本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌肽Dermaseptin-M及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的濫用導(dǎo)致藥物在動物產(chǎn)品中殘留，已經(jīng)嚴(yán)重影響食品安全，使細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性，并通過餐桌潛入人體，成為潛伏在人體內(nèi)的隱形殺手。其危機(jī)是如果發(fā)生新的病種將面臨無藥可用的局面。越來越多的國家開始尋找抗生素的替代品，而抗菌肽以其獨(dú)特的生物活性和殺菌機(jī)制成為最具潛力的抗生素替代品之一?？咕脑谑称?、化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用也不斷加深，具有良好的發(fā)展前景。

抗菌肽（antibacterial peptides)是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬??？咕氖撬拗鳟a(chǎn)生的一類抵抗外界病原體感染的小分子陽離子肽，廣泛存在于昆蟲、植物、動物及人體內(nèi)，具有非特異性抗細(xì)菌、真菌、病毒等病原體作用，還有抗腫瘤細(xì)胞作用，因此又稱為肽抗生素（peptide antibitics)?？咕目咕V廣，對多重耐藥菌、腫瘤細(xì)胞、艾滋病毒有殺傷作用，甚至還可能有抗重癥急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）病毒的作用。因此有著廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景，是目前國際學(xué)術(shù)研究的活躍領(lǐng)域之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的旨在提供一種抗菌肽Dermaseptin-M及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

一種抗菌肽Dermaseptin-M，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述抗菌肽Dermaseptin-M在制備抗菌肽制劑中的應(yīng)用。

所述抗菌肽Dermaseptin-M在制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和/或病毒感染疾病的藥物中的應(yīng)用。

所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌或綠膿桿菌，所述革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌，所述病毒為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒。

有益效果：通過實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明抗菌肽Dermaseptin-M不但對大腸桿菌，綠膿桿菌，金黃色葡萄球菌等有明顯的抑制作用，而且對病毒也有一定的滅活作用，穩(wěn)定性好，抗菌活性強(qiáng)，具有高效廣譜抑菌作用，可以作為抗生素替代品使用。

附圖說明

圖1：發(fā)酵液中Dermaseptin-M蛋白純度鑒定結(jié)果；其中，M為蛋白maker，1，2，3，4均為樣品重復(fù)；

圖2：Dermaseptin-M蛋白質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。

實(shí)施例1

本發(fā)明抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具體為：

Ala-Ser-Trp-Met-Thr-Ser-Phe-Lys-Lys-Val-Leu-Lys-Thr-Pro-Thr-Lys-Thr-Thr-Leu-Asn-Thr-Val-Leu-Val-Gly-Thr-Asn-Ala。

序列特征：序列為氨基酸序列，含有28個氨基酸殘基，鏈型為α螺旋直鏈多肽，分子量大小為 3405 .04Da ，等電點(diǎn)是10.25，疏水殘基46.42%。

本實(shí)施例抗菌肽是發(fā)明人在Dermaseptin基因基礎(chǔ)上通過氨基酸替代增強(qiáng)其多肽抗微生物能力，將改造后Dermaseptin-M基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌，并通過枯草芽孢桿菌發(fā)酵而得；其具體步驟如下：

1. Dermaseptin-M序列合成

Dermaseptin-M是在Dermaseptin序列（如SEQ ID No.2所示）：

GCGTTGTGGATGACCTTGTTAAAAAAGGTTCTTAAAGCTGCCGCAAAGGCTGCGCTGAATGCAGTGTTGGTAGGTGCAAATGCT的基礎(chǔ)上，將第37、43、49、52、61、76位堿基G變?yōu)锳，其編碼氨基酸由丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，第5、17位T變成C，其氨基酸由亮氨酸變成絲氨酸，即Dermaseptin-M序列為：

GCGTCGTGGATGACCTCGTTAAAAAAGGTTCTTAAAACTGCCACAAAGACTACGCTGAATACAGTGTTGGTAGGTACAAATGCT（如SEQ ID No.3所示）。替代后，其親水性增強(qiáng)，更易于表達(dá)。序列委托上海生工公司合成。

