本發明屬于dna分子標記技術領域，具體涉及一種利用特異性引物對紫背浮萍sp6微衛星標記檢測的方法。
背景技術：
微衛星（microsatellites）或稱簡單重復序列（simplesequencerepeats,ssr）是指由1-6個核苷酸組成的簡單串聯重復dna序列，幾乎存在于迄今研究過的所有生物當中，并且分布密度很大。因微衛星廣泛分布于基因組中，具有密度大、多態性豐富、高度雜合且穩定性好、遵循孟德爾分離定律共顯性遺傳、易于pcr擴增等特點，已成為近年來廣泛應用的dna標記，常應用于生物資源的家系譜系認證、基因連鎖分析、遺傳圖譜構建、種質鑒定、種群遺傳多樣性等許多研究領域。
在自然環境中，紫背浮萍基本以無性生殖進行繁殖，當環境條件適宜時2天即可克隆出一代，種群遺傳多樣性水平較低。
現有技術提供多種衛星標記的檢測方法，例如，中國發明授權專利文獻一種銹斑蟳微衛星標記的快速檢測方法授權公告號cn103305611b該發明涉及一種銹斑蟳微衛星標記的快速檢測方法，包括：（1）銹斑蟳基因組dna的提?。唬?）根據genebank數據庫中銹斑蟳的功能基因序列，獲得含有微衛星重復的基因序列；（3）微衛星標記引物的設計；（4）銹斑蟳不同個體的基因組dna的pcr擴增；（5）pcr產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。該發明的檢測方法具有快速、準確、靈敏等優點，能夠直觀地檢測出銹斑蟳不同個體的基因型，從而快速獲得銹斑蟳在功能基因微衛星位點遺傳變異的多態性圖譜，該微衛星標記可應用于銹斑蟳遺傳變異與種群遺傳多樣性分析等領域，但微衛星標記檢測速度還有提升空間。
技術實現要素：
本發明針對上述技術問題提供一種紫背浮萍sp6微衛星dna標記的檢測方法，可快捷的獲得紫背浮萍sp6遺傳標記基因座呈現高度遺傳變異的多態性圖譜，方法迅速，所得結果可直觀地檢測出紫背浮萍在此位點的每個個體的基因型。
本發明針對上述技術問題所采取的方案為：利用特異性引物對紫背浮萍sp6微衛星標記檢測的方法，檢測方法如下：
1）材料預處理：采集紫背浮萍樣品，馴養，封裝，干燥，待用；
2）紫背浮萍基因組dna提?。篴在水浴鍋中預熱ctab提取液；b研磨樣品并轉入離心管中，加入提取液，保溫，顛倒混勻；c離心，取上清液；d加入酚/氯仿，混勻，離心，取上清液；e加入氯仿，混勻，離心，取上清液；f重復d、e1~2次；g加入異丙醇混勻，沉淀，離心，棄上清液；h將沉淀物用乙醇漂洗，離心，棄上清液；i重復h；j檢測，低溫保存，備用；
3）設計特異性引物：
微衛星點sp6特異性引物：f:gaaccttaatatgcgaccaag
r:caagaaagtcaaatacagcgg；
4）利用上述引物對紫背浮萍不同地理群內個體的基因組dna進行pcr擴增；
5）對prc產物初篩，加上樣緩沖液，變性后于變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分析，從而獲得紫背浮萍在sp6核心序列區高度遺傳變異的多態性圖譜。
可快捷的獲得紫背浮萍sp6遺傳標記基因座呈現高度遺傳變異的多態性圖譜，方法簡便，所得結果可直觀地檢測出紫背浮萍在此位點的每個個體的基因型。
步驟1中采集紫背浮萍樣品，馴養3~5天，通過人工馴養的方式使野生狀態下的紫背浮萍以無性繁殖的方式進行繁殖，獲得較多的樣品。
步驟2dna提取法為改良的ctab法，通過對ctab法進行改良，獲得的dna質量優異，提取過程中無明顯的dna降解。
步驟2中b在液氮中研磨樣品后轉入離心管中，加入提取液，60~68℃保溫30~60min，每隔10min輕輕顛倒混勻，使樣品充分溶解在提取液中，通過顛倒混勻提高提取效果。
步驟2中h將沉淀物用65~75%乙醇漂洗，離心，棄上清液，通過乙醇漂洗使核酸充分的分離出來。
步驟2中j提取產物取2~3μl用1.0~2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于‐10~-30℃保存備用，采用的凝膠電泳方法簡單、快速、靈敏的特點。
步驟2中a在60~70℃水浴鍋中預熱ctab提取液，ctab提取液由以下成分及重量份組成：ctab3~5份、1mtris-hcl18~22份、nacl14~18份、0.5medta6~10份、1,10-菲啰啉0.02~0.08份、2-巰基乙醇0.2~1份、edta鐵鈉0.03~0.06份、氯仿90~98份、異戊醇3~5份。通過預熱抑制dnase,加速蛋白變性,促進dna溶解，獲得優異的提取效果，dna質量優異，且提取速度較快。
