本發明涉及生物學和腫瘤學領域，更具體地涉及新型H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞系MMHRL1、及建立方法和應用。

背景技術：

人類疾病的發生和發展是一個非常復雜的過程。深入研究各類疾病的發病機制及臨床藥物治療效果，以達到預防和治愈各種疾病的目的，是人類堅持不懈的奮斗目標。但基于人道主義，不能采用直接對患者進行實驗的方法。而遵循動物保護法，可以通過動物實驗對各類疾病發生發展的規律和生命現象進行深入研究，以便達到控制人類疾病的發生發展進程，緩解患者的病痛，直至治愈疾病的目的。

在人類長期的摸索實踐中發現，臨床疾病研究將健康人體和患病人體作為研究對象難以推動醫學的快速和深入發展，而且存在人文、倫理、道德等諸多問題。另外，臨床疾病研究還存在大量樣本積累和長時間觀察等局限性。

人類疾病動物模型(Animal modle of human diseases)是指生物醫學研究中建立的具有人類疾病表現的實驗動物和材料。通過人類疾病動物模型研究人類疾病的發生和發展規律以及治療措施是現代生物醫學研究中至關重要的實驗方法和手段。其中，細胞培養已有百余年的歷史，是進行體外基礎醫學研究的重要方法。

隨著人們生活方式的改變、社會工業化進程和壽命的延長，腫瘤發病率也隨之升高，已成為威脅人類生命健康的主因之一。肝癌號稱“癌中之王”，是我國重點的防治病患，但其病因繁多、過程復雜、治愈率差，機制尚不清楚，仍有待于深入闡明。

目前，建立的人類肝癌細胞系已有數十種之多，但由于各個肝癌細胞系的來源背景復雜，分子機制各異，不利于對病因進行精準分析。另外，這些細胞系還存在成瘤能力有限、傳代不穩定等不足，也不利于肝腫瘤的基礎研究。小鼠是典型的人類疾病動物模型，可以通過建立單一病因誘發的原發性肝腫瘤動物模型對肝癌的病因學進行深入剖析。但由于小鼠的體內實驗費用高、耗時耗力，并且影響因素復雜，急需建立相應的小鼠肝腫瘤細胞系。但相比之下，小鼠肝腫瘤細胞系的建立較為困難。因此，目前可應用的小鼠肝腫瘤細胞系屈指可數。

所以，本研究領域迫切需要研發病因明確、傳代穩定、高成瘤性、適用于建立多種動物模型的小鼠肝腫瘤細胞系。

技術實現要素：

本發明目的在于為肝腫瘤基礎研究和臨床治療提供一種肝腫瘤細胞系，該細胞系具有傳代穩定、成瘤性好、適用于建立多種肝腫瘤動物模型。

本發明的另一個目的在于提供所述的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞系的制備方法以及用途。

在本項發明的第一方面，提供了一種H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞，所述肝腫瘤細胞是H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1，它保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:C2016192。

在本發明的第二方面，提供了本發明第一方面中所描述的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞的子代細胞，所描述子代細胞能夠導致裸鼠形成肝腫瘤。

在另一優選例中，所描述的子代細胞基本保留或完全保留親代H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1的特性。

在另一優選例中，所述的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1或其子代細胞具有如下特性：

(a)100％細胞表達H-ras12V轉基因；

(b)具有免疫缺陷小鼠皮下成瘤能力。

在本項發明的第三方面，提供了本發明上述的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1或其子代細胞的用途，它們可以被應用于裸鼠體內產生肝腫瘤。

在本發明的第四方面，提供了一種建立肝腫瘤動物模型的方法，包括步驟：

(a)將1×10⁶-1×10⁸的本發明上述的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1或其子代細胞接種于裸鼠體內；

(b)飼養步驟(a)的裸鼠14-90天，獲得肝腫瘤動物模型。

在另一優選例中，所述的接種是接種于以下部位：肝臟、腹腔、尾靜脈、皮下部位或者其組合。

在另一優選例中，步驟(b)中培養裸鼠7-100天，獲得肝腫瘤動物模型。

在本項發明的第五方面，提供了一種體外培養肝腫瘤細胞的方法，包括步驟：在合適的培養基中培養本發明上述的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1或其子代細胞。

在本發明的第六方面，提供了一種篩選治療肝腫瘤的候選藥物的方法，它包括步驟：

(a)將1×10⁶-1×10⁸的本發明上述的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1或其子代細胞接種于裸鼠；

(b)飼養步驟(a)的裸鼠14-90天，獲得肝腫瘤動物模型；

(c)將測試藥物應用于步驟(b)中獲得的肝腫瘤動物模型，并與未應用藥物的步驟(b)中獲得的肝腫瘤動物模型進行比較，其中應用后導致肝腫瘤癥狀改善或治愈的測試藥物就是治療肝腫瘤的候選藥物。

