本發明屬于生物技術領域，涉及一種發酵與生物轉化原位耦合制備殼寡糖的方法。

背景技術：

殼寡糖是殼聚糖經水解后產生的一類聚合度在 2-20且可溶于水的氨基糖類化合物，具有獨特的生理活性和優越的功能性質，在食品、農業、醫藥和化工領域具有重要應用，如可以作為功能性食品添加劑和防腐劑，在農業上作為植物調節劑和生物防治劑，在醫藥上可以作為抗癌和免疫系統的藥物等。殼寡糖可作為植物生長調節劑，能夠刺激植物的免疫系統反應，增強植物對病蟲害的防御能力，對煙草花葉病毒病、稻瘟病和紋枯病、核盤霉菌病原菌等植物病具有較好的防治作用，還對植物體內多種功能酶具有較好的誘導激活作用，并且可誘導植保素合成，此外殼聚糖對鱗翅目和同翅目等害蟲均具有一定的殺蟲活性。

殼寡糖的制備方法有酶法、氧化法和酸降解法，其中酶法制備殼寡糖具有反應條件溫和、可人為控制降解速率和產物相對分子質量、不產生二次污染等優點。在酶法制備殼寡糖中，具有突出應用前景的是專一性酶（殼聚糖酶）轉化法制備，其相對于非專一性酶（如纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、溶菌酶和果膠酶等）來說，具有催化效率高、產物聚合度適中且具有高生理生化活性等突出優點。

在以往的文獻報道中，酶法生物轉化生產殼寡糖首先是獲得生物催化劑，然后采用酶法生物轉化制備的兩步工藝路線。本發明是在篩選獲得一株用于番茄和葡萄根結線蟲害防治的淡紫擬青霉（發明專利CN 104818216 A）的基礎上，發現該菌株還高產殼聚糖酶，以此優化其培養工藝，在此基礎上確立了微生物發酵與酶法生物轉化原位耦合制備殼寡糖的工藝技術，該種殼寡糖制備方法相對于傳統的發酵與生物轉化完全分開兩步法來說，具有節省設備投資、車間廠房占地面積小、轉化效率高、產品質量穩定等突出優點。

技術實現要素：

本發明針對上述技術存在的不足，提供一種發酵與生物轉化原位耦合制備殼寡糖的方法，其特征在于發酵生產殼聚糖酶和酶法生物轉化制備殼寡糖的工藝合二為一。以淡紫擬青霉YT08為出發菌株，在其培養前期以殼聚糖酶產量為主，在微生物培養后期以生物轉化制備殼寡糖為目的。

所用的淡紫擬青霉菌株具有高產殼聚糖酶的特性，其保藏名稱為：YT08，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年11月26日，保藏號為CGMCC No.10026，分類命名：淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）。

本發明的目的可以通過如下措施來達到：

1. 菌種活化

活化培養基：3～5 g/L蛋白胨，5～10 g/L葡萄糖，0.5～1.5 g/L殼聚糖（90%以上的脫乙酰度），0.5～1 g/L磷酸二氫鉀，0.3～0.6 g/L硫酸鎂, pH 7.0。500ml三角燒瓶中分裝100ml活化培養基，115℃滅菌20min備用。從試管斜面保存菌種中挑取1環接種于活化培養基中，在28℃、200 rpm下培養30 h至菌體渾濁，制得活化種子液。

2. 發酵與生物轉化原位耦合制備殼寡糖

采用優選培養基：5～15 g/L甘油，15～25 g/L大豆蛋白胨，1.5～2.5 g/L MnSO₄，8～12 g/L粉末殼聚糖（90%以上的脫乙酰度），2.5～3.5 g/L NaCl，0.5～1.5 g/L CaCl₂，1.5～2.5 g/L MgSO₄，0.6～1.2 g/L FeSO₄。在生物發酵罐中，以70%比例裝入發酵培養組分，經118℃蒸汽滅菌20min后，火焰圈保護條件下按照0.2～0.5%（v/v）的比例接入活化的菌種，通過調節酸堿蠕動泵控制發酵過程中的pH始終維持在pH 5.5～6.0，利用發酵罐的加熱裝置調節培養溫度在28～32℃，溶解氧參數通過調節進罐的無菌空氣量和攪拌轉速的大小使其始終維持在5%以上。經發酵培養2 d后，往發酵罐中一次性添加滅菌的殼聚糖（90%以上的脫乙酰度），新增殼聚糖濃度為20～30 g/L，維持溶解氧在10%以上繼續培養2d以實現生物轉化殼聚糖底物制備殼寡糖。

3. 殼寡糖產品回收與成型

殼寡糖產品回收：發酵與生物轉化原位耦合制備的殼寡糖樣液，經過濾除菌體和未反應的底物殼聚糖后即可直接作為農業殼寡糖和飼料添加劑使用。

殼寡糖產品成型：經過濾除菌絲體后的殼寡糖樣液，添加無水乙醇至終體積分數為 30%以沉淀蛋白，離心去沉淀后的酶解產物溶液經過截留分子量10kDa 的超濾膜過濾，收集膜透過液組分，再補加無水乙醇至終體積分數為75%，以沉淀殼寡糖產品，最后經離心收集沉淀并干燥后即為成型的殼寡糖產品。