2. Dermaseptin-M序列整合入枯草芽孢桿菌

2.1 整合載體的構(gòu)建

將Dermaseptin-M序列按照pUB110載體(購自BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心）克隆標(biāo)準(zhǔn)操作步驟連接到芽孢桿菌載體pUB110上，得到整合載體pUB110-DM。

2.2 枯草芽孢桿菌基因組的整合

將構(gòu)建好的整合載體pUB110-DM用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至Bacillus subtilis（枯草芽孢桿菌）168 (購自BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心）感受態(tài)，操作步驟如下：

1. 以1：100的比例將10mL Bacillus subtilis（枯草芽孢桿菌）168菌液（市購菌粉用無菌水稀釋而得）倒入1000mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振搖2-3小時，每半小時測一次OD，當(dāng)OD值達(dá)到0.3-0.4時，停止培養(yǎng)；

2. 將菌液在冰上預(yù)冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500mL 冰上預(yù)冷的離心杯中，4℃、2500rpm離心10分鐘；

3. 棄上清，離心杯中加入少量ddH₂O，使沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯，4℃、4000rpm離心10分鐘；

4. 棄上清，往離心杯中加入少量10%甘油(滅菌，冰上預(yù)冷；甘油與水的體積百分比，下同)，重懸菌體，再加滿10%甘油，4℃、4000rpm離心10min；

5. 棄上清，每個離心杯中加入5mL10%的甘油，使沉淀懸浮后，制得感受態(tài)；取100 μL感受態(tài)加0.01ng pUB110-DM直接電穿孔轉(zhuǎn)化，用0.05%（g/mL，下同）氯霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

其中，LB液體培養(yǎng)基的配方：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L；

LB固體培養(yǎng)基的配方：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L、瓊脂15 g/L。

3 枯草芽孢桿菌優(yōu)化表達(dá)

首先應(yīng)用 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，確定出轉(zhuǎn)速、接種量和總發(fā)酵時間為重要影響因素。通過最陡爬坡法接近最大響應(yīng)面區(qū)域，利用 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了以Dermaseptin-M蛋白含量為響應(yīng)值的全變量二次回歸方程模型，最終得到枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為：

最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖20g，玉米粉10g，大豆粉10g，酵母粉8g，硅油1g，碳酸氫鈣0.5g，氯化鈣0.015g，硫酸銨1g，硫酸鎂0.15g，加水1000 mL，用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至7.0，于121℃條件下滅菌20 min。

最佳發(fā)酵條件如下：裝液量為500mL的三角瓶中裝100mL培養(yǎng)基，初始pH值為7.0，接種菌液量為2%（即每100ml液體培養(yǎng)基中加入2mL 濃度為1×10⁸個/mL的枯草芽孢桿菌懸液，枯草芽孢桿菌懸液是指篩選所得陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)并調(diào)整菌落濃度而得)，培養(yǎng)溫度為35℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，總發(fā)酵時間120h。

在搖床條件下，優(yōu)化后此發(fā)酵液的Dermaseptin-M蛋白含量達(dá)974.96mg/mL。

鑒定：

（1）、將發(fā)酵液取樣進(jìn)行SDS-PAGE鑒別其純度，結(jié)果顯示如圖1所示，發(fā)酵液中幾乎沒有雜蛋白片段，只有Dermaseptin-M蛋白，灰度掃描計(jì)算其純度為98.9%；

（2）將發(fā)酵液取樣送于上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜結(jié)果見圖2，質(zhì)譜分析見表1；PMF和MS/MS數(shù)據(jù)提交到MASCOT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，分類學(xué)檢索為Phyllomedusa sauvagii，結(jié)果顯示，該蛋白與Dermaseptin蛋白相似率為78.57%，即產(chǎn)生了6個突變。結(jié)合圖譜分析，該蛋白序列為 ：

