專利名稱：實時熒光定量檢測豬鼻支原體的引物和探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種實時熒光定量檢測豬鼻支原體的引物和探針，特別是用于豬鼻支原體的實時熒光定量PCR檢測，屬于生物技術領域。
背景技術：
豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)是一種能夠引起豬多發性衆膜炎、關節炎、耳炎、肺炎等病癥的致病性支原體。豬鼻支原體不僅在豬群中普遍存在，同時也是人類和多種動物細胞培養中常見的污染物。作為一種常見病原菌，豬鼻支原體通常由母豬或大豬傳染給小豬。已有研究者證實了能從10%母豬和30% 40%斷奶仔豬的鼻腔分泌物中分離出該支原體。一旦感染，該支原體在上呼吸道迅速傳播并且能從感染豬的肺臟和鼻咽管中分離到。在英國和美國的慢性豬肺炎案例中，50%以上都能檢測到豬鼻支原體的存在；同時在地方性肺炎暴發群中幾乎每次都能夠分離到豬鼻支原體。從捷克斯洛伐克、丹麥、德國和英 國分離出的幾株豬鼻支原體通過呼吸道途徑能誘發豬肺炎。豬鼻支原體的三株捷克斯洛伐克分離物和一株英國分離物，可誘導無菌小豬發生肺炎。國內寧夏農學院曾以兩株疑似豬鼻支原體(寧農3和寧農5)培養物滴鼻接種小豬，誘發輕度肺炎。臺灣林俊宏用豬鼻支原體分離株ATIT-1、3、7混合物氣管內注射可以誘發部分攻毒豬發生典型的豬支原體肺炎病變，并成功從大部分攻毒豬肺中分離到豬鼻支原體。另外，研究表明，豬鼻支原體與人類的腫瘤發生有關。迄今為止，對豬鼻支原體的檢測方法有培養法、血清學檢測方法等，而對豬鼻支原體檢測主要以分離培養為主,所需要的時間較長,亟需建立一種敏感性高的、快速的、等量的分子生物學檢測方法。本發明提供了豬鼻支原體實時熒光定量PCR的引物和探針，有助于快速、定量診斷豬鼻支原體的感染。

發明內容
技術問題本發明的目的是為了克服現有的以分離培養為主對豬鼻支原體檢測的時間長、無法準確定量的缺陷，提供一種能快速、靈敏、準確、定量檢測豬鼻支原體的實時熒光定量PCR檢測方法。技術方案—種快速檢測豬鼻支原體的熒光定量PCR引物和探針，引物1:P37-F 5' -AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3'引物2:P37-R 5' -TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3'分子信標探針5，-FAM-ATCAGCAACAAAACCTT-MGB-3，檢測過程中PCR擴增反應體系為無菌雙蒸水8μ12Χ反應預混液(.含Taq廳、dNTP及緩沖液)P
20μΜ 引物 IΙμ
20μΜ 引物 2Ιμ
20μΜ分f信標探針Ιμ
校正染料Rox0.5 μ
標準陽性模板ρΜ-Ρ37或樣品模板DNAΙμ 反應條件為95 V預處理IOmin,進行40個循環反應，每個循環反應包括 950C 15s，53。。lmin，于 53°C 時測定熒光值。用所述的引物對和分子信標探針可以制備豬鼻支原體的熒光定量PCR檢測試劑盒。有益效果本發明與現有技術相比具有以下優點和效果I、定量準確；2、檢測速度快，僅I小時，加上DNA提取的制備，共僅需3_4h ；3、步驟簡單；4、可同時進行高通量的樣品檢測。在本發明提供檢測豬鼻支原體熒光定量PCR的引物和探針，將其用于豬鼻支原體定量檢測，建立了檢測豬鼻支原體熒光定量PCR的方法，該方法的靈敏度可在每個反應體系中檢出10拷貝，完全可以滿足快速鑒定診斷豬鼻支原體的要求。


圖I不同拷貝數陽性質粒熒光PCR擴增的動力學曲線。分別以模板數為I. OXlO8-L OXlO1拷貝/ml及水為陰性對照進行Taqman PCR分析。圖2顯示豬鼻支原體熒光定量PCR的標準曲線。針對模板數為I. OX IO8-L OX IO1拷貝/ml的反應體系進行Taqman PCR分析。當豬鼻支原體個數為I. O X IO1時，檢測樣品的Ct值為34左右，即檢測下限靈敏度可達I. OX IO1拷貝/ml。繪制得到的標準曲線的斜 率為-3. 121，在Y軸截距為38. 243，相關系數R2=O. 999。
