本發明涉及生物
技術領域：
，具體涉及蛋白質及其編碼基因在調控植物抗黃萎病性中的應用。
背景技術：
：黃萎病是目前危害棉花生產的重要病害之一，被稱為棉花的“癌癥”，遍布世界各產棉區，其病原為大麗輪枝菌。棉花黃萎病是一種土傳、沿維管束系統侵染的真菌性病害，嚴重危害棉花生長發育，導致棉花纖維的產量和品質大大降低，給棉花生產造成巨大經濟損失，嚴重影響棉花產業的可持續發展。棉花是世界性的重要纖維作物，同時也是一種重要的油料與生物能源作物，在國民經濟和社會發展中占有重要地位。但是我國的基本國情是人多地少，糧棉爭地矛盾非常突出，因此，培育抗病的棉花新品種對于棉花生產至關重要。僅靠單一的常規傳統育種方法由于缺乏有效抗源等問題，很難達到理想效果。因此，分離控制棉花發育和/或提高棉花抗病性的相關基因，有助于加快通過分子育種手段培育新的優質棉花品種。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是如何提高植物的抗黃萎病性。為解決上述技術問題，本發明首先提供了一種蛋白質。本發明所提供的蛋白質，自N末端至C末端依次包括N端元件和C端元件；所述N端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第1至158位所示；所述C端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第166至313位所示。所述蛋白質，可為如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質；a2)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質；a3)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白質；a4)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白質；a5)在a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白質的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質；a6)將a1)或a2)或a3)或a4)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與植物抗病性和/或發育性狀相關的蛋白質；所述發育性狀為株型和/或葉柄長度和/或株高和/或器官大小。其中，序列表中序列2可由313個氨基酸殘基組成。序列表中序列4可由306個氨基酸殘基組成。序列表中序列6可由312個氨基酸殘基組成。序列表中序列8可由313個氨基酸殘基組成。為了使a1)中的蛋白質便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。為了使a2)中的蛋白質便于純化，可在序列表中序列4所示的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。為了使a3)中的蛋白質便于純化，可在序列表中序列6所示的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。為了使a4)中的蛋白質便于純化，可在序列表中序列8所示的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述a6)中的蛋白質，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述a6)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述a6)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列1、序列表中序列3、序列表中序列5或序列表中序列7所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。所述植物可為如下c1)至c8)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)棉花；c4)棉花品種陸地棉TM-1；c5)棉花品種徐州142；c6)十字花科植物；c7)擬南芥；c8)擬南芥bri1-5。所述抗病性可為抗黃萎病。所述抗病性可為抗黃萎病菌引起的病害。所述黃萎病菌具體可為黃萎病強致病菌臨西2-1。編碼所述蛋白質的核酸分子也屬于本發明的保護范圍。編碼所述蛋白質的核酸分子，具體可為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)所示的DNA分子：(b1)核苷酸序列是序列表中序列1或序列表中序列1自5’末端起第1至939位所示的DNA分子；(b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；(b3)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；(b4)核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；(b5)與(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質的DNA分子；(b6)在嚴格條件下與(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。序列表中序列1由942個核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。序列表中序列3由918個核苷酸組成，序列表中序列3的核苷酸編碼序列表中序列4所示的氨基酸序列。序列表中序列5由936個核苷酸組成，序列表中序列5的核苷酸編碼序列表中序列6所示的氨基酸序列。序列表中序列7由939個核苷酸組成，序列表中序列7的核苷酸編碼序列表中序列8所示的氨基酸序列。本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發明的編碼所述蛋白質的核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發明分離得到的所述蛋白質的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述蛋白質，均是衍生于本發明的核苷酸序列并且等同于本發明的序列。