Ala-Ser-Trp-Met-Thr-Ser-Phe-Lys-Lys-Val-Leu-Lys-Thr-Pro-Thr-Lys-Thr-Thr-Leu-Asn-Thr-Val-Leu-Val-Gly-Thr-Asn-Ala，與發(fā)明人預(yù)期結(jié)果完全一致，說明該蛋白在枯草芽孢桿菌內(nèi)得到正確表達(dá)。

收集發(fā)酵液離心，5000rpm，取上清凍干，得到淡黃色粉末狀成品即抗菌肽Dermaseptin-M，密封包裝，-20°保存可以保存兩年，4°可以保存6個月。

4. 發(fā)明產(chǎn)品抗菌肽Dermaseptin-M最小抑菌濃度（MIC)的測定

MIC實(shí)驗(yàn)選擇大腸桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌等臨床常見有害菌進(jìn)行。分別將大腸桿菌（ATCC25922)、綠膿桿菌（ATCC18642)、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）用肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)至對數(shù)期，然后用肉湯培養(yǎng)基稀釋至2.0×10⁶ cfu/mL。在青霉素瓶中依次加入稀釋過的抗菌肽水溶液100μL（濃度為0.5、1、2、4、5、10、15、20mg/mL），向各瓶中加入已經(jīng)稀釋好的菌液100 μL?；靹蚝笾糜?7℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)18h，震蕩后測定各瓶菌液在600nm處的吸光度值，以100μg/mL氨芐青霉素水溶液作為陽性對照。其中，肉湯培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨 10g/L，牛肉浸出粉 3g/L，氯化鈉5g/L。

結(jié)果判定：以檢測不到細(xì)菌生長的抗菌肽最小濃度孔作為其最小抑菌濃度，結(jié)果如表2所示。

表2可以看出，Dermaseptin-M對大腸桿菌，綠膿桿菌以及金黃色葡萄球菌等臨床常見細(xì)菌都有很強(qiáng)的抑制效果，其中對金黃色葡萄球菌效果最好，綠膿桿菌次之，具有較好的開發(fā)價值。

5. 本發(fā)明產(chǎn)品抗菌肽Dermaseptin-M體外抑制豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的活性

豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）是目前困擾養(yǎng)殖業(yè)的一大難題，豬群感染后引起豬的免疫抑制，導(dǎo)致免疫失敗，還會造成豬瘟、大腸桿菌病等多種疫病混合感染或者繼發(fā)感染。本發(fā)明抗菌肽對PRRSV在體外有一定的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)中PRRSV采用HuN4 F112 株弱毒疫苗，購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司，用生理鹽水將其病毒滴度稀釋至10^-7 TCID₅₀/mL，備用。

Marc-145購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，按如下步驟復(fù)蘇培養(yǎng)：

1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，紫外照射40min以上；

2.培養(yǎng)液（DMEM）、0.25％（g/g，下同)胰蛋白酶溶液恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用；

3.從液氮保存罐中取出細(xì)胞凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化；

4.將融化后所得細(xì)胞懸液移入15mL離心管，緩慢加入4mL DMEM培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）；

5.用DMEM培養(yǎng)液混懸沉淀細(xì)胞，置于37℃、5% CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每管細(xì)胞可以復(fù)蘇2-3瓶。

48h后，將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去，加入0.5-1mL 0.25%的胰蛋白酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。放在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，在原貼壁細(xì)胞逐漸趨于圓形，還未漂起時將胰酶棄去，加入10mL 含1v%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，用無菌吸管將貼壁細(xì)胞吹打成懸液。

