本發(fā)明屬于干細胞領(lǐng)域，涉及預(yù)示間充質(zhì)干細胞定向分化潛能的標志物、試劑及試劑盒。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種多潛能成體干細胞，在人體發(fā)生、發(fā)育過程中存在于許多種組織中。20世紀70年代中期，F(xiàn)riedenstein等人[Friedenstein A J,Gorskaja J F,Kulagina N N.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs.Exp Hematol,1976,4(5):267-274]從骨髓中獲得了少數(shù)能貼壁生長的細胞，這些細胞能分化為成骨或軟骨樣的沉著物，該發(fā)現(xiàn)被認為首次證實了MSCs的存在。目前，已經(jīng)從成人的多種間充質(zhì)組織中分離得到MSCs，這些細胞在體外可以擴增并且可以分化為骨、軟骨、骨髓基質(zhì)、肌腱、韌帶、脂肪等多種結(jié)締組織細胞，以及骨骼肌細胞、神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等等[Reyes M,Lund T,Lenvik T,et al.Purification and ex vivo expansion ofpostnatal human marrow mesodermal progenitor cells.Blood,2001,98:2615-2625]。而且，不論是自體的還是同種異源的MSCs一般都不會引起宿主的免疫反應(yīng)[Barry F P,Murphy J M.Mesenchymal stem cells:clinical applications and biological characterization.Int J Biochem Cell Biol,2004,36(4):568-584]。因此，MSCs可以作為組織工程的種子細胞，用于組織構(gòu)建以治療一些機體無法自然修復(fù)的組織細胞損傷，有著良好的臨床應(yīng)用前景。

MSCs的分化潛能有大量研究報道。一方面，體外實驗顯示在特定培養(yǎng)條件下，MSCs可分化為中胚層起源的成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞；內(nèi)胚層起源的肝細胞、胰島β細胞；外胚層起源的視網(wǎng)膜細胞、神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等。另一方面，動物實驗和臨床表明，將全骨髓或初步純化的骨髓MSCs移植入損傷或轉(zhuǎn)基因動物及病人體內(nèi)，骨髓干細胞可遷移并分化為骨骼肌細胞、心肌細胞、肝細胞、膽管細胞、表皮細胞、消化管細胞、肺泡細胞、胰島β細胞、腎細胞、神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等[Grove J E,Bruscia E,Krause D S.Plasticity ofbone marrow-derived stem cells.Stem Cells,2004,22(4):487-500]。

由于MSCs的增殖能力和定向誘導(dǎo)分化潛能，使其在矯形外科、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的治療中均顯示出良好的應(yīng)用前景。研究者試圖篩選出能體外誘導(dǎo)MSCs定向分化的誘導(dǎo)試劑，以有效控制MSCs的分化方向，獲得目標細胞或組織。目前，通常是用待篩選試劑對MSCs體外處理后，培養(yǎng)若干天，通過鑒別培養(yǎng)出的細胞是否具有靶細胞的生物學(xué)特點，確定該試劑是否具有誘導(dǎo)MSCs定向分化為目標細胞的能力。這種方法的缺點在于篩選時間長，篩選效率低，不適合高通量篩選。

細胞代謝組學(xué)可鑒定生化反應(yīng)的產(chǎn)物－內(nèi)源性小分子，揭示一個活細胞中所運轉(zhuǎn)的不同通路之間的聯(lián)系，并可反映和評價健康和病理機體之間的生化差異，反過來可為藥物干預(yù)提供一個方向。細胞代謝組學(xué)分析可定性、定量地描述胞內(nèi)調(diào)控的最終產(chǎn)物，這些產(chǎn)物是生物系統(tǒng)對遺傳因素或外界環(huán)境改變的最終應(yīng)答。細胞代謝組學(xué)研究表明，在強大的細胞代謝網(wǎng)絡(luò)中，生化途徑的能動行為可由一個高度互聯(lián)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)來控制。目前細胞代謝組學(xué)已經(jīng)在多種領(lǐng)域得到應(yīng)用，如毒理學(xué)[Predicting human developmental toxicity ofpharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics,Toxicol Appl Pharmacol.2010；247(1):18-27]、藥效評價[Metabolic profiling of HepG2cells incubated with S(-)and R(+)enantiomers of anti-coagulating drug warfarin.Metabolomics,2011,7(3):353-362]、細胞培養(yǎng)監(jiān)測[Metabolomics:a valuable tool for stem cell monitoring in regenerative medicine.Journal of the Royal Society Interface,2012,9(73):1713-24]、新藥研究[Pharmacometabolomics of docetaxel-treated human MCF7breast cancer cells provides evidence of varying cellular responses at high and low doses.Breast Cancer Research and Treatment,2010,120(3):613-626]、生物制藥生產(chǎn)[LC-MS-based metabolic characterization of high monoclonal antibody-producing Chinese hamster ovary cells.Biotechnology and Bioengineering,2012,109(12):3103–3111]等。與其他方法相比，體外細胞代謝組學(xué)表現(xiàn)出更多的優(yōu)勢，如容易控制實驗變化、高度重現(xiàn)性、低成本、結(jié)果更易解釋等。