這里使用的術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發明的編碼序列表的序列2、序列表的序列4、序列表的序列6或序列表的序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉基因細胞系也屬于本發明的保護范圍。所述重組載體為向載體插入所述核酸分子得到的重組質粒。所述載體具體可為載體pENTR/SD/D-TOPO或載體pMDC83。所述重組載體具體可為重組質粒pGW-GhBZR1。所述重組質粒pGW-GhBZR1可為向載體pENTR/SD/D-TOPO插入序列表中序列1所示的DNA分子。所述重組載體具體可為重組質粒35S::GhBZR1-GFP。所述重組質粒35S::GhBZR1-GFP中含有序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子，表達序列表中序列2所示的蛋白質。所述重組載體具體可為重組質粒pGW-△GhBZR1或重組質粒35S::△GhBZR1-GFP。所述重組質粒pGW-△GhBZR1或重組質粒35S::△GhBZR1-GFP中均含有序列表中序列3所示的DNA分子，表達序列表中序列4所示的蛋白質。所述重組載體具體可為重組質粒pGW-GhBZR1△I160或重組質粒pGW-GhBZR1△I160-GFP。所述重組質粒pGW-GhBZR1△I160或重組質粒pGW-GhBZR1△I160-GFP中均含有序列表中序列5所示的DNA分子，表達序列表中序列6所示的蛋白質。所述重組載體具體可為重組質粒pGW-GhBZR1S163G或重組質粒pGW-GhBZR1S163G-GFP。所述重組質粒pGW-GhBZR1S163G或重組質粒pGW-GhBZR1S163G-GFP中含有序列表中序列7所示的DNA分子，表達序列表中序列8所示的蛋白質。所述重組微生物為將所述重組載體導入出發微生物得到的重組菌。所述重組微生物具體可為將所述重組質粒35S::GhBZR1-GFP、所述重組質粒35S::△GhBZR1-GFP、所述重組質粒pGW-GhBZR1△I160-GFP或所述重組質粒pGW-GhBZR1S163G-GFP導入出發微生物得到的重組菌。所述出發微生物可為根癌農桿菌。所述根癌農桿菌具體可為根癌農桿菌GV3101。所述轉基因細胞系均不包括繁殖材料。d1)或d2)的應用也屬于本發明的保護范圍：d1)所述蛋白質，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉基因細胞系，在調控植物抗病性中的應用；d2)所述蛋白質，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉基因細胞系，在培育發育性狀改變的轉基因植物中的應用；所述發育性狀為株型和/或葉柄長度和/或株高和/或器官大小。上述應用中，所述植物可為如下c1)至c8)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)棉花；c4)棉花品種陸地棉TM-1；c5)棉花品種徐州142；c6)十字花科植物；c7)擬南芥；c8)擬南芥bri1-5。上述應用中，所述抗病性可為抗黃萎病。上述應用中，所述抗病性可為抗黃萎病菌引起的病害。所述黃萎病菌具體可為黃萎病強致病菌臨西2-1。為解決上述技術問題，本發明還提供了培育轉基因植物的方法。本發明所提供的培育轉基因植物的方法，具體可為方法一，包括在受體植物中過表達所述蛋白質，得到轉基因植物的步驟；與所述受體植物相比，所述轉基因植物具有如下表型：抗病性增加和/或葉柄長度增加和/或株高增加。本發明所提供的培育轉基因植物的方法，具體可為方法二，包括向受體植物中導入抑制所述蛋白質表達的物質，得到轉基因植物的步驟；與所述受體植物相比，所述轉基因植物具有如下表型：抗病性降低和/或株高減少和/或第一節間距減小和/或第四節間距減小和/或第五節間距減小和/或株型緊湊和/或第一果枝夾角減小和/或第二果枝夾角減小和/或第三果枝夾角減小和/或葉柄長度減少和/或棉纖維長度減少。所述株高減少具體體現在主莖的第一節間距、第四節間距和五節間距的減小。所述株型緊湊具體體現在主莖的第一果枝夾角、第二果枝夾角和三果枝夾角減小。上述方法中，編碼所述蛋白質的核酸分子，具體可為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)所示的DNA分子：(b1)核苷酸序列是序列表中序列1或序列表中序列1自5’末端起第1至939位所示的DNA分子；(b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；(b3)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；(b4)核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；(b5)與(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質的DNA分子；(b6)在嚴格條件下與(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。序列表中序列1由942個核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。序列表中序列3由918個核苷酸組成，序列表中序列3的核苷酸編碼序列表中序列4所示的氨基酸序列。序列表中序列5由936個核苷酸組成，序列表中序列5的核苷酸編碼序列表中序列6所示的氨基酸序列。序列表中序列7由939個核苷酸組成，序列表中序列7的核苷酸編碼序列表中序列8所示的氨基酸序列。上述方法一中，所述“在受體植物中過表達所述蛋白質”可通過向受體植物中導入編碼所述蛋白質的核酸分子實現。所述“向受體植物中導入編碼所述蛋白質的核酸分子”可通過向受體植物中導入重組載體甲實現；所述重組載體甲可為向載體插入編碼所述蛋白質的核酸分子得到的重組質粒。所述重組載體甲具體可為重組質粒35S::GhBZR1-GFP。所述重組質粒35S::GhBZR1-GFP中含有序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子，表達序列表中序列2所示的蛋白質。