在另一優選例中，在步驟(c)中，將測試化合物的用藥方式有如下選擇：局部給藥于肝腫瘤病灶部位、靜脈給藥、口服給藥。

在本發明的第七方面，提供了用本發明上述方法制備的形成的肝腫瘤模型動物。

應理解，在本發明范圍內，本發明的上述各項技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以相互組合，從而構成新的或優選的技術方案，限于篇幅，在此不再一一描述。

附圖說明

圖1顯示了本發明H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系MMHRL1的培養情況。圖1A顯示了半干法培養12天時細胞爬出肝腫瘤組織塊形成腫瘤細胞團的情況(200×)；圖1B顯示了本發明H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系MMHRL1細胞培養至第20代的生長形態(200×)。

圖2顯示了本發明H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系MMHRL1的細胞形態及增殖情況。圖2A顯示了本發明H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系MMHRL1的細胞形態(400×),；圖2B顯示了本發明H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系MMHRL1的增殖情況。

圖3顯示了本發明H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系MMHRL1的H-ras12V轉基因的基因型鑒定和表達水平的檢測。

圖4顯示了本發明H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系MMHRL1的信號通路活化水平的Western Blot檢測結果。

圖5顯示了本發明H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系MMHRL1皮下接種裸鼠成瘤的實驗結果。

具體實施方式

本發明人經過廣泛而深入的研究，對一只H-ras12V轉基因雄性小鼠的肝腫瘤樣本進行原代培養，最后建立了具有無限增殖能力的H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系MMHRL1。在此基礎上完成了本項發明。

具體而言，本發明人將一只H-ras12V轉基因雄性小鼠的肝腫瘤組織進行體外培養，建立相應的體外細胞系。

對細胞系進行相關的生物學檢測鑒定。篩選得到一種純種H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系MMHRL1。該細胞系生長穩定(已經穩定傳代至80代)，并且該細胞系在光學顯微鏡下的形態學特征均一。

動物學實驗表明，該H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系MMHRL1接種于裸鼠后可導致裸鼠產生腫瘤，其組織病理形態學與H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤組織相一致。

本發明的H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系MMHRL1不僅能夠制備肝腫瘤動物模型，而且能夠用于篩選治療肝腫瘤的候選藥物。

一種優選的篩選治療肝腫瘤(或肝腫瘤細胞生長)的候選藥物的方法，包括步驟：

(a)在測試組中，在H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1的培養體系中添加測試化合物，并且觀察H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1的細胞數量和/或生長情況；在對照組中，在H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1的培養體系中不添加測試化合物，并且觀察H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1的細胞數量和/或生長情況；

其中，如果測試組中H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞MMHRL1的數量或生長速度超過對照組(存在顯著性差異)，則提示，該測試候選藥物對肝腫瘤細胞的生長或增殖具有促進作用。

在另一優選例中，所描述的小于表示測試組與對照組的數量之比或者生長速度之比≤0.8，或更佳比為≤0.4。

在另一優選例中，所描述的大于表示測試組與對照組的數量之比或生長速度之比≥2.5，或更佳之比為≥0.5。

在另一優選例中，所描述的顯著性差異為P<0.05.

一種優選的篩選治療肝腫瘤的候選藥物的方法，包括步驟：

(a)將1×10⁶-1×10⁸(較佳的1×10⁶-1×10⁷，更佳的1×10⁷-1×10⁸)上述的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1接種于裸鼠；

(b)飼養步驟(a)的裸鼠14-90天，獲得肝腫瘤動物模型；

(c)將測試藥物施用于步驟(b)的肝腫瘤動物模型，并與未施用測試藥物的步驟(b)的肝腫瘤動物模型進行比較，其中，施用后能夠使得肝腫瘤動物模型肝腫瘤癥狀出現好轉或者治愈的測試藥物可以認為是治療肝腫瘤的候選藥物。

本發明的主要優點在于：

(a)本發明的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1來自H-ras12V轉基因雄性小鼠；

(b)本發明的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1性狀穩定，能夠穩定進行多次傳代；

(c)本發明的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1成瘤性良好，肝腫瘤發病原因和遺傳特性明確，是研究肝腫瘤機制和臨床前期試用的理想細胞系；

(d)本發明的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1可進行肝腫瘤相關基因的體外研究；

(e)本發明的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1可進行肝腫瘤敏感性藥物的體外篩選。

下面結合具體實施例，進一步闡述本項發明。應理解，以下實施例僅用于說明本項發明，而不是用于限制本項發明的范圍。以下實施例中，未標注具體實驗條件的實驗方法，按照常規實驗條件或按照制造廠家建議實驗條件完成實驗。除非標注說明，否則百分比以及份數是重量百分比和重量份數。