如果能通過細胞代謝組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)MSCs在誘導(dǎo)分化前、后胞內(nèi)代謝物的差異，尋找到可以預(yù)測MSCs定向分化潛能的標志物，就有可能在MSCs經(jīng)誘導(dǎo)試劑處理后迅速得知該誘導(dǎo)試劑的定向誘導(dǎo)效果，而不用培養(yǎng)數(shù)天后通過細胞生物學(xué)特點才能得出結(jié)論，必然可以提高篩選定向分化誘導(dǎo)試劑的效率，實現(xiàn)高通量篩選。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種預(yù)示間充質(zhì)干細胞定向分化潛能的標志物、試劑及試劑盒，以即時預(yù)測經(jīng)定向誘導(dǎo)處理的MSCs是否具備定向分化為目標細胞的能力，不用培養(yǎng)數(shù)天后通過細胞生物學(xué)特點才能得出結(jié)論，進而提高篩選定向分化誘導(dǎo)試劑的效率，實現(xiàn)高通量篩選。

技術(shù)方案公布如下：

一組用于預(yù)示間充質(zhì)干細胞定向分化為心肌樣細胞的潛能的標志物，由α-酮戊二酸、磷酸二羥丙酮、天冬酰胺和花生四烯酸組成。

進一步地，所述間充質(zhì)干細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。

一種用于預(yù)示間充質(zhì)干細胞定向分化為心肌樣細胞的潛能的試劑，含有上述的標志物。

進一步地，所述間充質(zhì)干細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。

一種用于預(yù)示間充質(zhì)干細胞定向分化為心肌樣細胞的潛能的試劑盒，含有上述的標志物。

進一步地，所述間充質(zhì)干細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。

一種篩選能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞的誘導(dǎo)劑的方法：測定該誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)處理后的間充質(zhì)干細胞中α-酮戊二酸、磷酸二羥丙酮、天冬酰胺和花生四烯酸的含量，并與未經(jīng)誘導(dǎo)處理的間充質(zhì)干細胞比較，需同時滿足α-酮戊二酸上調(diào)≥4.3倍、磷酸二羥丙酮上調(diào)≥3.6倍、天冬酰胺上調(diào)≥1.7倍、花生四烯酸上調(diào)≥2.1倍。

進一步地，所述間充質(zhì)干細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。

一組用于預(yù)示間充質(zhì)干細胞定向分化為神經(jīng)元樣細胞的潛能的標志物，由苯丙氨酸、半胱氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸組成。

進一步地，所述間充質(zhì)干細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。

一種用于預(yù)示間充質(zhì)干細胞定向分化為神經(jīng)元樣細胞的潛能的試劑，含有上述的標志物。

進一步地，所述間充質(zhì)干細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。

一種用于預(yù)示間充質(zhì)干細胞定向分化為神經(jīng)元樣細胞的潛能的試劑盒，含有上述標志物。

進一步地，所述間充質(zhì)干細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。

一種篩選能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的誘導(dǎo)劑的方法：測定該誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)處理后的間充質(zhì)干細胞中苯丙氨酸、半胱氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸的含量，并與未經(jīng)誘導(dǎo)處理的間充質(zhì)干細胞比較，需同時滿足苯丙氨酸上調(diào)≥3.7倍、半胱氨酸上調(diào)≥3.2倍、磷酸烯醇式丙酮酸上調(diào)≥2.5倍、草酰乙酸上調(diào)≥3.4倍。

進一步地，所述間充質(zhì)干細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。

發(fā)明效果：

本發(fā)明創(chuàng)造提供的標志物α-酮戊二酸、磷酸二羥丙酮、天冬酰胺和花生四烯酸可以聯(lián)合作為預(yù)示骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCs定向分化為心肌細胞的潛能的標志物，準確性高，效率高；本發(fā)明標志物苯丙氨酸、半胱氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸可以聯(lián)合作為預(yù)示骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCs定向分化為神經(jīng)元樣細胞的潛能的標志物，準確性高，效率高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明標志物發(fā)現(xiàn)和驗證方法邏輯框圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例介紹本發(fā)明的技術(shù)方案。下述實施例中未特別強調(diào)的實驗材料均為常規(guī)實驗材料，無特別要求，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的常規(guī)材料。