上述方法二中，所述“抑制所述蛋白質表達的物質”可為抑制編碼所述蛋白質的核酸分子的表達的物質。所述“抑制編碼所述蛋白質的核酸分子的表達的物質”可通過向受體植物中導入重組質粒PTRV2-GhBZR1和載體PTRV1實現。所述重組質粒PTRV2-GhBZR1具體可為向載體PTRV2的限制性內切酶PstⅠ的識別序列間插入序列表中序列1自5'末端起第231至531位所示的DNA分子。上述方法中，所述受體植物可為如下c1)至c8)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)棉花；c4)棉花品種陸地棉TM-1；c5)棉花品種徐州142；c6)十字花科植物；c7)擬南芥；c8)擬南芥bri1-5。上述方法中，所述抗病性可為抗黃萎病。上述方法中，所述抗病性可為抗黃萎病菌引起的病害。所述黃萎病菌具體可為黃萎病強致病菌臨西2-1。上文中，所述轉基因植物理解為不僅包含將所述核酸分子轉化受體植物得到的第一代轉基因植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可以在該物種中繁殖所述核酸分子，也可用常規育種技術將所述核酸分子轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業品種中。所述轉基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。實驗證明，利用本發明提供的蛋白質及其編碼基因能調控植物抗黃萎病性和發育性狀(如株型和/或葉柄長度和/或株高和/或器官大小)：向擬南芥中導入蛋白質的編碼基因，得到葉柄長度增加和抗黃萎病性增加的轉基因植物；向徐州142或陸地棉TM-1中導入抑制所述蛋白質表達的物質，得到株高減少、株型緊湊、棉纖維長度減少和抗黃萎病性降低的轉基因植物。因此，本發明提供的蛋白質對培育抗黃萎病的植物具有重要的理論意義和實用價值。附圖說明圖1為實施例2步驟三中2的實驗結果。圖2為實施例2步驟三中3的實驗結果。圖3為實施例3步驟三中1的實驗結果。圖4為實施例3步驟三中2的實驗結果。圖5為實施例3步驟三中3的實驗結果。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。擬南芥bri1-5記載于如下文獻中：XueluWang，XiaoqingLi，Ji11Mwisenhelder，TonyHunter，ShigeoYoshida，TadaoAsami，andJoanneChory.AutoregulationandHomodimerizationAreInvolvedintheActivationofthePlantSteroidReceptorBRI1.Deve1opmentCe11，2005年第8期855-865.公眾可以從中國科學院植物研究所(即申請人處)獲得，以重復本申請實驗。在下文中，擬南芥bri1-5簡稱bri1-5。陸地棉TM-1記載于如下文獻中：TronlinderNLetal，1989，PlantCellRep8:133-136.。徐州142記載于如下文獻中：于曉紅等，2000，中國科學(C輯)，30(5)：517-522。陸地棉TM-1和徐州142均為國家棉花種質資源中期庫的產品。在下文中，陸地棉TM-1簡稱為TM-1，徐州142簡稱為Xu-142。根癌農桿菌GV3101記載于如下文獻中：鄭銀英，崔百明，常明進，彭明.轉擬南芥ICE1基因增強煙草抗寒性的研究.西北植物學報.2009年29卷1期.75-79.公眾可以從中國科學院植物研究所(即申請人處)獲得，以重復本申請實驗。載體PTRV1和載體PTRV2均記載于如下文獻中：DongY，Burch-SmithTM，LiuY，MamillapalliP，Dinesh-KumarSP.Aligation-independentcloningtobaccorattlevirusvectorforhigh-throughputvirus-inducedgenesilencingidentifiesrolesforNbMADS4-1and-2infloraldevelopment.Plantphysiol.2007年145期.1161-1170.公眾可以從中國科學院植物研究所(即申請人處)獲得，以重復本申請實驗。載體pENTR/SD/D-TOPO和載體pMDC83均為Invitrogen公司產品。PDA培養基：去皮的馬鈴薯200g切成小塊，加入1L蒸餾水煮沸30分鐘，過濾，向濾液中加入葡萄糖20g和瓊脂1g，用蒸餾水定容至1L，pH值自然，121℃高壓滅菌15min。查氏液體培養基：將硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀1g、MgSO4·7H2O0.5g、氯化鉀0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g和瓊脂15g溶于蒸餾水，用蒸餾水定容至1000mL。黃萎病強致病菌臨西2-1記載于如下文獻中：王國寧，趙貴元，岳曉偉，李志坤，張艷，張桂寅，吳立強，王省芬，馬峙英,河北省棉花黃萎病菌致病性與ISSR遺傳分化，棉花學報，2012，24(4)：348-357.在下文中，黃萎病強致病菌臨西2-1簡稱為臨西2-1。侵染溶液：含10mMMES、10mMMgCl2和200mM乙酰丁香酮的水溶液。實施例1、蛋白GhBZR1的編碼基因和GhBZR1突變蛋白的編碼基因的克隆一、蛋白GhBZR1的編碼基因的克隆本發明的發明人從陸地棉TM-1中克隆出蛋白GhBZR1的編碼基因，即GhBZR1基因。1、采用Trizo1法提取生長至14天的陸地棉TM-1幼苗的葉片的總RNA，然后利用反轉錄酶AMV反轉錄出第一鏈cDNA。2、人工合成引物F：5'-CACCATGACGTCAGATGGGGCGACGT-3'和R：5'-ACATCGAGCTTTCCCACTTCCG-3'。3、完成步驟1和2后，以步驟1提取的cDNA為模板，以F和R為引物進行PCR擴增，得到約940bp的雙鏈DNA分子。4、將雙鏈DNA分子和載體pENTR/SD/D-TOPO進行連接，得到重組質粒pGW-GhBZR1。根據測序結果，重組質粒pGW-GhBZR1含有序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子，表達序列表中序列2所示的蛋白質(以下簡稱蛋白質GhBZR1或蛋白GhBZR1)。