為進一步實現本發明的目的，本發明方法中底物殼聚糖添加使用粉末殼聚糖。根據淡紫擬青霉YT08所產殼聚糖酶對殼聚糖底物形式的降解程度不同，以粉末狀態催化效率較高，且方便后續產物分離，故所用的殼聚糖為粉末殼聚糖形式。

本發明中殼寡糖的制備方法與現有的制備方法相比，其有益效果在于：

（1）殼寡糖制備高效、產品質量高

采用本發明的制備方法獲得的殼寡糖產品，均為高生理活性的殼寡糖產品，聚合度適中，且產品得率高。

（2）發酵與生物轉化原位耦合，節省設備等投資

本發明提供發酵與生物轉化原位耦合制備殼寡糖的新型工藝，相對現有的酶制劑生產和生物轉化完全分開的兩步工藝來說，具有節省設備投資、占地面積小、縮減人力用工成本等突出特點，適合工廠化放大生產。

附圖說明

圖1 為實施例1中酶解產物的薄層層析結果分析，其中標號1為氨基葡萄糖，標號2為酶解產物。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發明做進一步詳細描述，這些實施例用于理解而不是限制本發明的保護范圍。

實施例1：在10L發酵罐中發酵與生物轉化原位耦合制備殼寡糖（1）

活化培養基：3 g/L蛋白胨，5 g/L葡萄糖，0.5 g/L殼聚糖（90%脫乙酰度），磷酸二氫鉀0.5，硫酸鎂0.3, pH 7.0。500ml三角燒瓶中分裝100ml活化培養基，115℃滅菌20min備用。從試管斜面保存菌種中挑取1環接種于活化培養基中，在28℃、200 rpm下培養30 h至菌體渾濁，制得活化種子液。

采用優選培養基：5 g/L甘油，15 g/L大豆蛋白胨，1.5 g/L MnSO₄，8 g/L粉末殼聚糖（90%脫乙酰度），2.5 g/L NaCl，0.5 g/L CaCl₂，1.5 g/L MgSO₄，0.6 g/L FeSO₄。在10L生物發酵罐中，以70%比例裝入發酵培養組分，經118℃蒸汽滅菌20min后，火焰圈保護條件下按照0.2%（v/v）的比例接入活化的菌種，通過調節酸堿蠕動泵控制發酵過程中的pH始終維持在pH 5.5，利用發酵罐的加熱裝置調節培養溫度在28℃，溶解氧參數通過調節進罐的無菌空氣量和攪拌轉速的大小使其始終維持在5%以上。經發酵培養2 d后，往發酵罐中一次性添加滅菌的殼聚糖（90%的脫乙酰度），新增殼聚糖濃度為20 g/L，維持溶解氧在10%以上繼續培養2d以實現生物轉化殼聚糖底物制備殼寡糖。

酶解產物的薄層層析分析見附圖1，可以看出所得殼寡糖產品均為聚合度為2以上且8以下的高生理活性的殼寡糖。

經過濾除菌絲體后的殼寡糖樣液，添加無水乙醇至終體積分數為 30%以沉淀蛋白，離心去沉淀后的酶解產物溶液經過截留分子量10kDa 的超濾膜過濾，收集膜透過液組分，再補加無水乙醇至終體積分數為75%，以沉淀殼寡糖產品，最后經離心收集沉淀并干燥后即為成型的殼寡糖產品128.18 g，殼寡糖實際產品得率為61.4%。

實施例2：在10L發酵罐中發酵與生物轉化原位耦合制備殼寡糖（2）

活化培養基：5 g/L蛋白胨，10 g/L葡萄糖，1.5 g/L殼聚糖（90%脫乙酰度），1 g/L磷酸二氫鉀，0.6 g/L硫酸鎂, pH 7.0。500ml三角燒瓶中分裝100ml活化培養基，115℃滅菌20min備用。從試管斜面保存菌種中挑取1環接種于活化培養基中，在28℃、200 rpm下培養30 h至菌體渾濁，制得活化種子液。

采用優選培養基：15 g/L甘油，25 g/L大豆蛋白胨，2.5 g/L MnSO₄，12 g/L粉末殼聚糖（90%以上的脫乙酰度），3.5 g/L NaCl，1.5 g/L CaCl₂，2.5 g/L MgSO₄，1.2 g/L FeSO₄。在生物發酵罐中，以70%比例裝入發酵培養組分，經118℃蒸汽滅菌20min后，火焰圈保護條件下按照0.5%（v/v）的比例接入活化的菌種，通過調節酸堿蠕動泵控制發酵過程中的pH始終維持在pH 6.0，利用發酵罐的加熱裝置調節培養溫度在32℃，溶解氧參數通過調節進罐的無菌空氣量和攪拌轉速的大小使其始終維持在5%以上。經發酵培養2 d后，往發酵罐中一次性添加滅菌的殼聚糖（90%脫乙酰度），新增殼聚糖濃度為30 g/L，維持溶解氧在10%以上繼續培養2d以實現生物轉化殼聚糖底物制備殼寡糖。