實施例1：預(yù)示骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCs定向分化為心肌細胞的潛能的標志物發(fā)現(xiàn)

一、實驗依據(jù)(誘導(dǎo)劑：5-氮雜胞苷、血管緊張素Ⅱ、二甲基亞砜)

5-氮雜胞苷[李雪等，5-氮雜胞苷誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌細胞的實驗研究，心臟雜志2004,15(6)]、血管緊張素Ⅱ[石靜寶等，不同濃度血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞的定向分化，中國組織工程研究第18卷第50期]、二甲基亞砜[孫龍云，二甲基亞砜誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌細胞的分化，中國組織工程研究第20卷第1期]是本領(lǐng)域公認的可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCs定向分化為心肌細胞的誘導(dǎo)劑。因此，本實施例選擇這三種物質(zhì)作為誘導(dǎo)劑，通過細胞代謝組學(xué)的方法測定BMSCs誘導(dǎo)前后的差異代謝物，尋找可以預(yù)示骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCs定向分化為心肌細胞的潛能的標志物。

二、實驗方法

1、BMSCs的分離培養(yǎng)

將大鼠移至無菌操作間內(nèi)，用無菌器械剝離出四肢長骨，保留骨骺端。用含有雙抗(青霉素10⁵U/L，鏈霉素100mg/L)的D-Hank’s液沖洗大鼠長骨兩次。另取一套無菌器械去除長骨骨骺端顯露骨髓腔，以IMDM培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10％胎牛血清)反復(fù)沖洗骨髓腔，收集沖洗液經(jīng)無菌濾膜過濾，取一滴細胞懸液加入10μL 0.04％錐蟲藍混勻，血細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞，然后調(diào)整接種細胞濃度為1×10⁴L^-1，接種于無菌培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分數(shù)5％CO₂的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12h后半量換液，輕柔操作，仔細觀察細胞貼壁情況，至24h完全更換培養(yǎng)基。此后每隔2d換液，當貼壁細胞均勻鋪滿瓶底90％時，即進行傳代。

2、BMSCs的分組和體外誘導(dǎo)

A：5-氮雜胞苷體外誘導(dǎo)。將生長良好、形態(tài)均一的第2代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)48h后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次以除凈殘余生長培養(yǎng)基，分為添加10μmol/L誘導(dǎo)劑5-氮雜胞苷的5-氮雜胞苷誘導(dǎo)組和不加誘導(dǎo)劑的空白對照A組。5-氮雜胞苷誘導(dǎo)組、空白對照A組分別設(shè)23個重復(fù)，其中3個重復(fù)誘導(dǎo)24h后，去除誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入不含誘導(dǎo)劑的普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4周，用于傳統(tǒng)指標的觀察，以確保5-氮雜胞苷可以成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞。剩余20個重復(fù)分別編號為5-AT 1～20和Blank A 1～20，誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后對細胞進行處理用于代謝分析，處理及分析方法見下。

B：血管緊張素Ⅱ體外誘導(dǎo)。將生長良好、形態(tài)均一的第2代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)48h后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次以除凈殘余生長培養(yǎng)基，分為添加0.2μmol/L誘導(dǎo)劑血管緊張素Ⅱ的血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)組和不加誘導(dǎo)劑的空白對照B組。血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)組、空白對照B組分別設(shè)23個重復(fù)，其中3個重復(fù)誘導(dǎo)24h后，去除誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入不含誘導(dǎo)劑的普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4周，用于傳統(tǒng)指標的觀察，以確保血管緊張素Ⅱ可以成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞。剩余20個重復(fù)分別編號為ANT 1～20和Blank B 1～20，誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后對細胞進行處理用于代謝分析，處理及分析方法見下。

C：二甲基亞砜體外誘導(dǎo)。將生長良好、形態(tài)均一的第2代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)48h后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次以除凈殘余生長培養(yǎng)基，分為添加1.0％誘導(dǎo)劑二甲基亞砜的二甲基亞砜誘導(dǎo)組和不加誘導(dǎo)劑的空白對照C組。二甲基亞砜誘導(dǎo)組、空白對照C組分別設(shè)23個重復(fù)，其中3個重復(fù)誘導(dǎo)24h后，去除誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入不含誘導(dǎo)劑的普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4周，用于傳統(tǒng)指標的觀察，以確保二甲基亞砜可以成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞。剩余20個重復(fù)分別編號為DMSO 1～20和Blank C 1～20，誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后對細胞進行處理用于代謝分析，處理及分析方法見下。

