本發明屬于植物分子生物學及基因工程領域，特別涉及一種參與丹參酮合成的2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶基因克隆鑒定及應用。

背景技術：

中藥丹參是鼠尾草屬唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根和根莖，是最常用的大宗藥材之一，具有活血祛瘀，通經止痛，清心除煩，涼血消癰等功效，在臨床治療心腦血管疾病有較高使用價值。丹參生態適應性較強，在華東、華北、西北、西南、中南等地區廣泛分布，現如今丹參野生資源大幅減少，主要來源于人工栽培品，于河北、江蘇、安徽、遼寧、陜西、山東、河南、山西、湖北、四川等地大量種植。丹參主要活性成分是脂溶性丹參酮類化合物和水溶性酚酸類化合物。丹參基原植物具有生命力強、世代周期短、基因組小、染色體數目少、組織培養和轉基因技術成熟等特點，被認為是中藥研究的理想模式生物。近來，丹參主要活性成分丹參酮的生源途徑正被逐步解析。由于丹參酮的高氧化活性，其生物合成途徑由一系列氧化酶參與，已報道多個CYP450s參與丹參酮的合成。2OGD超家族是植物基因組中的第二大基因家族，其功能主要涉及氧化和羥基化作用，如赤霉素、黃酮類等的合成，但是目前2OGDs是否參與丹參酮的生物合成仍然未知。

技術實現要素：

本發明目的在于探索2OGD家族成員在丹參酮合成中的功能，提供一種參與丹參酮生物合成的2OGD編碼基因及應用。

本發明目的可以通過以下技術方案來實現：一種基于丹參全基因組及不同丹參組織器官轉錄組差異表達分析的丹參酮合成途徑相關2OGD超家族基因成員2OGD-5的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述基因2OGD編碼蛋白質的氨基酸殘基序列如SEQ ID No.2。

一種含有2OGD-5編碼基因的正向和反向片段序列植物RNAi雙元表達載體。

本發明通過發根農桿菌侵染丹參葉片，獲得陽性2OGD-5-RNAi毛狀根，毛狀根經0.1mg/L IAA誘導大量側根生成。

本發明采用代謝組(LC-MS)技術鑒定2OGD-5-RNAi轉基因毛狀根的隱丹參酮和丹參酮IIA的含量與對照相比顯著降低。本發明提供的2OGD-5催化隱丹參酮和丹參酮IIA的生物合成，為丹參酮生物合成途徑的解析奠定基礎。

附圖說明

圖1所示為丹參基因組2OGD家族成員系統發育進化樹。

圖2所示為丹參2OGD家族成員編碼基因在丹參不同組織器官中的差異表達。

圖3所示為2OGD-5在丹參不同組織器官中的差異表達。

圖4所示為丹參2OGD-5編碼基因結構與及蛋白三維結構預測。

圖5所示為發根農桿菌ACCC10060介導的遺傳轉化獲得2OGD-5-RNAi的丹參毛狀根。

圖6所示為pK7GWIWG2D(II)-2OGD-5轉基因毛狀根的抑制作用圖。

圖7所示為UPLC分析不同轉基因毛狀根之間丹參酮含量差異。

圖8所示為LC-MS分析不同轉基因毛狀根之間丹參酮含量差異。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例1全基因組篩選丹參2OGD家族

1)基于丹參全基因組掃描2OG-FeII_Oxy結構域(PF03171)，篩選到丹參2OGD超家族成員132個，氨基酸序列長度分布從120aa到504aa。

2)采用MEGA比對及構建系統發育樹，丹參2OGD超家族被分為DOXB和DOXC兩個亞家族，其中DOXB包含14個2OGD成員，DOXC包含116個2OGD成員，如圖1所示。

3)收集丹參不同器官組織及處理的轉錄組測序數據，采用Tophat和Cufflinks軟件分析丹參2OGD成員在丹參不同器官組織及MeJA處理下的差異表達譜，如圖2所示。

4)根據丹參酮在丹參不同部位的合成及積累，篩選基因差異表達一致的丹參2OGD家族成員，其中2OGD-5在丹參根中特異表達且顯著受MeJA誘導，如圖3所示。

實施例2丹參2OGD-5編碼基因的克隆及結構分析

1)將實施例1中篩選出的2OGD-5序列比對設計全長引物，從丹參根的cDNA中進行PCR擴增，獲得長度為1089bp的核苷酸序列，如SEQ ID No.1。根據全長cDNA序列翻譯后推導出丹參2OGD-5的氨基酸序列，共362個氨基酸殘基，如SEQ ID No.2。

