酵母基因工程菌株Pichia Pastoris X33/pPICZαA-CHE可以通過以下技術措施實現：以LiCl法將Sac I線性化的重組質粒pPICZαA-CHE轉化畢赤巴斯德酵母宿主菌Pichia Pastoris X33，轉化物涂布于MD平板，培養2～3天。將MD平板上的轉化子分別接種于含不同濃度的Zeocin(博萊霉素)抗性YPD平板上，培養3～5天。將高濃度Zeocin-YPD平板上出現的轉化子挑取其對應的單克隆，按Invitrogen操作指南提取酵母基因組DNA作為模板，進行酵母基因組PCR鑒定，獲得重組轉化子。

在超凈工作臺內挑取經重組畢赤酵母菌落PCR鑒定為陽性的轉化子接種至25mL BMGY液體培養基中(250mL錐形瓶裝液量為25mL)，30℃、250rpm振蕩培養至OD600＝2～6，同時接種重組畢赤酵母X33/pPICZαA作為陰性對照；收集部分培養液在室溫8000rpm離心2min；轉移菌體至25mL BMMY培養基中(250mL錐形瓶裝液量為25mL)，控制起始OD600＝1，30℃、250rpm震蕩培養，每24h取樣分析菌體生長情況及產酶情況，并補加1％甲醇至培養基以持續誘導菌體產酶，發酵120～140h后結束，發酵液中甾醇脂酶酶活為0.4U/mL左右。

一種重組甾醇脂酶，是將上述畢赤酵母菌株進行發酵得到。所述的重組甾醇脂酶的酶活為0.4U/mL。

所述的基因、表達載體、畢赤酵母菌株、重組甾醇脂酶在廢紙脫墨中的應用。

本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：

本發明提供的甾醇脂酶基因利用密碼子優化、大腸桿菌表達、畢赤酵母表達等技術實現在畢赤酵母中的高表達；表達的甾醇脂酶具有耐高溫、耐弱堿性質；本發明所述的甾醇脂酶可應用于廢紙脫墨，通過水解廢紙表面和紙張之間的膠黏物來去除油墨粒子，可以保證再生紙質量的穩定與紙機的運行效率。

附圖說明

圖1是構建pPICZαA-CHE載體示意圖。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。

本發明的具體實驗方法可以參照分子克隆實驗指南(第三版，冷泉港出版社出版)以及Pichia Fermentation Process Guidelines(Invitrogen)。

以下實施例中除特別說明外，均為本領域內的常規實驗方法和操作步驟。

實施例1合成甾醇脂酶基因(CHE)

淡紫鏈霉菌(S.lavendulae H646-SY2)的甾醇脂酶(CHE)基因序列及蛋白結構信息來源于美國國立生物技術信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和蛋白數據庫(PDB，http://www.rcsb.org/pdb/search/advSearch.do)。

根據NCBI上公布的CHE基因序列，對序列進行優化，全部替換成畢赤酵母偏好的密碼子，再將優化后的基因序列用DNAWORKS軟件(http://mcl1.ncifcrf.gov/lukowski.html)，設計全基因合成的引物，設計了2條引物，其中2條引物分別引入了EcoRI和NotI酶切位點以及酶切保護堿基，引物序列為：

CHE-F：5′-CCGGAATTCATGTCCTCCCAAGTT-3′；(橫線部分為EcoRI酶切位點)

CHE-R：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTAATGG-3′；(橫線部分為NotI酶切位點)

在25μL發應體系中進行PCR擴增，反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸10min，共30個循環；第30個循環72℃延伸10min，PCR產物用凝膠電泳鑒定后存于-20℃備用。

實施例2制備含CHE基因的質粒

將實施例1得到的PCR產物電泳，切膠回收約700bp處的目的條帶，回收產物經EcoRI和NotI雙酶切處理，與同樣經EcoRI和NotI雙酶切、膠回收的表達載體pPICZαA用T4DNA連接酶連接。10μL體積反應體系如下：pPICZαA 1μL(50ng)，加入全合成基因產物6μL，含ATP的10×Buffer 1μL，T4DNA連接酶1μL，用ddH₂O補足至10μL。稍加離心，16℃水浴連接過夜，并轉化E.coli Top10(invitrogen)中，在含有Zeocin(博萊霉素，25μg/mL)的LB平板上篩選陽性轉化子。隨機挑取一定量的轉化子，小量制備質粒，經限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切處理后，進行電泳分析。成功連接目的基因的質粒經酶切后，預計可得到700bp，和3.5kb兩個片段，質粒酶切鑒定正確。將重組質粒測序，證實甾醇脂酶CHE基因編碼框完全正確。將重組質粒命名為pPICZαA-CHE重組質粒。pPICZαA-CHE載體的構建示意圖如圖1所示。

實施例3甾醇脂酶CHE在畢赤酵母中的高效表達

通過LiCl法將經SacⅠ酶線性化完全的實施例2的pPICZαA-CHE轉化Pichia pastoris X33(invitrogen)。轉化物涂布MD平板，30℃培養2天。將MD平板上的轉化子分別接種于含Zeocin 100μg/mL，200μg/mL，300μg/mL，400μg/mL，500μg/mL的YPD平板上，30℃培養3天。將較高濃度Zeocin-YPD平板上出現的轉化子挑取單克隆。按Invitrogen操作指南提取酵母基因組DNA作為模板，利用目的基因序列的PCR引物進行酵母基因組PCR鑒定，總反應體積為20μL，Taq酶量為2U，取2μL PCR產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