訓(xùn)練集：5-AT 1～20和Blank A 1～20、ANT 1～20和Blank B 1～20、DMSO 1～20和Blank C1～20共同組成訓(xùn)練集。

3、細胞樣品的取出和前處理

各誘導(dǎo)組和空白組誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后將細胞消化制成不含誘導(dǎo)劑的單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10⁶個/mL，轉(zhuǎn)到凍存管中(每管1.5mL)，加入100μL血清和100μLDMSO，最終放在-80℃冰箱保存。

將凍存在-80℃的細胞樣品取出來，迅速放在37℃溫水中恒溫解凍，25℃條件下3000rpm離心5min；將上清的培養(yǎng)基去掉，沉淀加入1mL的PBS溶液搖晃潤洗30s使之懸浮，同樣采取上述條件離心后，棄去上清液；上述沉淀再次加入1.5mL的PBS搖晃30s懸浮后，再經(jīng)過上述條件離心后，去掉上清PBS溶液；加入-80℃甲醇0.5mL，對細胞樣品進行破碎提取；將樣品放在-80℃冰箱30min，取出使之溶化，置超聲儀中超聲1min；再于4℃條件10000rpm離心10min，取上清，氮氣常溫吹干樣品，置-80℃冰箱保存；進樣前30min將樣品取出，以100μL的10％乙腈復(fù)溶后，4℃條件10000rpm離心10min，取上清進樣分析。

4、細胞樣品LC-MS分析條件

色譜系統(tǒng)：Waters Acquity HPLC/Q-TOF；

色譜柱：Phenomenex Luna C18(4.6mm×150mm×3μm)；

流動相：A相為水(含5mM己胺，乙酸調(diào)節(jié)pH至5.5)；B相為乙腈-水(乙腈和水體積比為8:2；水中含20mM乙酸銨，氨水調(diào)節(jié)pH至8.5)；

梯度條件：0-20min，10-25％B；20-35min，25-95％B；35-40min，95％B；40-45min，95-10％B；45-50min，10％B；

流速：0.8mL/min；柱溫：35℃；

MS條件：Q-TOF/MS ESI離子源，負離子模式，掃描范圍m/z 50-1500；毛細管電壓3.0kV，錐孔電壓35kV，離子源溫度100℃，干燥氣溫度為350℃，流速800L/h，錐孔氣流量50L/h。

5、誘導(dǎo)組與空白對照組差異代謝物的篩選

定性分析。將LC-MS得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA軟件(version 13.0.2，Umetrics)進行多元統(tǒng)計分析。通過建立OPLS-DA模型，尋找誘導(dǎo)組(包括樣品5-AT 1～20、ANT 1～20和DMSO1～20，共60個樣品)和空白對照組(包括樣品Blank A 1～20、Blank B 1～20和Blank C 1～20，共60個樣品)之間代謝輪廓貢獻較大(VIP＞1.0且p＜0.01)的代謝物，然后將這些代謝物的分子量數(shù)據(jù)提交至在線數(shù)據(jù)庫KEGG(http://wwwkeg.com)、METLIN(http://www.metlin.scipps.edu)、HMDB(http://www.hmdb.ca)搜尋，解析化合物質(zhì)譜，對化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，最終通過這些化合物標準品確證差異代謝物的結(jié)構(gòu)。

定量分析。通過Q-q-Q質(zhì)譜對差異代謝物定量分析，統(tǒng)計誘導(dǎo)組中差異代謝物相對于空白對照組的變化倍數(shù)。

6、用測試集驗證標志物

測試集樣品的制備：按照訓(xùn)練集樣品的制備方法，制備測試集樣品，包括誘導(dǎo)組5-AT31～90、ANT 31～90、DMSO 31～90和空白對照組Blank A 31～90、Blank B 31～90和Blank C31～90，共180個誘導(dǎo)樣品和180個空白對照樣品。

用上述差異代謝物區(qū)分誘導(dǎo)樣品和空白樣品的能力，得到可以用于區(qū)分誘導(dǎo)樣品和空白對照樣品進而用于預(yù)示骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為心肌細胞的潛能的標志物。

三、實驗結(jié)果

1、原代骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)