經過濾除菌絲體后的殼寡糖樣液，添加無水乙醇至終體積分數為 30%以沉淀蛋白，離心去沉淀后的酶解產物溶液經過截留分子量10kDa 的超濾膜過濾，收集膜透過液組分，再補加無水乙醇至終體積分數為75%，以沉淀殼寡糖產品，最后經離心收集沉淀并干燥后即為成型的殼寡糖產品180.49 g，殼寡糖實際產品得率為65.39%。

實施例3：在50L發酵罐中發酵與生物轉化原位耦合制備殼寡糖

活化培養基：4 g/L蛋白胨，8 g/L葡萄糖，1.5 g/L殼聚糖（90%脫乙酰度），0.6 g/L磷酸二氫鉀，0.5 g/L硫酸鎂, pH 7.0。500ml三角燒瓶中分裝100ml活化培養基，115℃滅菌20min備用。從試管斜面保存菌種中挑取1環接種于活化培養基中，在28℃、200 rpm下培養30 h至菌體渾濁，制得活化種子液。

采用優選培養基：12 g/L甘油，25 g/L大豆蛋白胨，1.5 g/L MnSO₄，12 g/L粉末殼聚糖（90%以上的脫乙酰度），3 g/L NaCl，1 g/L CaCl₂，2 g/L MgSO₄，1 g/L FeSO₄。在生物發酵罐中，以70%比例裝入發酵培養組分，經118℃蒸汽滅菌20min后，火焰圈保護條件下按照0.5%（v/v）的比例接入活化的菌種，通過調節酸堿蠕動泵控制發酵過程中的pH始終維持在pH 6.0，利用發酵罐的加熱裝置調節培養溫度在32℃，溶解氧參數通過調節進罐的無菌空氣量和攪拌轉速的大小使其始終維持在5%以上。經發酵培養2 d后，往發酵罐中一次性添加滅菌的殼聚糖（90%脫乙酰度），新增殼聚糖濃度為25 g/L，維持溶解氧在10%以上繼續培養2d以實現生物轉化殼聚糖底物制備殼寡糖。

經過濾除菌絲體后的殼寡糖樣液，添加無水乙醇至終體積分數為 30%以沉淀蛋白，離心去沉淀后的酶解產物溶液經過截留分子量10kDa 的超濾膜過濾，收集膜透過液組分，再補加無水乙醇至終體積分數為75%，以沉淀殼寡糖產品，最后經離心收集沉淀并干燥后即為成型的殼寡糖產品172.8 g，殼寡糖實際產品得率為67.72%。

實施例4：在300L發酵罐中發酵與生物轉化原位耦合制備殼寡糖

活化培養基：3 g/L蛋白胨，7 g/L葡萄糖，1 g/L殼聚糖（90%脫乙酰度），0.6 g/L磷酸二氫鉀，0.4 g/L硫酸鎂, pH 7.0。500ml三角燒瓶中分裝100ml活化培養基，115℃滅菌20min備用。從試管斜面保存菌種中挑取1環接種于活化培養基中，在28℃、200 rpm下培養30 h至菌體渾濁，制得活化種子液。

采用優選培養基：10 g/L甘油，20 g/L大豆蛋白胨，1.5 g/L MnSO₄，10 g/L粉末殼聚糖（95%脫乙酰度），2.5 g/L NaCl，1 g/L CaCl₂，2 g/L MgSO₄，0.6 g/L FeSO₄。在生物發酵罐中，以70%比例裝入發酵培養組分，經118℃蒸汽滅菌20min后，火焰圈保護條件下按照0.5%（v/v）的比例接入活化的菌種，通過調節酸堿蠕動泵控制發酵過程中的pH始終維持在pH 6.0，利用發酵罐的加熱裝置調節培養溫度在30℃，溶解氧參數通過調節進罐的無菌空氣量和攪拌轉速的大小使其始終維持在5%以上。經發酵培養2 d后，往發酵罐中一次性添加滅菌的殼聚糖（95%脫乙酰度），新增殼聚糖濃度為30 g/L，維持溶解氧在10%以上繼續培養2d以實現生物轉化殼聚糖底物制備殼寡糖。

經過濾除菌絲體后的殼寡糖樣液，添加無水乙醇至終體積分數為 30%以沉淀蛋白，離心去沉淀后的酶解產物溶液經過截留分子量10kDa 的超濾膜過濾，收集膜透過液組分，再補加無水乙醇至終體積分數為75%，以沉淀殼寡糖產品，最后經離心收集沉淀并干燥后即為成型的殼寡糖產品188.02 g，殼寡糖實際產品得率為66.15%。