PCR擴增產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，擴增出預期大小為700bp的目的條帶。

在超凈工作臺內挑取經重組畢赤酵母菌落PCR鑒定為陽性的轉化子接種至25mL BMGY液體培養基中(250mL錐形瓶裝液量為25mL)，30℃、250rpm振蕩培養至OD600＝2～6，同時接種重組畢赤酵母X33/pPICZαA作為陰性對照；收集部分培養液在室溫8000rpm離心2min；轉移菌體至25mL BMMY培養基中(250mL錐形瓶裝液量為25mL)，控制起始OD600＝1，30℃、250rpm震蕩培養，每24h取樣分析菌體生長情況及產酶情況，并補加1％甲醇至培養基以持續誘導菌體產酶，發酵120～140h后結束，發酵液中甾醇脂酶酶活為0.4U/mL左右。

酶活的測定原理：甾醇脂酶在一定溫度與pH條件下，水解對硝基苯酚辛酸酯底物，然后高速離心，終止酶反應，并使未水解的對硝基苯酚丁酸酯沉降，反應液對紫外光有吸收，可用酶標儀測定405nm波長下的吸光值，再根據標準曲線計算酶活力。

酶活的測定方法：

(1)配制對硝基苯酚丁酸酯底物反應液：0.523g對硝基苯酚丁酸酯，0.25mL Trion X-100，100mL超純水。高速均漿乳化5min。以每管1mL的量分裝到2mL EP管中。-20℃避光保存。

(2)取900μL的磷酸緩沖液于2mL EP管中，加入50μL發酵上清液。50℃，800rpm保持5min。

(3)加入50μL底物反應液，5℃，800rpm反應15min。以滅活上清液為對照。

(4)反應結束后立即進行10000rpm，1min離心終止反應。

(5)取200μL反應液于酶標板中，每個樣品設置3個平行樣，用酶標儀測OD600。

酶活力的定義為：在50℃、pH8.0的條件下，每分鐘分解底物產生1μmol對硝基苯酚為一個酶活單位。

實施例4CHE甾醇脂酶的酶學性質

本實施例采用的CHE甾醇脂酶為實施例3的發酵后上清液。

1、CHE甾醇脂酶的最適pH值和最適溫度

分別取900μL pH 8.0的緩沖液加入1.5mL離心管中，加入純化后的發酵上清液50μL后30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃預熱5min，加入50μL底物p-NPC(對硝基苯酚辛酸酯)反應5min，使用多功能酶標儀測量相對酶活。在pH8.0下，最適作用溫度為50℃。在45℃～55℃范圍內，酶活均能維持在75％以上的，即使pH9.0條件，溫度為60℃時，相對酶活仍保持在60％以上。

分別取900μL pH 6.0～pH 11.0的緩沖液加入1.5mL離心管中，加入純化后的發酵上清液50μL后50℃預熱5min，加入50μL底物p-NPC(對硝基苯酚辛酸酯)反應5min，使用多功能酶標儀測量相對酶活。CHE甾醇脂酶最適作用pH值為8.0，pH7.0～9.0范圍內相對酶活維持在70％以上；當pH＜5.0或＞10.0后，CHE甾醇脂酶的酶活降到30％以下。

2、CHE甾醇脂酶的耐熱性及耐堿性

為了考察該重組酶的溫度穩定性，將純化后的脂肪酶分別在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃水浴中保溫1小時后，在pH 9.0，溫度50℃條件下測量剩余的酶活力。CHE甾醇脂酶在45℃、50℃及55℃保溫1h后，甾醇脂酶活性都可以維持在80％以上；50℃及45℃時、CHE半衰期為6h以上(6h時，活力仍保留60％)，55℃條件下，CHE半衰期長達2.5h(3h時，酶活力保持在40％)。

CHE甾醇脂酶分別在pH5.0～pH11.0的緩沖液中50℃處理12h后，然后在最適溫度50℃和最適pH8.0條件下測定相對酶活變化。經上述處理后，相對酶活均能維持50％以上，而pH7.0～pH9.0時，相對酶活為最大酶活80％以上，CHE甾醇脂酶適合在弱堿性條件下作用。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南理工大學

<120> 一種造紙用甾醇脂酶的基因、表達載體、菌株及其應用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 684

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 甾醇脂酶CHE的核苷酸編碼序列

<400> 1

atgtcctccc aagttcgggg aggtactaga tggaagagat ttgctttggt tatggttcct 60

tctattgctg ctactgctgc tgttggagtt ggtttggctc aaggggcttt ggctgcttcc 120

ttttccgtta gtggtcaaga ttttaaggtt tccgctgata agttggatgg agataacttg 180

attcaatacg gaggtattgc tgaaggtcat gatttgaagg gaaacgctca acatcatcca 240

gttactattt caggtttttc tcatgctgaa attactaata tgtgtcaatc cttggttact 300

ccaactccat tgggtaacat tactttgcaa ttgagaactg gtcataaggg aaagccagct 360

gttgctgata acatctactt ggatgttgct gaattggata ctgatgctga gtttaagaac 420

ttggatattg gtgttgctgt tggagaccct aaccataaga ctaagccaca agctggaact 480

gttgcttctc catacgcttt ttcacaacgt gctcatcaag ataaggctta cttgattttg 540

actaacgtta gacaaaaggc ttgggctact actagggctc attttcaaaa gggaactttt 600

aagttgccag atttgaagtt gagattgttg ggtggagatc aaagacattt tgatcaacca 660

tgttaccaag atattaagga ttaa 684

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CHE-F

<400> 2

ccggaattca tgtcctccca agtt 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CHE-R

<400> 3

ataagaatgc ggccgcttaa tgg 23