具體實施例方式試劑包括a) DNA裂解液，b) Taq DNA聚合酶，c)標準陽性模板，d)熒光定量反應液，其特征是熒光定量反應液中含有引物和熒光探針，引物為正向引物(SEQ ID N01)5，-AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3’，和反向引物(SEQ ID NO: 2)，5’ -TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3’，熒光探針(SEQ ID NO. 3)序列為 5，-ATCAGCAACAAAACCTT-3，，熒光探針 5，端標記FAM (熒光報告基因)，3’端標記MGB基因(熒光淬滅基團)，標準陽性模板pM_P37 (SEQ IDNO:4)是含有豬鼻支原體P37蛋白基因的1212個核苷酸片段構成的pMD18_T(購于Takara公司)可在大腸桿菌Trans5 α (購于Takara公司)中增殖。貯存濃度為IX 101°拷貝/ μ 1，使用前系列稀釋。實驗所用的標準品為含有目的擴增片段的質粒ΡΜ-Ρ37，該質粒轉化大腸桿菌Trans5 α增殖后用堿裂解法提取，用分光光度計測A26tl(所測樣品在吸收波長為260nm紫外線照射下的光密度)的定量并稀釋至I X IOltl拷貝/ μ 1，-20°C保存。在制作標準曲線時，所使用的標準陽性模板pM_P37 DNA(SEQ ID NO:4)為5’ -ttgctcaaaaaatttaaaaattttattctattttcatctatattttcgccaatagcatttgctatatcatgttctaatacaggagtagtcaagcaagaggatgtatcagttagtcaaggtcaatgagataaaagtataacatttggtgtttcagaagcttggttaaacaagaaaaaaggaggtaaagaagttaacaaagaagttattaatacatttttagaaaatttcaaaaaagaatttaataaactcaaaaatgcaaatgataaaaccaaaaacttcgatgacgttgattttaaagtaactccaattcaagactttactgtgttgttaaacaatttatctactgacaatcctgaattagattttggaattaatgcttcaggaaaattggtagaatttctaaaaaataatcctggtataataactccagcattagaaacaacaactaattcttttgtatttgacaaagaaaaagataaaatttatgttgatggtacagattcagatccacttgtaaaaattgctaaagaaattaataaaatttttgttgaaactccatatgcaagttgaactgatgaaaatcataagtgaaatggtaatgtttatcaaagtgtttacgatccaactgttcaagctaatttttatagaggaatgatttgaataaaaggtaatgatgaaactctagctaaaattaaaaaagcttgaaatgataaagattgaaatacatttagaaattttggaattttacacggtaaagataattcttcttctaaattcaagttagaagaaactatattaaaaaaccactttcaaaataaatttacaacactaaatgaagacagaagcgcacatccaaacgcatataaacaaaaatctgcagatacattgggaactttagatgatttccatattgctttttcagaagaaggttcttttgcttgaacacataacaaatcagcaacaaaaccttttgaaactaaagcaaatgaaaagatggaagcacttatagtaactaatccaattccgtatgatgttggagtgtttagaaaaagtgttaaccaattagaacaaaatttaattgttcaaacattcattaatttagctaaaaataaacaagatacatatggtccacttttagggtataatggttataaaaaaattgacaatttccaaaaagagattgtagaagtttatgaaaaagccattaaataa-3’本發明中，熒光定量反應液由正向引物和反向引物，熒光探針，熒光定量PCR反應預混液及無菌雙蒸水組成；在本發明的一個具體方案中，2倍熒光定量PCR反應預混液(含Taq酶、dNTP及緩沖液)(Takara公司)12. 5 μ 1，20 μ mol/L正向引物和反向引物各1μ l,20ymol/L熒光探針I μ 1，O. 5 μ I校正染料ROX和8 μ I無菌水組成，最后加入I μ I的樣品DNA的模板進行反應，其中熒光探針為SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，熒光探針5’端標記FAM，3’端標記MGB。