二、GhBZR1突變蛋白的編碼基因的克隆GhBZR1突變蛋白具體為蛋白△GhBZR1、蛋白GhBZR1△I160和蛋白GhBZR1S163G。1、蛋白△GhBZR1的編碼基因的克隆1)人工合成引物F△GhBZR：5'-TCGTCTCTGCCTCCTCTCGTGACACCACCACTTTCT-3'和R△GhBZR：5'-TCGTCTCTGCCTCCTCTCGTGACACCACCACTTTCT-3'。2)完成步驟1)后，以重組質粒pGW-GhBZR1為模板，以R△GhBZR和步驟一中2合成的F為引物，進行PCR擴增，得到雙鏈DNA分子1；以重組質粒pGW-GhBZR1為模板，以F△GhBZR和步驟一中2合成的R為引物，進行PCR擴增，得到雙鏈DNA分子2。3)將雙鏈DNA分子1和雙鏈DNA分子2按照摩爾比1：1混合并以此為模板，以步驟一中2合成的F和R為引物進行PCR擴增，得到約920bp的雙鏈DNA分子。4)將約920bp的雙鏈DNA分子和載體pENTR/SD/D-TOPO進行連接，得到重組質粒pGW-△GhBZR1。根據測序結果，重組質粒pGW-△GhBZR1含有序列表中序列3所示的DNA分子(以下簡稱突變體基因1)，表達序列表中序列4所示的蛋白質(以下簡稱突變體蛋白1或蛋白△GhBZR1)。序列表中序列3所示的DNA分子與序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子的唯一不同在于將后者的第475至495位核苷酸進行了刪除。序列表中序列4所示的蛋白質與序列表中序列2所示的蛋白質的唯一不同在于將后者的第159至165位的氨基酸殘基進行了刪除。2、蛋白GhBZR1△I160的編碼基因的克隆1)人工合成引物F△I160：5'-TCTCTGCCTCCTCTCAGATCTAATAGTGCCCCCGTG-3'和R△I160：5'-CACGGGGGCACTATTAGATCTGAGAGGAGGCAGAGA-3'。2)完成步驟1)后，以重組質粒pGW-GhBZR1為模板，以R△I160和步驟一中2合成的F為引物，進行PCR擴增，得到雙鏈DNA分子3；以重組質粒pGW-GhBZR1為模板，以F△I160和步驟一中2合成的R為引物，進行PCR擴增，得到雙鏈DNA分子4。3)將雙鏈DNA分子3和雙鏈DNA分子4按照摩爾比1：1混合并以此為模板，以步驟一中2合成的F和R為引物進行PCR擴增，得到約940bp的雙鏈DNA分子。4)將約940bp的雙鏈DNA分子和載體pENTR/SD/D-TOPO進行連接，得到重組質粒pGW-GhBZR1△I160。根據測序結果，重組質粒pGW-GhBZR1△I160含有序列表中序列5所示的DNA分子(以下簡稱突變體基因2)，表達序列表中序列6所示的蛋白質(以下簡稱突變體蛋白2或蛋白GhBZR1△I160)。序列表中序列5所示的DNA分子與序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子的唯一不同在于將后者的第478至480位核苷酸進行了刪除。序列表中序列6所示的蛋白質與序列表中序列2所示的蛋白質的唯一不同在于將后者的第160位的異亮氨酸殘基進行了刪除。3、蛋白GhBZR1S163G的編碼基因的克隆1)人工合成引物FS163G：5'-ATCTCTAATGGTGCCCCCGTG-3'和RS163G：5'-CACGGGGGCACCATTAGAGAT-3'。2)完成步驟1)后，以重組質粒pGW-GhBZR1為模板，以RS163G和步驟一中2合成的F為引物，進行PCR擴增，得到雙鏈DNA分子5；以重組質粒pGW-GhBZR1為模板，以F163G和步驟一中2合成的R為引物，進行PCR擴增，得到雙鏈DNA分子6。3)將雙鏈DNA分子5和雙鏈DNA分子6按照摩爾比1：1混合并以此為模板，以步驟一中2合成的F和R為引物進行PCR擴增，得到約940bp的雙鏈DNA分子。4)將約940bp的雙鏈DNA分子和載體pENTR/SD/D-TOPO進行連接，得到重組質粒pGW-GhBZR1S163G。根據測序結果，重組質粒pGW-GhBZR1S163G含有序列表中序列7所示的DNA分子(以下簡稱突變體基因3)，表達序列表中序列8所示的蛋白質(以下簡稱突變體蛋白3或蛋白GhBZR1S163G)。序列表中序列7所示的DNA分子與序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子的唯一不同在于將后者的第487位的A替換為了G。序列表中序列8所示的蛋白質與序列表中序列2所示的蛋白質的唯一不同在于將后者的第163位的絲氨酸殘基替換為了甘氨酸殘基。實施例2、轉基因擬南芥的獲得及鑒定一、重組載體和重組農桿菌的構建1、重組質粒35S::GhBZR1-GFP和GV3101/35S::GhBZR1-GFP的獲得將實施例1步驟一構建的重組質粒pGW-GhBZR1和載體pMDC83進行LR重組反應，得到LR反應產物。將LR反應產物加入TOP10感受態細胞進行轉化，得到的克隆即為目標克隆，該目標克隆中的質粒為目標質粒，將該目標質粒命名為重組質粒35S::GhBZR1-GFP。測序結果表明，重組質粒35S::GhBZR1-GFP中含有序列表中序列1自5'末端起第1至939位所示的DNA分子，表達序列表中序列2所示的蛋白GhBZR1。將重組質粒35S::GhBZR1-GFP導入根癌農桿菌GV3101，得到重組農桿菌，命名為GV3101/35S::GhBZR1-GFP。2、重組質粒35S::△GhBZR1-GFP和GV3101/35S::△GhBZR1-GFP的獲得將實施例1步驟二中1構建的重組質粒pGW-△GhBZR1和載體pMDC83進行LR重組反應，得到LR反應產物。將LR反應產物加入TOP10感受態細胞進行轉化，得到的克隆即為目標克隆，該目標克隆中的質粒為目標質粒，將該目標質粒命名為重組質粒35S::△GhBZR1-GFP。測序結果表明，重組質粒35S::△GhBZR1-GFP中含有突變體基因1，表達突變體蛋白1。將重組質粒35S::△GhBZR1-GFP導入根癌農桿菌GV3101，得到重組農桿菌，命名為GV3101/35S::△GhBZR1-GFP。3、重組質粒pGW-GhBZR1△I160-GFP和GV3101/pGW-GhBZR1△I160-GFP的獲得將實施例1步驟二構建的重組質粒pGW-GhBZR1△I160和載體pMDC83進行LR重組反應，得到LR反應產物。將LR反應產物加入TOP10感受態細胞進行轉化，得到的克隆即為目標克隆，該目標克隆中的質粒為目標質粒，將該目標質粒命名為重組質粒pGW-GhBZR1△I160-GFP。