步驟5中先將pcr產物進行瓊脂糖初篩，選擇有擴增的引物pcr產物加上樣緩沖液，92~95℃變性8~12min后于5~7%變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分析，采用的凝膠電泳方法簡單、快速、靈敏的特點。
步驟5中的上樣緩沖液由以下成分及重量份組成：二甲酚橙0.05~0.18份、檸檬黃0.1~0.25份、溴酚藍0.01~0.05份、二甲苯青ff0.05~0.18份、羧甲基淀粉鈉0.02~0.06份、丙三醇35~37份、番茄紅素0.01~0.02份、乙二胺四乙酸二鈉2.8~3.2份、烷醇酰胺0.04~0.08份、十二烷基硫酸鈉3~5份。可增加樣品密度，使其比重增加，以確保dna均勻沉入加樣孔內，速度更快，使樣品呈色，操作方便。
有益效果：本發明具有速度快、準確性和靈敏度高的優點，可快捷的獲得紫背浮萍sp6遺傳標記基因座呈現高度遺傳變異的多態性圖譜，方法簡便，所得結果可直觀地檢測出紫背浮萍在此位點的每個個體的基因型。
附圖說明
圖1為sp6微衛星標記pcr產物聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳成像。
具體實施例
以下結合附圖與實施例作進一步詳細描述：
實施例1：
如圖1所示，利用特異性引物對紫背浮萍sp6微衛星標記檢測的方法，檢測方法如下：
1）材料預處理：采集紫背浮萍樣品，馴養，封裝，干燥，待用；
2）紫背浮萍基因組dna提?。篴在水浴鍋中預熱ctab提取液；b研磨樣品并轉入離心管中，加入提取液，保溫，顛倒混勻；c離心，取上清液；d加入酚/氯仿，混勻，離心，取上清液；e加入氯仿，混勻，離心，取上清液；f重復d、e1~2次；g加入異丙醇混勻，沉淀，離心，棄上清液；h將沉淀物用乙醇漂洗，離心，棄上清液；i重復h；j檢測，低溫保存，備用；
3）設計特異性引物：
微衛星點sp6特異性引物：f:gaaccttaatatgcgaccaag
r:caagaaagtcaaatacagcgg；
4）利用上述引物對紫背浮萍不同地理群內個體的基因組dna進行pcr擴增；
5）對prc產物初篩，加上樣緩沖液，變性后于變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分析，從而獲得紫背浮萍在sp6核心序列區高度遺傳變異的多態性圖譜。
可快捷的獲得紫背浮萍sp6遺傳標記基因座呈現高度遺傳變異的多態性圖譜，方法簡便，所得結果可直觀地檢測出紫背浮萍在此位點的每個個體的基因型。
步驟1中采集紫背浮萍樣品，馴養3~5天，通過人工馴養的方式使野生狀態下的紫背浮萍以無性繁殖的方式進行繁殖，獲得較多的樣品。
步驟2dna提取法為改良的ctab法，通過對ctab法進行改良，獲得的dna質量優異，提取過程中無明顯的dna降解。
步驟2中b在液氮中研磨樣品后轉入離心管中，加入提取液，60~68℃保溫30~60min，每隔10min輕輕顛倒混勻，使樣品充分溶解在提取液中，通過顛倒混勻提高提取效果。
步驟2中h將沉淀物用65~75%乙醇漂洗，離心，棄上清液，通過乙醇漂洗使核酸充分的分離出來。
步驟2中j提取產物取2~3μl用1.0~2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于‐10~-30℃保存備用，采用的凝膠電泳方法簡單、快速、靈敏的特點。
步驟2中a在60~70℃水浴鍋中預熱ctab提取液，ctab提取液由以下成分及重量份組成：ctab3~5份、1mtris-hcl18~22份、nacl14~18份、0.5medta6~10份、1,10-菲啰啉0.02~0.08份、2-巰基乙醇0.2~1份、edta鐵鈉0.03~0.06份、氯仿90~98份、異戊醇3~5份。通過預熱抑制dnase,加速蛋白變性,促進dna溶解，獲得優異的提取效果，dna質量高于現有技術，且提取速度較快。
步驟5中先將pcr產物進行瓊脂糖初篩，選擇有擴增的引物pcr產物加上樣緩沖液，92~95℃變性8~12min后于5~7%變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分析，采用的凝膠電泳方法簡單、快速、靈敏的特點。
