本發(fā)明涉及一株抗尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物DNC單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株GW及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
。涉及單克隆細(xì)胞株GW及其產(chǎn)生的抗尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物（DNC）單克隆抗體。
背景技術(shù)：
：尼卡巴嗪為二硝基均二苯脲和羥基二甲基嘧啶組成的1:1復(fù)合物，其中二硝基均二苯脲（DNC）被視為尼卡巴嗪殘留的標(biāo)志物。作為一種廣譜、高效、性能穩(wěn)定的抗球蟲(chóng)飼料藥物添加劑，它具有較強(qiáng)的抗原蟲(chóng)作用，同時(shí)對(duì)球蟲(chóng)病也有一定的防治作用。主要用以預(yù)防雞盲腸球蟲(chóng)(柔嫩艾美耳球蟲(chóng))和堆型、巨型、毒害、布氏艾美耳球蟲(chóng)(小腸球蟲(chóng))。據(jù)試驗(yàn)，感染球蟲(chóng)后48h內(nèi)用藥，能有效地抑制球蟲(chóng)發(fā)育，若用藥遲過(guò)72h，則效果明顯降低。且尼卡巴嗪推薦劑量對(duì)機(jī)體對(duì)球蟲(chóng)免疫力很少或沒(méi)有影響。在防治雞球蟲(chóng)病的同時(shí)，它還能促進(jìn)雞的生長(zhǎng)發(fā)育，節(jié)約飼料，提高養(yǎng)雞的經(jīng)濟(jì)效益。然而，作為抗球蟲(chóng)藥物，其在家禽肌肉及組織中會(huì)造成不同程度的殘留，而大部分藥物隨糞便排出體外。這些糞便用以農(nóng)業(yè)施肥，從而給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)不利影響，進(jìn)而威脅到人民的生命健康。目前檢測(cè)尼卡巴嗪的方法主要是氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）、液相二級(jí)質(zhì)譜（LC-MS/MS）等儀器方法，但是這些方法存在操作繁瑣，耗時(shí)，費(fèi)用比較貴等缺點(diǎn)，不能實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速檢測(cè)，因此建立一種快速簡(jiǎn)便的尼卡巴嗪殘留檢測(cè)方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)對(duì)樣本的純度要求不高而且操作簡(jiǎn)便，適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。然而得到高特異性和檢測(cè)靈敏度的單克隆單體是免疫學(xué)檢測(cè)的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物（DNC）具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備方法。本發(fā)明提供一種抗尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物（DNC）單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，由該細(xì)胞株制備的單克隆抗體對(duì)DNC具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度，可以用來(lái)建立DNC的免疫學(xué)檢測(cè)方法。本發(fā)明提供一種對(duì)DNC具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度的單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明的DNC單克隆抗體，是由保藏號(hào)為CGMCCNo.12014的小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株GW所分泌。本發(fā)明提供的GW細(xì)胞株的制備基本步驟為：（1）免疫完全抗原的合成：稱取Ｎ-琥珀酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酸４-硝基苯胺（SAN,CAS:52299-14-6）4.86mg（0.01mmol），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）5.16mg（0.025mmol），N-羥基丁二酰亞胺（NHS）3.0mg（0.025mmol），將這三種藥物溶于0.5mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，調(diào)節(jié)pH到5.0左右。在室溫活化4h之后，將活化液逐滴加入到溶解6mgBSA的0.05M碳酸鹽緩沖液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜，即得到免疫完全抗原（SAN-EDC-BSA）混合液，通過(guò)透析分離偶聯(lián)產(chǎn)物和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過(guò)紫外吸收掃描方法鑒定；（2）異源包被的制備：稱取谷氨酸-γ-ρ-硝基苯胺（L-γ-Glutamyl-p-nitroanilide，GAN，CAS:67953-08-6）3.63mg，用0.5mL無(wú)水DMF溶解，然后逐滴加入72μL2.5%戊二醛溶液。在室溫?cái)嚢杌罨?0min之后，將活化液逐滴加入到溶解6mgOVA的0.05M碳酸鹽緩沖液中，室溫反應(yīng)4h，即得到異源包被（GAN-戊二醛-OVA）混合液，通過(guò)透析分離偶聯(lián)產(chǎn)物和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過(guò)紫外吸收掃描方法鑒定；（3）小鼠的免疫：尼卡巴嗪完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過(guò)背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強(qiáng)免之間間隔一個(gè)月，加強(qiáng)免之間間隔21天。最后一次用尼卡巴嗪完全抗原（不含佐劑）沖擊免疫；通過(guò)間接ELISA檢測(cè)血清效價(jià)和抑制；（4）細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立：通過(guò)聚乙二醇（PEG4000）法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過(guò)HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞孔的抑制效果，通過(guò)有限稀釋法對(duì)有最好抑制的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株GW；（5）雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定：通過(guò)ELISA法測(cè)定靈敏度和特異性。本發(fā)明的有益效果：（1）本發(fā)明獲得的抗尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物（DNC）單克隆抗體細(xì)胞株，對(duì)DNC有較好的檢測(cè)靈敏度和特異性（IC50值為5μg/L）；（2）一種新的半抗原合成的思路，在于通過(guò)衍生得到半抗原，在用異原包被進(jìn)行檢測(cè)，得到靈敏度很好的單克隆抗體細(xì)胞株。生物材料保藏保藏：抗尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物（DNC）單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株GW已于2016年1月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo.12014。該小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株GW也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。附圖說(shuō)明圖1.單克隆細(xì)胞株GW分泌的單克隆抗體對(duì)DNC的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本