2)采用PyMOL軟件預測2OGD-5蛋白結構，參考擬南芥AtLDOX的蛋白三維結構模型(PDBID：1GP5)，如圖4所示。

實施例3丹參2OGD-5功能鑒定

1)Gateway引物設計及片段擴增。對2OGD-5基因設計186bp的RNAi片段引物(基因位置：304-489bp)，5’端添加attB1序列：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT，3’端添加attB2序列GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT。設計RNAi引物時為了避免設計的RNAi區域特異性差導致轉基因沉默靶點不單一，將每個基因的RNAi區域與基因組BLAST比對，選取特異性最好的RNAi區域，引物序列如下：

F-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCCTCGGAGACGATGGACG

R-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTCGTCGCTGAAGACGCAC

2)Gateway構建RNAi載體。BP反應：取25ng的attB PCR回收產物和75ng pDONR221入門載體，加水混勻至4μL，然后加入1μL的BPclonase II enzyme，混勻，25℃孵育1h，加入0.5μL的Proteinase K，37℃孵育10m，轉入DH5α感受態細胞，于50mg/L Kan抗性LB固體培養基上篩選陽性克隆，并PCR檢測；LR反應：取75ng的pDONR-RNAi和75ng pK7GWIWG2D(II)受體載體，加水混勻至4μL，然后加入1μL的LR clonase II enzyme，混勻，25℃孵育1h，加入0.5μL的Proteinase K，37℃孵育10m，轉入DH5α感受態細胞，于50mg/L Spec抗性LB固體培養基上篩選陽性克隆并送測，測序成功的陽性克隆提取重組質粒pK7GWIWG2D(II)-2OGD-5導入發根農桿菌ACCC10060。

3)農桿菌ACCC10060侵染丹參葉片(葉盤法)。設計對照實驗，分別選擇含重組質粒PK7GWIWG2D(II)和pK7GWIWG2D(II)-2OGD-5的發根農桿菌ACCC10060侵染丹參葉片。含有重組質粒的發根農桿菌接種于50mg/L Spec+50mg/L Rif的YEB培養基中，28℃搖床至OD600約為0.5；離心后，用等體積的MS液體培養基重懸沉淀(MS-plasmid)；將丹參無菌苗幼嫩葉片剪成0.5cm²的葉盤，MS固體培養基預培養2-3天；預培養的葉盤于MS-plasmid中浸泡10min，無菌紙吸干后，空白MS固體培養基于25℃黑暗共培養48-72h；共培養后的葉盤于含500mg/L Car(羧芐青霉素)的無菌水中清洗10min，轉入含500mg/L Car+50mg/L Kan的MS固體培養基中，25℃黑暗中篩選，每10天繼代一次；選擇長勢快的，抗性毛狀根，切下2-3cm編號并與含30mg/L Kan的MS固體培養基上培養；培養過程中選擇含30mg/L Kan+0.1mg/L IAA的MS固體培養基上刺激2-3d，隨后轉入不含IAA的30mg/L Kan的MS固體培養基上，待生長出大量側根后轉移至液體6，7-V培養基于120rpm 25℃黑暗中搖床培養；熒光顯微鏡下檢測GFP的表達，并擴大培養，如圖5所示。

實施例4丹參酮含量檢測

本發明采用UPLC及LC-MS技術對轉基因毛狀根的丹參酮含量進行檢測，主要采取以下步驟：1)丹參毛狀根烘干并用研缽研磨成粉，100mg粉末用0.5mL甲醇提取，對提取物超聲處理兩次，1,500g離心10min，上清經0.2μm聚四氟乙烯注射過濾器過濾，待檢測；2)UPLC條件，采用Waters ACQUITY UPLC BCH C18色譜柱，流動相：甲醇(A)-水(B)，75％A∶25％B洗脫10min，每個色譜過程完成后用100％的甲醇洗柱5min，然后初始比例75％A∶25％B平衡柱子5min；柱溫，30℃；流速，0.3mL/min；檢測波長，270nm；進樣量，5μL；3)LC-MS/MS條件：LC：Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM20A UPLC系統，色譜柱：WatersACQUITY UPLC HSS T3C18(1.8μm，2.1mm×100mm)，進樣量：5μL，流動相：A＝乙腈(0.04％乙酸)，B＝0.04％乙酸水溶液，線性梯度：5％-95％A(0-12min)，95％A(12-15min)，流速：0.4mL/min，柱溫：40℃；MS/MS：AB SCIEX QTRAP 4500，電噴霧離子化溫度：550℃，質譜電壓：5500V，反吹氣簾氣：25psi，碰撞誘導電離：高。獲得如下結果：2OGD-5-RNAi轉基因毛狀根的丹參新酮、隱丹參酮和丹參酮IIA的含量顯著降低，是對照的0.16、0.56和0.56倍；二氫丹參酮和丹參酮I的含量略微降低，如圖6、7所示。

本發明首次基于丹參全基因組篩選及克隆2OGD-5基因，驗證發現2OGD-5參與丹參酮的生物合成，為解析丹參酮生物合成途徑提供新思路，并為丹參酮體外合成生物學研究奠定基礎。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。