步驟5中的上樣緩沖液由以下成分及重量份組成：二甲酚橙0.05~0.18份、檸檬黃0.1~0.25份、溴酚藍0.01~0.05份、二甲苯青ff0.05~0.18份、羧甲基淀粉鈉0.02~0.06份、丙三醇35~37份、番茄紅素0.01~0.02份、乙二胺四乙酸二鈉2.8~3.2份、烷醇酰胺0.04~0.08份、十二烷基硫酸鈉3~5份?？稍黾訕悠访芏?，使其比重增加，以確保dna均勻沉入加樣孔內，使樣品呈色，操作方便。
實施例2：
如圖1所示，利用特異性引物對紫背浮萍sp6微衛星標記檢測的方法，檢測方法如下：
1）材料預處理：采集紫背浮萍樣品，馴養，封裝，干燥，待用；
2）紫背浮萍基因組dna提取：a在水浴鍋中預熱ctab提取液；b研磨樣品并轉入離心管中，加入提取液，保溫，顛倒混勻；c離心，取上清液；d加入酚/氯仿，混勻，離心，取上清液；e加入氯仿，混勻，離心，取上清液；f重復d、e優選的1次；g加入異丙醇混勻，沉淀，離心，棄上清液；h將沉淀物用乙醇漂洗，離心，棄上清液；i重復h；j檢測，低溫保存，備用；
3）設計特異性引物：
微衛星點sp6特異性引物：f:gaaccttaatatgcgaccaag
r:caagaaagtcaaatacagcgg；
4）利用上述引物對紫背浮萍不同地理群內個體的基因組dna進行pcr擴增；
5）對prc產物初篩，加上樣緩沖液，變性后于變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分析，從而獲得紫背浮萍在sp6核心序列區高度遺傳變異的多態性圖譜。
可快捷的獲得紫背浮萍sp6遺傳標記基因座呈現高度遺傳變異的多態性圖譜，方法簡便，所得結果可直觀地檢測出紫背浮萍在此位點的每個個體的基因型。
步驟1中采集紫背浮萍樣品，馴養優選的4天，通過人工馴養的方式使野生狀態下的紫背浮萍以無性繁殖的方式進行繁殖，獲得較多的樣品。
步驟2dna提取法為改良的ctab法，通過對ctab法進行改良，獲得的dna質量優異，提取過程中無明顯的dna降解。
步驟2中b在液氮中研磨樣品后轉入離心管中，加入提取液，在優選的65℃中保溫優選45min，每隔10min輕輕顛倒混勻，使樣品充分溶解在提取液中，通過顛倒混勻提高提取效果。
步驟2中h將沉淀物用優選70%乙醇漂洗，離心，棄上清液，通過乙醇漂洗使核酸充分的分離出來。
步驟2中j提取產物取2μl用優選的2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于優選的‐20℃保存備用，采用的凝膠電泳方法簡單、快速、靈敏的特點。
步驟2中a在優選的65℃水浴鍋中預熱ctab提取液，ctab提取液由以下成分及優選重量份組成：ctab4份、1mtris-hcl20份、nacl16份、0.5medta8份、1,10-菲啰啉0.06份、2-巰基乙醇0.7份、edta鐵鈉0.04份、氯仿92份、異戊醇4份。通過預熱抑制dnase,加速蛋白變性,促進dna溶解，獲得優異的提取效果，dna質量優異，且提取速度較快。
步驟5中先將pcr產物進行瓊脂糖初篩，選擇有擴增的引物pcr產物加上樣緩沖液，優選94℃變性10min后于優選的6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分析，采用的凝膠電泳方法簡單、快速、靈敏的特點。
步驟5中的上樣緩沖液由以下成分及優選的重量份組成：二甲酚橙0.1份、檸檬黃0.2份、溴酚藍0.03份、二甲苯青ff0.12份、羧甲基淀粉鈉0.04份、丙三醇36份、番茄紅素0.016份、乙二胺四乙酸二鈉2.9份、烷醇酰胺0.06份、十二烷基硫酸鈉4份?？稍黾訕悠访芏?，使其比重增加，以確保dna均勻沉入加樣孔內，使樣品呈色，操作方便。
實施例3：
如圖1所示，1)植物材料采集：使用普通魚網兜從河流、池塘、水溝、水稻田等自然水域中采集紫背浮萍樣品，樣品之間最小間隔為20m。采集的新鮮紫背浮萍先在實驗室內使用自來水馴養3~5天后，選取20~40片葉片相連的紫背浮萍植株（包括根）作為基因組dna提取樣品，即一個克?。╟lone）。每一份樣品單獨使用紙質樣品袋封裝，利用硅膠進行干燥制備干樣。