測序結果表明，重組質粒pGW-GhBZR1△I160-GFP中含有突變體基因2，表達突變體蛋白2。將重組質粒pGW-GhBZR1△I160-GFP導入根癌農桿菌GV3101，得到重組農桿菌，命名為GV3101/pGW-GhBZR1△I160-GFP。4、重組質粒pGW-GhBZR1S163G-GFP和GV3101/pGW-GhBZR1S163G-GFP的獲得將實施例1步驟二構建的重組質粒pGW-GhBZR1S163G和載體pMDC83進行LR重組反應，得到LR反應產物。將LR反應產物加入TOP10感受態細胞進行轉化，得到的克隆即為目標克隆，該目標克隆中的質粒為目標質粒，將該目標質粒命名為重組質粒pGW-GhBZR1S163G-GFP。測序結果表明，重組質粒pGW-GhBZR1S163G-GFP中含有突變體基因3，表達突變體蛋白3。將重組質粒pGW-GhBZR1S163G-GFP導入根癌農桿菌GV3101，得到重組農桿菌，命名為GV3101/pGW-GhBZR1S163G-GFP。5、GV3101/pMDC83的獲得將載體pMDC83導入根癌農桿菌GV3101，得到重組農桿菌，命名為GV3101/pMDC83。二、轉基因擬南芥的獲得1、采用擬南芥花序浸花轉化法(記載于如下文獻中Clough，S.J.，andBent，A.F..Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.(1998)16，735-743.)，將步驟一中1獲得的GV3101/35S::GhBZR1-GFP轉至擬南芥bri1-5中，獲得T1代轉GhBZR1基因擬南芥種子。2、將步驟1獲得的T1代轉GhBZR1基因擬南芥種子播種于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培養基上，能夠正常生長的擬南芥(抗性苗)即為T1代轉GhBZR1基因陽性苗，T1代轉GhBZR1基因陽性苗收到的種子即為T2代轉GhBZR1基因擬南芥種子。3、將步驟2篩選出的不同株系的T2代轉GhBZR1基因擬南芥種子播種于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培養基上進行篩選，如果某株系中能夠正常生長的擬南芥(抗性苗)的數目與不能夠正常生長的擬南芥(非抗性苗)的數目比例為3：1，則該株系為GhBZR1基因插入一個拷貝的株系，該株系中的抗性苗收到的種子即為T3代轉GhBZR1基因擬南芥種子。4、將步驟3篩選出的T3代轉GhBZR1基因擬南芥種子再次播種于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培養基上進行篩選，均為抗性苗的即為T3代純合轉GhBZR1基因擬南芥。將其中2個T3代純合轉GhBZR1基因擬南芥株系分別命名為OEGhBZR11-2和OEGhBZR11-4，并進行后續實驗。按照上述方法，將GV3101/35S::GhBZR1-GFP替換為GV3101/35S::△GhBZR1-GFP，其它步驟均相同，得到T3代純合轉突變體基因1擬南芥，將其中2個T3代純合轉突變體基因1擬南芥株系分別命名為OE△GhBZR12-5和OE△GhBZR12-9，并進行后續實驗。按照上述方法，將GV3101/35S::GhBZR1-GFP替換為GV3101/pGW-GhBZR1△I160-GFP，其它步驟均相同，得到T3代純合轉突變體基因2擬南芥，將其中2個T3代純合轉突變體基因2擬南芥株系分別命名為OEGhBZR1△I1603-22和OEGhBZR1△I1603-26，并進行后續實驗。按照上述方法，將GV3101/35S::GhBZR1-GFP替換為GV3101/pGW-GhBZR1S163G-GFP，其它步驟均相同，得到T3代純合轉突變體基因3擬南芥，將其中2個T3代純合轉突變體基因3擬南芥株系分別命名為OEGhBZR1△S163G4-7和OEGhBZR1△S163G4-13，并進行后續實驗。按照上述方法，將GV3101/35S::GhBZR1-GFP替換為GV3101/pMDC83，其它步驟均相同，得到T3代純合轉空載體擬南芥的植株，簡稱轉空載體擬南芥。三、轉基因擬南芥的鑒定1、分別取OEGhBZR11-2的T3代種子、OEGhBZR11-4的T3代種子、OE△GhBZR12-5的T3代種子、OE△GhBZR12-9的T3代種子、OEGhBZR1△I1603-22的T3代種子、OEGhBZR1△I1603-26的T3代種子、OEGhBZR1△S163G4-7的T3代種子、OEGhBZR1△S163G4-13的T3代種子、轉空載體擬南芥的T3代種子和擬南芥bri1-5的種子，種植于營養土中，25℃培養4周，依次得到OEGhBZR11-2的幼苗、OEGhBZR11-4的幼苗、OE△GhBZR12-5的幼苗、OE△GhBZR12-9的幼苗、OEGhBZR1△I1603-22的幼苗、OEGhBZR1△I1603-26的幼苗、OEGhBZR1△S163G4-7的幼苗、OEGhBZR1△S163G4-13的幼苗、轉空載體擬南芥的幼苗和擬南芥bri1-5的幼苗。2、轉基因擬南芥的表型鑒定(1)觀察步驟1各幼苗的表型。實驗結果見圖1中A。結果表明，轉空載體擬南芥的幼苗和擬南芥bri1-5的幼苗的表型無顯著差異。與轉空載體擬南芥的幼苗相比，OE△GhBZR12-5的幼苗、OE△GhBZR12-9的幼苗、OEGhBZR1△S163G4-7的幼苗和OEGhBZR1△S163G4-13的幼苗的葉柄變長，OEGhBZR1△S163G4-13的幼苗的葉柄最長。(2)Real-TimePCR檢測GhBZR1基因的表達量實驗重復三次，每次重復的步驟如下：①樣本的獲得取步驟1得到的OEGhBZR11-2的幼苗，放入液氮保存，得到樣本1。取步驟1得到的OEGhBZR11-4的幼苗，放入液氮保存，得到樣本2。取步驟1得到的OE△GhBZR12-5的幼苗，放入液氮保存，得到樣本3。取步驟1得到的OE△GhBZR12-9的幼苗，放入液氮保存，得到樣本4。取步驟1得到的OEGhBZR1△I1603-22的幼苗，放入液氮保存，得到樣本5。取步驟1得到的OEGhBZR1△I1603-26的幼苗，放入液氮保存，得到樣本6。取步驟1得到的OEGhBZR1△S163G4-7的幼苗，放入液氮保存，得到樣本7。取步驟1得到的OEGhBZR1△S163G4-13的幼苗，放入液氮保存，得到樣本8。