實施例1

H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1的建立

(a)來源

H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞系來自于H-ras12V轉基因雄性小鼠，其具體信息如下表所示。

表1

取得該H-ras12V轉基因雄性小鼠原發性肝腫瘤組織，直接進行肝腫瘤組織體外培養，反復進行消化和傳代，最終獲得穩定傳代的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞系。具體包括以下過程：

無痛苦處死上述H-ras12V轉基因雄性小鼠，無菌術切下肝腫瘤。將肝腫瘤置于裝有常溫滅菌生理鹽水的10cm培養皿中，充分清理掉腫瘤包膜，使用手術刀將上述操作后留取的肝腫瘤組織切割至1×1×1mm³大小的組織塊，加入肝腫瘤組織培養液通過半干法培養。肝腫瘤組織培養液成分為DMEM high glucose培養基，添加10％熱滅活胎牛血清、100IU/ml青-鏈霉素、50mg/ml慶大霉素。新接種的肝腫瘤組織塊24h后換液，H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞培養過程中隔72h換液。半干法培養12天后即可以在肝腫瘤組織塊周圍觀察到有細胞爬出。此時對上述肝腫瘤組織進行常規細胞培養消化、鋪板，并在多次消化、鋪板過程中去除原有肝腫瘤組織培養中的成纖維細胞。原代細胞第一次傳代至第10代時即能夠得到大量形態均一的上皮樣細胞，命名為MMHRL1。

目前，H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1已經傳代至第80代，細胞生長情況穩定，狀態良好，還在繼續傳代和培養中(圖1B和圖2A)。

獲得的該株H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1于2016年11月08日保藏與中國典型培養物保藏中心(CCTCC)(武漢·中國)，保藏號為CCTCC NO：C2016103，保藏地址：湖北省武漢市武昌區珞珈山（八一路299號）。

實施例2

H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1的生物學特性

在本實施例中，使用常規方法對保藏號為CCTCC NO:C2016103的純種H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1進生物學特性的檢測，結果如下：

2.1細胞形態

普通光學顯微鏡下觀察H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1，可見肝腫瘤細胞多數為圓形或多邊形，細胞形態均一(圖2A)。使用Cell Counting Kit-8(CCK8試劑盒)，檢測該細胞系增殖狀態，操作完全按照試劑盒操作指南進行(圖2B)。細胞穩定增殖。

2.2H-ras12V轉基因的基因型鑒定

取實施例1中獲得的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1(保藏號：C2016103)，經消化液(0.25％胰酶、0.02％EDTA、pH7.3)消化后，收集，提取基因組DNA和總RNA，進行RAS轉基因基因型的PCR定性鑒定和RAS基因表達的RT-PCR檢測。

(a)RAS轉基因PCR定性鑒定方法：

提取H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系細胞MMHRL1基因組DNA，進行普通PCR，上樣量如下表2，結果見圖3A

表2

(b)RAS轉基因RT-PCR定量檢測方法：

提取H-ras12V轉基因雄性小鼠細胞系細胞MMHRL1mRNA，按照(a)中方法合成cDNA，后進行RT-PCR，上樣量如下表3，結果見圖3B

表3

2.3H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1細胞的Western Blot檢測

本實施例中對H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1細胞進行Western Blot檢測。結果如圖4所示。

結果表明：H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1細胞的MEK/ERK和AKT/mTOR信號通路顯著激活。

實施例3

使用H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1建立肝腫瘤動物模型

取實施例1中獲得的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1(保藏號：C2016103)，經消化液(0.25％胰酶、0.02％EDTA、pH7.3)消化后，收集并計數，按照1×10⁶或者1×10⁸細胞數量/只小鼠接種于小鼠右側腋下皮下部位，接種小鼠為5只5周齡裸鼠。

接種后14-60天之間，5只小鼠均陸續發生腫瘤。用實施例2相同的方法進行生物學檢測，證實在動物模型上誘發肝細胞肝腫瘤。結果如圖5所示。

細胞系保藏

本發明的H-ras12V轉基因雄性小鼠肝腫瘤細胞MMHRL1，于2016年11月08日保藏在中國典型培養物保藏中心(武漢·中國)，保藏號為CCTCC NO：C2016103。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 大連醫科大學

<120> MMHRL1轉基因小鼠肝腫瘤細胞系的建立及應用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工設計

<220>

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<222> (1)..(22)

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<211> 19

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工設計

<220>

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<222> (1)..(23)

<400> 6

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