2)紫背浮萍基因組dna提?。翰扇「牧嫉腸tab法進行dna提取，每個樣本采取0.5g葉片進行dna提取。
a）在65℃水浴鍋中預熱ctab提取液；
b）在液氮中迅速研磨樣品，將粉末狀材料轉入2ml離心管中，加入預熱的ctab提取液（每克樣品加入3-5ml的提取液），65℃保溫30-60min，每隔10min輕輕顛倒混勻；
c）12000rpm條件下離心5min，取上清轉入新離心管；
d）加入等體積酚/氯仿（1∶1），充分混勻，11000rpm離心10min，取上清轉入新離心管；
e）加入等體積氯仿，充分混勻，11000rpm離心10min，取上清轉入新離心管；
f）重復步驟d、e；
g）加入2/3體積的異丙醇混勻，室溫放置，沉淀15min；
h）11000rpm條件下離心6min，棄上清；
i）將沉淀用70%的乙醇漂洗一次，室溫條件下11000rpm離心2min，棄上清，重復洗一次；
j）提取產物取2-3μl用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于‐20℃保存備用
3)微衛星引物設計：根據genbank發布的紫背浮萍全基因組序列，使用primerpremier5.0軟件對含有2-6個堿基重復重復單元且重復數超過5個的dna序列進行微衛星（simplerepeatsequence，ssr）引物設計，設計參數如下：引物gc含量不超過40-60%，且正反向引物相差不到10%；退火溫度不小于45℃，且正反向引物相差不超過5℃；正反向引物不能發生錯配，且3'避免互補重疊；引物3'不選擇a，且不選擇超過3個的g或者c；引物長度為18-27bp；預期的pcr產物長度為100-299bp。
設計得微衛星點sp6特異性引物：f:gaaccttaatatgcgaccaag
r:caagaaagtcaaatacagcgg；
4)微衛星pcr擴增:pcr反應體系：
ssr（共20ul）：ddh2o14.8ul，dntp0.4ul，10xpcrbuffer2ul，正向引物0.3ul（20um），反向引物0.3ul（20um），dna模板2ul，taq0.2ul。
pcr反應采用如下循環參數：
ssrpcr擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，54℃復性35s，72℃延伸40s，共35個循環；最終72℃延伸3min。
先將pcr產物進行瓊脂糖初篩，選擇有擴增的引物pcr產物加上上樣緩沖液，94℃變性10min后于6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分析，銀染后觀察。
5)數據分析:pcr擴增產物的電泳位置在凝膠的某個相同遷移率位置上有dna條帶記為1，無dna條帶記為0，然后轉化成aa、bb的格式錄入到excel中，使用tfpgav1.3、fstatv2.9.3（goudet,2002）和popgenev1.32等軟件計算以下參數：多態位點百分率p（percentofpolymorphicloci）；有效等位基因數ne（effectivenumberofallelesperloci）；期望雜合度he（expectedheterozygosity），觀察雜合度ho（observedheterozygosity）；pic（polymorphisminformationcontent）值即多個位點的多態信息含量；近交系數fis（inbreedingcoefficient）。
以上所述，僅是本發明的較佳實施例，并非對本發明作任何限制。凡是根據發明技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效變化，均仍屬于本發明技術方案的保護范圍內。
sequencelisting
<110>浙江海洋大學
<120>利用特異性引物對紫背浮萍sp6微衛星標記檢測的方法
<130>zjou-hk-001
<160>2
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工合成
<400>1
gaaccttaatatgcgaccaag21
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工合成
<400>2
caagaaagtcaaatacagcgg21