使用DA7600、ABI7500型等其他結構類型的自動熒光檢測熱循環儀上對如上得到的DNA序列進行PCR擴增。所使用的反應條件為95°C預處理lOmin，進行40個循環反應，每個循環反應包括95°C 15s，53°C lmin，于53°C時測定熒光值。反應完成后，借助裝置上配置的自動分析系統分析結果。在本研究中，如果循環閾值(Ct)等于或大于38，結果即為陰性；如果Ct值小于38，結果則為陽性。其中以反應的前5-10個循環所產生的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省設置為3-8個循環的熒光信號的標準差的10倍。
在本發明提供豬鼻支原體快速定量檢測豬鼻支原體熒光定量PCR方法中，有一條兩端標記有熒光基團的特異性熒光探針，在探針完整時，兩基團在空間上距離相互靠近，5’端報告基團產生的熒光因熒光共振能量轉移而被3’端淬滅基因淬滅，因而體系中沒有熒光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針和模板特異性結合，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’ -3’外切活性對探針進行切割釋放出報告基團，這樣破壞了兩個基團之間的熒光共振能量轉移，報告基團所釋放的熒光可以被內置在定量檢測儀內的熒光計檢測，熒光量的增加與PCR產物的積累量呈比例關系。對豬鼻支原體的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中熒光量的積累超過基底熒光量的循環圈數，Ct值與起始模板數呈一定比例關系，Ct值越小，起始模板數越多，反之，Ct值越大，起始模板數越少。利用陽性梯度標準模板的Ct值制成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數。本發明的豬鼻支原體熒光定量PCR檢測方法，主要包括下列步驟I)制備標準陽性質粒，并用紫外分光光度計定量；2)提取豬鼻支原體樣品的DNA，低溫保存備用；3)分別取2)步中的DNA和同樣量的系列稀釋的I)步中的陽性標準品加入到含Taq DNA聚合酶和熒光定量反應液的PCR反應體系中用熒光定量PCR檢測；

4)通過比較待測樣品和標準品的循環域值而對待測樣品的起始拷貝數進行定量。用本發明中提供的引物和探針制備的豬鼻支原體熒光定量PCR檢測試劑盒，試劑盒可對豬鼻支原體進行定量檢測。實施例I :豬鼻支原體熒光定量PCR檢測方法的建立I.提取江蘇某豬場豬肺組織分離培養豬鼻支原體陽性樣品的DNA及標準陽性模板PM-37DNA，低溫保存備用；本發明使用的豬鼻支原體樣品的DNA，可按常規方法提取，具體方法是在提取含有豬鼻支原體的豬肺組織后再按下述步驟進行I)加IOOmg組織至600 μ I蛋白裂解液,再加入蛋白酶K3 μ I (20mgml),RNase抑制酶3 μ I (10mg/ml),混勻，55°C水浴2-3小時，期間振搖數次。2)力口等體積的酌·:氯仿:異戍醇(25 24 :1),輕振IOmin, I, 2000rpm離心5min。3)取上清(約 300 μ 1)，加氯仿 600 μ 1,1，2000rpm 離心 5min。4)取上清(約 200 μ 1)，加氯仿 600 μ 1,1，2000rpm 離心 5min。5)取上清(約200 μ I )，加2倍的無水乙醇，O. 4倍的5mol/L的醋酸銨，輕輕顛倒混勻，放置20min.6)1，2000rpm 離心 5min,棄上清，加入 70% 乙醇，洗 2 次(I, 2000rpm 離心 lmin)。7)加50 μ I的滅菌去離子水或者TE溶液。得本發明所需要使用的豬鼻支原體樣品的DNA。2. PCR引物及探針查詢分析國際上已報道的豬鼻支原體的核苷酸序列，選取豬鼻支原體Ρ37基因的保守序列作為PCR擴增的靶序列P37-F 5/ -AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3'P37-R 5' -TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3'預期擴增產物為79bp。根據引物之間的序列設計合成了一條分子信標5，-FAM-ATCAGCAACAAAACCTT-MGB-3，，在其 5，端標記熒光染料 FAM，而 3，端則標記熒光淬滅劑MGB。3. PCR擴增反應反應體系為