5.1 Dermaseptin-M對Marc145細(xì)胞最大無毒濃度的測定

將Marc-145細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔0.1mL，每孔接種細(xì)胞個數(shù)2.5×10⁴。每孔加10v%小牛血清DMEM培養(yǎng)液100μL，置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后觀察細(xì)胞貼壁生產(chǎn)情況。將Dermaseptin-M用DMEM培養(yǎng)液稀釋，濃度分別為0.5、1、2、4、8、16mg/L，待細(xì)胞貼壁后，每孔加DMEM稀釋的Dermaseptin-M 100μL。每4個小時觀察一次，判定各孔存活細(xì)胞的增殖代謝情況及細(xì)胞毒性反應(yīng)，不產(chǎn)生細(xì)胞病變的藥物最大濃度視為最大無毒劑量。培養(yǎng)96h，測得抗菌肽 Dermaseptin-M對Marc-145細(xì)胞的最大安全濃度為8mg/L。即當(dāng)抗菌肽 Dermaseptin-M濃度大于8mg/L時，Marc-145細(xì)胞會產(chǎn)生病變。

5.2 體外抗病毒試驗(yàn)

將Marc-145細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔0.1mL，每孔接種細(xì)胞個數(shù)2.5×10⁴，置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后細(xì)胞形成單層開始進(jìn)行體外抗病毒試驗(yàn)。

試驗(yàn)分正常細(xì)胞對照組（不接種病毒）、PRRSV對照組（只接種PRRSV 0.1mL，不加藥物）、藥物（替米考星）對照組（20mg/L，用DMEM稀釋）和抗菌肽Dermaseptin-M（DM）組（2、4、6mg/L，DMEM液稀釋）。試驗(yàn)采用同時感染的方式進(jìn)行：將PRRSV病毒液用不含血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋100倍后取100μL，與100μL藥物對照組/DM組處理液在37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中作用2h后感染Marc-145細(xì)胞，檢測本發(fā)明抗菌肽對PRRSV的直接滅活作用。

試驗(yàn)采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行，每個處理重復(fù)10次，當(dāng)PRRSV對照組感染陽性率達(dá)75%、正常細(xì)胞對照組正常時進(jìn)行MTT染色，用酶標(biāo)儀測490nm處吸光度值OD_490nm。分別計(jì)算細(xì)胞存活率和DM對PRRSV的抑制率。

細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD_490nm/正常細(xì)胞對照組OD_490nm）×100%；

抑制率=（實(shí)驗(yàn)組OD_490nm－PRRSV對照組OD_490nm）/PRRSV對照組OD_490nm×100%；

抗菌肽Dermaseptin-M對PRRSV抗性結(jié)果如表3所示。

表3可以看出，3個不同濃度的DM與PRRSV直接作用后再作用于Marc-145細(xì)胞，結(jié)果與PRRSV對照組相比，各組的OD_490nm顯著升高（P＜0.05），各組細(xì)胞存活率和對PRRSV的抑制率分別為61.93%、75.29%、85.80%和31.71%、60.12%、82.48%，即三個不同濃度的Dermaseptin-M都有抑制PRRSV的作用，各個濃度間的抑制效應(yīng)差異顯著。Dermaseptin-M在高濃度時的吸光度值、細(xì)胞存活率和對PRRSV的抑制率均稍低于替米考星對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。說明Dermaseptin-M體外可以直接滅活PRRSV，且滅活效果與藥物替米考星相當(dāng)。

綜上，本發(fā)明抗菌肽Dermaseptin-M不僅對畜禽常見致病菌有顯著的抑制作用，對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有較好的效果，抗菌譜廣，而且對PRRSV也有一定的滅活作用，所以本發(fā)明抗菌肽具有極大的應(yīng)用潛力，在制備抗菌抗病毒藥物中能夠得到廣泛的應(yīng)用。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南牧翔動物藥業(yè)有限公司

河南牧翔科技有限公司

<120> 一種抗菌肽Dermaseptin-M及其應(yīng)用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Ser Trp Met Thr Ser Phe Lys Lys Val Leu Lys Thr Pro Thr Lys

1 5 10 15

Thr Thr Leu Asn Thr Val Leu Val Gly Thr Asn Ala

20 25

<210> 2

<211> 84

<212> DNA

<213> 未知

<400> 2

gcgttgtgga tgaccttgtt aaaaaaggtt cttaaagctg ccgcaaaggc tgcgctgaat 60

gcagtgttgg taggtgcaaa tgct 84

<210> 3

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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