發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說(shuō)明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明通過(guò)將尼卡巴嗪完全抗原免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過(guò)間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選細(xì)胞上清，最終得到了對(duì)DNC有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。實(shí)施例1：雜交瘤細(xì)胞株GW的制備1、完全抗原的合成（1）免疫完全抗原的合成：稱取將Ｎ-琥珀酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酸４-硝基苯胺（SAN,CAS:52299-14-6）4.86mg（0.01mmol），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）5.16mg（0.025mmol），N-羥基丁二酰亞胺（NHS）3.0mg（0.025mmol），將這三種藥物溶于0.5mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF），調(diào)節(jié)pH到5.0左右。在室溫活化4h之后，將活化液逐滴加入到溶解6mgBSA的0.05M碳酸鹽緩沖液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜，即得到免疫完全抗原（SAN-EDC-BSA）混合液，通過(guò)透析分離偶聯(lián)產(chǎn)物和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過(guò)紫外吸收掃描方法鑒定；（2）異源包被的制備：稱取谷氨酸-γ-ρ-硝基苯胺（L-γ-Glutamyl-p-nitroanilide，GAN，CAS:67953-08-6）3.63mg，用0.5mL無(wú)水DMF溶解，然后逐滴加入72μL2.5%戊二醛溶液。在室溫?cái)嚢杌罨?0min之后，將活化液逐滴加入到溶解6mgOVA的0.05M碳酸鹽緩沖液中，室溫反應(yīng)4h，即得到異源包被（GAN-戊二醛-OVA）混合液，通過(guò)透析分離偶聯(lián)產(chǎn)物和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過(guò)紫外吸收掃描方法鑒定；2、動(dòng)物免疫選擇健康的6～8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。取尼卡巴嗪完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過(guò)背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強(qiáng)免之間間隔一個(gè)月，加強(qiáng)免之間間隔21天。三免后7天采血，使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定小鼠血清效價(jià)和抑制，選擇效價(jià)高抑制好的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。3、細(xì)胞融合在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG（聚乙二醇，分子量為4000）方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下：（1）無(wú)菌取小鼠脾臟，研磨并通過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；（2）收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；（3）將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照計(jì)數(shù)比1︰10的比例混合，離心后用50%PEG融合，時(shí)間1min，之后按照從慢到快，加入RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立在細(xì)胞融合的第3天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行RPMI-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進(jìn)行用含20%胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640過(guò)渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第7天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。篩選分兩步：第一步先用間接ELISA篩選出陽(yáng)性細(xì)胞孔，第二步選用DNC為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。選擇對(duì)DNC標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，獲得細(xì)胞株GW。5、單克隆抗體的制備與鑒定取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細(xì)胞，從第七天開(kāi)始收集腹水，將腹水通過(guò)辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20℃保存。使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，測(cè)定單克隆抗體的IC50分別為：5μg/L，說(shuō)明對(duì)DNC有很好的靈敏度，可用于尼卡巴嗪殘留免疫分析檢測(cè)。單克隆抗體的交叉，其交叉實(shí)驗(yàn)如表1所示。表1.GW單克隆抗體的交叉反應(yīng)率藥物名稱IC50(μg/L)CR（%）二硝基均二苯脲（DNC）5100羥基二甲基嘧啶>20000.25地克珠利>20000.25鹽霉素>20000.25二硝托胺>20000.25莫能霉素>20000.25乙氧酰胺苯甲酯>20000.25磺胺喹噁啉>20000.256、抗體應(yīng)用將雜交瘤細(xì)胞株GW通過(guò)體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于DNC的ELISA添加回收試驗(yàn)，具體步驟如下：（1）包被：將異源包被原（GAN-戊二醛-OVA）用0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液從2μg/mL開(kāi)始倍比稀釋，100μL/孔，37℃反應(yīng)2h；（2）洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；（3）封閉：拍干后，加入200μL/孔封閉液，37℃反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；（4）加樣：將抗血清從1:1000開(kāi)始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，100μL/孔，37℃反應(yīng)1h；充分洗滌后，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反應(yīng)1h；（5）顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μL的TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)15min；（6）終止和測(cè)定：每孔加入50μL終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD450值；（7）結(jié)果判讀：以O(shè)D450值大于或等于陰性對(duì)照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所對(duì)應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價(jià)；（8）樣品前處理及添加回收：雞肉勻質(zhì)后，稱取2±0.02g，置于50mL離心管內(nèi)，加乙腈8.0mL，渦旋，超聲10min，5000r/min離心10min。取上清液4.0mL于40~50℃下氮?dú)獯蹈桑诱和?.0mL，加75%甲醇水溶液1.0mL，充分渦旋混合，2000r/min離心10min，取下層溶液，用樣品稀釋液5倍稀釋后采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定。其回收率范圍在93%~116%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于18%。溶液的配置：碳酸鹽緩沖液（CBS）：稱取Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800mL混勻，調(diào)pH值至9.6，加雙蒸水定容至1000mL，4℃貯存?zhèn)溆茫涣姿猁}緩沖液（PBS）：8.00gNaCl，0.2gKCl，0.2gKH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，溶于800mL純水中，用NaOH或HCl調(diào)pH到7.2～7.4，定容至1000mL；PBST：含0.05%吐溫20的PBS；TMB顯色液：A液：Na2HPO4·12H2O18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000mL；B液：60mgTMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按體積比1︰5混合即為T(mén)MB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用來(lái)限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3