無菌雙蒸水8μ1
2 X反應預混液(含Taq酶、dNTP及緩沖液) 12.5μ1
引物 I (20μΜ)Ιμ 引物 2(20μΜ) Ιμ 分廣信標探針(20μΜ) Ιμ
校」Π染料Rox0.5 μ
標準_性模板ρΜ-Ρ37或樣品模板DNAIμ 反應條件為95 V預處理IOmin,進行40個循環反應，每個循環反應包括 950C 15s，53。。lmin，于 53°C 時測定熒光值。4.靈敏度實驗將鑒定好的質粒，分光光度計測定其濃度，并計算出拷貝數，然后分別稀釋成I. 0X108、1. 0X107、1. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、1. 0X103、1. 0X102、1. OXlO1 拷貝 / μ I濃度梯度，按上述PCR反應體系和反應程序在熒光定量PCR儀進行擴增，經計算機分析得出不同拷貝數的Ct值，根據Ct值以及相應拷貝數的對數做出標準曲線。檢測結果表明，I. 0X108、1. 0X107、1. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、1. 0X103、1. 0X102、1. OXlO1 拷貝 / μ I的 Ct 值分別為 14. 45,17. 62,20. 88,23. 8,27. 95,30. 89,33. 95,37. 11，本發明方法的最低檢測下限為10拷貝/ml (參見圖I)。檢測樣品的豬鼻支原體含量為5 X IO4拷貝/ μ I。5.熒光PCR特異性試驗分別以健康豬DNA、豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬絮狀支原體、雞毒支原體、副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌的基因組DNA及豬瘟病毒、豬流感病毒(逯曉敏等，豬肺炎支原體套式PCR檢測方法的建立及應用，江蘇農業學報，2010，26 (I ):91-95)的核酸樣品為模板，在相同的條件下進行熒光定量PCR擴增，以檢測分子信標與目的DNA結合的特異性。結果表明，除豬鼻支原體出現陽性峰外，其他種屬DNA樣本均未起峰，說明豬鼻支原體熒光定量PCR特異性良好。
權利要求
1.一種豬鼻支原體熒光定量PCR檢測引物對和分子信標探針，其特征是， 引物 I :P37-F 5' -AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3' 引物 2:P37-R 5' -TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3' 分子信標探針5’ -FAM-ATCAGCAACAAAACCTT-MGB-3，
2.根據權利要求I所述的一種豬鼻支原體熒光定量PCR檢測定量PCR檢測引物對和分子信標探針，其特征在于，檢測過程中PCR擴增反應體系25μ I為無菌雙蒸水8μ1 2 X熒光定量PCR反應預混液12.5μ1 20μΜ 引物 IΙμ 20μΜ 引物 2Ιμ 20μΜ分子信標探針ιμ1校正染料Rox0.5 μ 標準陽性模板ρΜ-Ρ37或樣品模板DNAIμ 反應條件為95°C預處理IOmin,進行40個循環反應,每個循環反應包括95°C 15s,53°C lmin，于53°C時測定熒光值。
3.用權利要求I或2所述的引物對和分子信標探針制備豬鼻支原體熒光定量PCR檢測試劑盒。
全文摘要
本發明涉及一種實時熒光定量檢測豬鼻支原體的引物和探針，特別是用于豬鼻支原體的實時熒光定量PCR檢測，屬于生物技術領域。確定以豬鼻支原體P37基因保守區序列作為擴增靶序列，設計合成一對特異性引物和一條分子信標探針應用于豬鼻支原體的定量檢測。根據不同濃度梯度的陽性質粒制作的定量標準曲線可以看出，不同梯度定量模板數的對數值與Ct值之間有較好的相關關系，其相關系數為0.999；同時，該檢測方法具有很高的靈敏度，最低能檢測到10個拷貝的病原體。對其他病原進行檢測表明，該方法具有很好的特異性。
文檔編號C12R1/35GK102766699SQ20121029691
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月20日 優先權日2012年8月20日
發明者馮志新, 劉茂軍, 武昱孜, 熊祺琰, 白方方, 邵國青 申請人:江蘇省農業科學院