取步驟1得到的擬南芥bri1-5的幼苗，放入液氮保存，得到樣本9。取步驟1得到的轉空載體擬南芥的幼苗，放入液氮保存，得到樣本10。②Real-TimePCR檢測GhBZR1基因的表達量采用Trizo1法提取樣本(樣本1、樣本2、樣本3、樣本4、樣本5、樣本6、樣本7、樣本8、樣本9或樣本10)的總RNA，然后利用反轉錄酶AMV反轉錄出第一鏈cDNA，將該cDNA作為模板，實時定量PCR檢測GhBZR1基因的表達量。鑒定GhBZR1基因的引物為5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT-3’和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第242至384位所示。將樣本1中GhBZR1基因的表達量作為1，其它樣本中GhBZR1基因的相對表達量見圖1中B：樣本2中GhBZR1基因的相對表達量約為0.8，樣本3中GhBZR1基因的相對表達量約為0.5，樣本4中GhBZR1基因的相對表達量約為1.4，樣本5中GhBZR1基因的相對表達量約為0.6，樣本6中GhBZR1基因的相對表達量約為0.4，樣本7中GhBZR1基因的相對表達量約為0.7，樣本8中GhBZR1基因的相對表達量約為1.6，樣本9中GhBZR1基因的相對表達量幾乎檢測不到。樣本10和樣本9中GhBZR1基因的表達量無顯著差異。可見，步驟(1)中幼苗的葉柄越長，則步驟(2)中相應幼苗的GhBZR1基因的相對表達量越高。3、轉基因擬南芥的黃萎病抗性鑒定實驗重復三次，每個株系每次種植10株，具體步驟如下：(1)在PDA培養基上接種臨西2-1，25℃活化培養3～4天。(2)完成步驟(1)后，挑選單菌落，接種于查氏液體培養基，25℃、180rpm恒溫振蕩培養3周，得到培養菌液。(3)完成步驟(2)后，取培養菌液，使用紗布過濾收集病原菌孢子，得到孢子菌液，孢子菌液中臨西2-1的濃度為106個/mL。(4)完成步驟(3)后，取轉空載體擬南芥的幼苗、擬南芥bri1-5的幼苗、OEGhBZR11-2的幼苗、OE△GhBZR12-5的幼苗、OEGhBZR1△I1603-22的幼苗或OEGhBZR1△S163G4-13的幼苗，采用根部接種的方法接種步驟(3)得到的孢子菌液或侵染溶液(接種侵染溶液的幼苗作為對照)，每株擬南芥接種200μL孢子菌液或侵染溶液。完成步驟(4)的第五天，觀察記錄擬南芥的黃萎病發病情況，并按照黃萎病病級劃分標準(記載于如下文獻中：Wang,G.N.，Zhao,G.Y.，Yue,X,W.，Li,Z.K.，Zhang,Y.，ZhangG.Y.，Wu,L.Q.，Wang,S,F.，Ma,Z.Y.PathogenicityandISSRGeneticDifferentiationofVerticilliumdahliaeIsolatesfromCottonGrowingAreasofHebeiProvince.CottonScience.24,348-357)進行病級調查比例統計結果。實驗結果見圖2(A為擬南芥的生長狀態，CK為接種侵染溶液，處理為接種孢子菌液；B為病級調查比例統計結果)。結果表明，轉空載體擬南芥的幼苗和擬南芥bri1-5的幼苗的黃萎病病級無顯著差異。與擬南芥bri1-5的幼苗相比，OEGhBZR11-2的幼苗、OE△GhBZR12-5的幼苗、OEGhBZR1△I1603-22的幼苗和OEGhBZR1△S163G4-13的幼苗對黃萎病的抗性均顯著增強。可見，在擬南芥bri1-5中過表達GhBZR1基因、突變體基因1、轉突變體基因2或轉突變體基因3均可提高擬南芥bri1-5對黃萎病的抗性。實施例3、棉花沉默株的獲得及鑒定一、重組質粒PTRV2-GhBZR1的構建和重組農桿菌的獲得1、采用Trizo1法提取生長至14天的陸地棉TM-1幼苗的葉片的總RNA，然后利用反轉錄酶AMV反轉錄出第一鏈cDNA。2、人工合成引物F1：5'-CGACGACAAGACCCTCACCACTTATCGAAAGGG-3'和R1：5'-GAGGAGAAGAGCCCTATTTCTGGAGGTTGGAG-3'。3、完成步驟1和2后，以步驟1提取的cDNA為模板，以F1和R1為引物進行PCR擴增，然后純化、回收，得到約300bp的雙鏈DNA分子。4、將步驟3中得到雙鏈DNA分子置于含有dATP的T4DNA合成酶緩沖液中，22℃處理30min，然后70℃放置20min，得到片段甲。5、將載體PTRV2用限制性內切酶PstⅠ酶切8h，回收酶切產物。將該酶切產物置于含有dTTP的T4DNA合成酶緩沖液中，22℃處理30min，然后70℃放置20min，得到載體骨架。6、將片段甲和載體骨架混合，65℃連接2min，得到重組質粒PTRV2-GhBZR1。根據測序結果，重組質粒PTRV2-GhBZR1為向載體PTRV2的限制性內切酶PstⅠ的識別序列間插入序列表中序列1自5'末端起第231至531位所示的DNA分子。將重組質粒PTRV2-GhBZR1導入根癌農桿菌GV3101，得到重組農桿菌，命名為GV3101/PTRV2-GhBZR1。將載體PTRV1導入根癌農桿菌GV3101，得到重組農桿菌，命名為GV3101/PTRV1。二、棉花沉默株的獲得1、取GV3101/PTRV2-GhBZR1的單菌落，接種至4mL含50mg/L利福平(Rif)和50g/L卡那霉素(Kan)的YEP液體培養基中，28℃、200rpm振蕩培養24h，得到培養菌液1。2、完成步驟1后，取培養菌液1，按體積比為1：100接種至含50mg/L利福平(Rif)和50g/L卡那霉素(Kan)的YEP液體培養基中，28℃、200rpm振蕩培養6h，得到培養菌液2。培養菌液2的0D600為0.5左右。3、完成步驟1后，取培養菌液2，5000rpm離心5min，得到沉淀1，然后用50mL侵染溶液重懸，得到侵染液甲。4、將步驟1～3中的GV3101/PTRV2-GhBZR1替換為GV3101/PTRV1，其它步驟均不變，得到侵染液乙。5、將步驟3得到的侵染液甲和步驟4得到的侵染液乙混合(體積比為1:1)，得到侵染工作液；用該侵染工作液侵染生長至10天的陸地棉TM-1幼苗的子葉，得到10株陸地棉TM-1擬沉默株，依次將其命名為T1～T10。6、完成步驟5兩周后，采用Trizo1法分別提取10株陸地棉TM-1擬沉默株和生長至24天的陸地棉TM-1幼苗的總RNA，然后利用反轉錄酶AMV反轉錄出第一鏈cDNA。以該cDNA為模板，實時定量PCR檢測GhBZR1基因的表達量。鑒定GhBZR1基因的引物為5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT-3’和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第242至384位所示。實驗結果表明，與陸地棉TM-1幼苗的GhBZR1基因的表達量相比，T1、T3、T5和T8中GhBZR1基因的表達量均顯著降低。因此，T1、T3、T5和T8均為陸地棉TM-1沉默株。以T1、T3、T5和T8為研究材料進行后續的實驗，在下文統一命名為VIGS-GhBZR1。按照上述方法，將步驟5中陸地棉TM-1替換為徐州142，得到徐州142沉默株。徐州142沉默株在下文稱為VIGS-GhBZR1-Xu142。三、陸地棉TM-1沉默株的表型鑒定和黃萎病抗性鑒定1、陸地棉TM-1沉默株現蕾期的表型鑒定(1)觀察陸地棉TM-1和VIGS-GhBZR1現蕾期的表型實驗結果如下：自現蕾期開始，與陸地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1表現出主要由主莖的第一、四、五節間距縮短引起的植株矮化(即株高降低)(圖3中A、B和C，CK為陸地棉TM-1，1st為第一節間距，2nd為第二節間距，3rd為第三節間距，4th為第四節間距，5th為第五節間距，6th為第六節間距)、主要由主莖的第一、二、三果枝的夾角減小引起的株型緊湊(圖3中D，CK為陸地棉TM-1，1st為第一果枝的夾角，2nd為第二果枝的夾角，3rd為第三果枝的夾角)和葉柄變短(見圖3中E，CK為陸地棉TM-1)。(2)實時定量PCR檢測GhBZR1基因的表達量實驗重復三次，每次重復的步驟如下：①樣本的獲得取處于現蕾期的VIGS-GhBZR1的幼嫩葉片，放入液氮保存，得到樣本1。取處于現蕾期的陸地棉TM-1的幼嫩葉片，放入液氮保存，得到樣本2。②實時定量PCR檢測GhBZR1基因的表達量采用Trizo1法提取樣本1或樣本2的總RNA，然后利用反轉錄酶AMV反轉錄出第一鏈cDNA，將該cDNA作為模板，實時定量PCR檢測GhBZR1基因的表達量。鑒定GhBZR1基因的引物為5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT-3’和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第242至384位所示。將樣本2中GhBZR1基因的表達量作為1，樣本1中GhBZR1基因的相對表達量見圖3中F。實驗結果表明，VIGS-GhBZR1中GhBZR1基因的相對表達量約為0.35。(3)葉柄細胞的電鏡掃描和實時定量PCR檢測苯丙烷代謝相關酶類的九個基因的表達量對陸地棉TM-1或VIGS-GhBZR1的葉柄細胞進行電鏡掃描。結果表明(圖3中G)，與陸地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1的葉柄細胞變短。細胞壁是植物細胞特有的細胞結構，由初生壁與次生壁組成，其中次生壁的合成影響著細胞的大小。在次生壁的木質素合成過程中，苯丙烷的代謝起了重要作用。對陸地棉TM-1或VIGS-GhBZR1中的苯丙烷代謝相關酶類的九個基因(GhPAL1基因、GhC4H1基因、Gh4CL1基因、GhC3H1基因、GhCCoAOMT1基因、GhCCR1基因、GhF5H1基因、GhCOMT基因、GhCAD6基因和GhExp1基因，上述基因均記載于如下文獻中：Xu,L.，Zhu,L.，Tu,L.，Liu,L.，Yuan,D.，Jin,L.，Long,L.，andZhang,X.(2011)LigninmetabolismhasacentralroleintheresistanceofcottontothewiltfungusVerticilliumdahliaeasrevealedbyRNA-Seq-dependenttranscriptionalanalysisandhistochemistry.J.Exp.Bot.62，5607-5621.)的表達量進行檢測，結果表明，與陸地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1中GhCCoAOMT1基因、GhCCR1基因、GhF5H1基因、GhCOMT基因、GhCAD6基因的表達均受到不同程度的抑制(圖3中H)。鑒定GhPAL1基因的引物為5’-CCTGGGTCAATCTTTGCTTC-3’和5’-AGGTCTCACCACCGAGTTTC-3’；鑒定GhC4H1基因的引物為5’-GATGCAAAGCTTGGTGGGTATGAC-3’和5’-ACTTGTTAAATCAAAACACCCTTGGCTT-3’；鑒定Gh4CL1基因的引物為5’-AATCATCAAATTCAAAGGCTTTCAAGTG-3’和5’-AGGCGTTGCAATTTAAAAGCCAAATAGATTA-3’；鑒定GhC3H1基因的引物為5’-ACTCTTCAGGGTCCTTCCAC-3’和5’-GAGGCTGCTCGTGTAGTGG-3’；鑒定GhCCoAOMT1基因的引物為5’-AAAGAAGGGCCTGCAATGCCAGTT-3’和5’-GGTAACGGTGGTTCATTTGAGGCGA-3’；鑒定GhCCR1基因的引物為5’-AGGATTGTTGATGACGCCTGAC-3’和5’-GTAGATTCTGCCTTCTCCCAAC-3’；鑒定GhF5H1基因的引物為5’-CGACGGTAGCATAGAACATCC-3’和5’-CAACAAGCAAGATCATTGACCT-3’；鑒定GhCOMT基因的引物為5’-CTTCCTGATTACCCCGACC-3’和5’-TAATTCCAGAAAATCCACCTTTT-3’；鑒定GhCAD6基因的引物為5’-GCTTCCAGCAACATCCACGAC-3’和5’-AGGATTGTTGATGACGCCTGAC-3’；鑒定GhExp1基因的引物為5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’。2、陸地棉TM-1沉默株的棉鈴和棉纖維的表型鑒定(1)觀察陸地棉TM-1和VIGS-GhBZR1的棉鈴和棉纖維的表型觀察陸地棉TM-1和VIGS-GhBZR1的棉鈴和棉纖維，實驗結果如下：與陸地棉TM-1相比，結鈴期時VIGS-GhBZR1的棉鈴生長受到抑制(圖4中A，CK為陸地棉TM-1)；與陸地棉TM-1相比，棉纖維成熟后，VIGS-GhBZR1的棉纖維變短，即棉纖維長度減少(圖4中B和C，CK為陸地棉TM-1)。(2)實時定量PCR檢測GhBZR1基因、GhExp1基因、GhPFN基因和GhTBU1基因的表達量GhExp1基因、GhPFN基因和GhTBU1基因(記載于如下文獻中：WangJ，WangH，ZhaoP，HanL，JiaoG，ZhengY，HuangS，XiaG(2010)OverexpressionofaProfilin(GhPFN2)PromotestheProgressionofDevelopmentalPhasesinCottonFibersPlantCellPhysiol.51(8)：1276-1290)均為已知的與纖維相關的基因。實驗重復三次，每次重復的步驟如下：①樣本的獲得取VIGS-GhBZR1的開花授粉3天后的棉纖維，放入液氮保存，得到樣本1。取陸地棉TM-1的開花授粉3天后的棉纖維，放入液氮保存，得到樣本2。取VIGS-GhBZR1的開花授粉15天后的棉纖維，放入液氮保存，得到樣本3。取陸地棉TM-1的開花授粉15天后的棉纖維，放入液氮保存，得到樣本4。②實時定量PCR檢測GhBZR1基因、GhExp1基因、GhPFN基因和GhTBU1基因的表達量采用Trizo1法提取樣本(樣本1、樣本2、樣本3或樣本4)的總RNA，然后利用反轉錄酶AMV反轉錄出第一鏈cDNA，將該cDNA作為模板，以5’-GAAAGGGATGTAAGCCACCT-3’和5’-GGAAGAGGAGGAAGGACTGA-3’為引物，實時定量PCR檢測GhBZR1基因的表達量。按照上述方法，將GhBZR1基因替換為GhExp1基因，得到GhExp1基因的表達量。鑒定GhExp1基因的引物為5’-GAGGGAGCCATTGACAACATCTT-3’和5’-GCGAACAGTTCACAGCTATGTTCA-3’。按照上述方法，將GhBZR1基因替換為GhPFN基因，得到GhPFN基因的表達量。鑒定GhPFN基因的引物為5’-ACCTTTCTGCCGCTGCTATCG-3’和5’-CGCCCAACCTCTCCACAACC-3’。按照上述方法，將GhBZR1基因替換為GhTBU1基因，得到GhTBU1基因的表達量。鑒定GhTBU1基因的引物為5’-AAGGAAGCCGAGAATTGCGATTG-3’和5’-CGAGGGAATGGAATAAGGTTTACAGC-3’。實驗結果表明，與陸地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1中GhBZR1基因、GhExp1基因、GhPFN基因和GhTBU1基因的表達均受到不同程度的抑制(圖4中D)。開花授粉3天后的棉纖維中：將陸地棉TM-1中GhBZR1基因的表達量作為1，VIGS-GhBZR1中GhBZR1基因的相對表達量約為0.4；將陸地棉TM-1中GhExp1基因的表達量作為1，VIGS-GhBZR1中GhExp1基因的相對表達量約為0.2；將陸地棉TM-1中GhPFN基因的表達量作為1，VIGS-GhBZR1中GhPFN基因的相對表達量約為0.1；將陸地棉TM-1中GhTBU1基因的表達量作為1，VIGS-GhBZR1中GhTBU1基因的相對表達量約為0.2。開花授粉15天后的棉纖維中：將陸地棉TM-1中GhBZR1基因的表達量作為1，VIGS-GhBZR1中GhBZR1基因的相對表達量約為0.5；將陸地棉TM-1中GhExp1基因的表達量作為1，VIGS-GhBZR1中GhExp1基因的相對表達量約為0.1；將陸地棉TM-1中GhPFN基因的表達量作為1，VIGS-GhBZR1中GhPFN基因的相對表達量約為0.3；將陸地棉TM-1中GhTBU1基因的表達量作為1，VIGS-GhBZR1中GhTBU1基因的表達量幾乎檢測不到。3、棉花沉默株的黃萎病抗性鑒定(1)陸地棉TM-1沉默株的黃萎病抗性鑒定實驗重復三次，每個株系每次種植10株，具體步驟如下：①同實施例2步驟三3中(1)。②同實施例2步驟三3中(2)。③同實施例2步驟三3中(3)。④完成步驟③后，取25℃、培養4周的VIGS-GhBZR1的幼苗和陸地棉TM-1幼苗，采用莖部接種的方法接種步驟③得到的孢子菌液或侵染溶液(接種侵染培養基的作為對照)，每株棉花幼苗接種10mL孢子菌液或侵染溶液。完成步驟④的第五周，觀察記錄棉花的黃萎病發病情況并計算致病系數(Wang,G.N.，Zhao,G.Y.，Yue,X,W.，Li,Z.K.，Zhang,Y.，ZhangG.Y.，Wu,L.Q.，Wang,S,F.，Ma,Z.Y.PathogenicityandISSRGeneticDifferentiationofVerticilliumdahliaeIsolatesfromCottonGrowingAreasofHebeiProvince.CottonScience.24，348-357.)。實驗結果見圖5(A為接種孢子菌液的單株棉花的葉片，TM-1為陸地棉TM-1；B為接種孢子菌液的致病系數，TM-1為陸地棉TM-1)。結果表明，與陸地棉TM-1相比，VIGS-GhBZR1的葉片嚴重黃化甚至枯萎，致病系數較高，對黃萎病的抗性也顯著降低。(2)徐州142沉默株的黃萎病抗性鑒定實驗重復三次，每個株系每次種植10株，具體步驟如下：①同實施例2步驟三3中(1)。②同實施例2步驟三3中(2)。③同實施例2步驟三3中(3)。④完成步驟③后，取25℃、培養4周的VIGS-GhBZR1-Xu142的幼苗和徐州142的幼苗，采用莖部接種的方法接種步驟③得到的孢子菌液或侵染溶液(接種侵染溶液的作為對照)，每株棉花幼苗接種10mL孢子菌液或侵染溶液。完成步驟④的第五周，觀察記錄棉花的黃萎病發病情況并計算致病系數(Wang,G.N.，Zhao,G.Y.，Yue,X,W.，Li,Z.K.，Zhang,Y.，ZhangG.Y.，Wu,L.Q.，Wang,S,F.，Ma,Z.Y.PathogenicityandISSRGeneticDifferentiationofVerticilliumdahliaeIsolatesfromCottonGrowingAreasofHebeiProvince.CottonScience.24，348-357.)。實驗結果見圖5中C。結果表明，與徐州142相比，VIGS-GhBZR1-Xu142的致病系數較高，對黃萎病的抗性也顯著降低。上述結果表明，在徐州142或陸地棉TM-1中沉默GhBZR1基因均可降低其對黃萎病的抗性。當前第1頁1 2 3