骨髓懸液中原代細胞呈懸浮狀態(tài)，大小不一，數(shù)目較多，并混有大量紅細胞；接種24h后，可見有少部分細胞貼壁，多呈類圓形或紡錘形，換液后去除未貼壁的細胞。此后每隔2d換液，貼壁細胞逐漸伸出突起，呈扁平三角形或多邊形，核大而飽滿。10d后細胞胞體呈現(xiàn)典型的成纖維細胞狀，核圓形或橢圓形，位于細胞中心，多數(shù)細胞排布規(guī)則呈放射狀生長。14d左右細胞集落融合超過90％時即可傳代。傳代后的細胞生長迅速，排列較為一致。

2、體外誘導(dǎo)四周后形態(tài)學(xué)和標記物變化

2.1形態(tài)學(xué)變化

第2代骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)5-氮雜胞苷、血管緊張素Ⅱ、二甲基亞砜誘導(dǎo)后，細胞形態(tài)漸漸出現(xiàn)與空白對照A、B、C組不同的形態(tài)。各誘導(dǎo)組的骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)7d時形態(tài)轉(zhuǎn)變成類長柱形，28d時細胞體積變小，細胞呈片狀生長，排列一致，呈心肌樣特征。對照組未見類似上述改變，隨換液和傳代次數(shù)增多，對照組中細胞大部分為梭形。

2.2免疫細胞化學(xué)變化

各誘導(dǎo)組的骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)28d時，心肌特異性標記物cTnT、cTnI均呈陽性表達，空白對照A、B、C組心肌特異性標記物cTnT、cTnI均呈陰性表達。

各組心肌特異性抗原陽性細胞百分比見下表。

結(jié)果表明，5-氮雜胞苷、血管緊張素Ⅱ、二甲基亞砜可以有效誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞體外分化成心肌細胞，為有效誘導(dǎo)劑。

3、誘導(dǎo)組與空白對照組差異代謝物的篩選

通過定性和定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比，誘導(dǎo)組中α-酮戊二酸上調(diào)4.3～4.9倍，磷酸二羥丙酮上調(diào)3.6～4.4倍，天冬酰胺上調(diào)1.7～2.4倍，花生四烯酸上調(diào)2.1～2.7倍。

4、測試集驗證結(jié)果

從測試集中，隨機選擇30個空白對照樣品，測定其中α-酮戊二酸、磷酸二羥丙酮、天冬酰胺和花生四烯酸的含量各自取均值作為空白參考值。其余測試集樣品隨機分析，且分析人員不知道其分析的樣品是誘導(dǎo)樣品還是空白對照樣品，如果該樣品與空白參考值相比同時符合下述條件即歸為誘導(dǎo)樣品，否則為空白對照樣品：α-酮戊二酸上調(diào)≥4.3倍、磷酸二羥丙酮上調(diào)≥3.6倍、天冬酰胺上調(diào)≥1.7倍、花生四烯酸上調(diào)≥2.1倍。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法準確性非常高，能準確區(qū)分150個樣品為誘導(dǎo)樣品還是空白對照樣品，準確率100％，證明α-酮戊二酸、磷酸二羥丙酮、天冬酰胺和花生四烯酸可以聯(lián)合作為預(yù)示骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCs定向分化為心肌細胞的潛能的標志物。

該實施例表明：α-酮戊二酸、磷酸二羥丙酮、天冬酰胺和花生四烯酸聯(lián)合預(yù)示價值非常高，可以作為預(yù)示BMSCs定向分化為心肌細胞的潛能的標志物，用于高通量篩選可以誘導(dǎo)BMSCs定向分化為心肌細胞的誘導(dǎo)劑，效率高，不需等待數(shù)周才能獲知誘導(dǎo)結(jié)果。

發(fā)明人還考察了BMSCs不同培養(yǎng)基(含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)對標志物結(jié)果的影響，結(jié)果證明不同培養(yǎng)基并不影響上述結(jié)果。

實施例2：預(yù)示骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCs定向分化為神經(jīng)細胞的潛能的標志物發(fā)現(xiàn)

一、實驗依據(jù)(誘導(dǎo)劑：紅景天苷、全反式維甲酸、甲鈷胺)

紅景天苷[張全偉等，紅景天苷體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞，中國組織工程研究第16卷第14期]、全反式維甲酸[張全偉等，紅景天苷體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞，中國組織工程研究第16卷第14期]、甲鈷胺[羊明智等，甲鈷胺體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化，中國組織工程研究第17卷第32期]是本領(lǐng)域公認的可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCs定向分化為神經(jīng)元細胞的誘導(dǎo)劑。因此，本實施例選擇這三種物質(zhì)作為誘導(dǎo)劑，通過細胞代謝組學(xué)的方法測定BMSCs誘導(dǎo)前后的差異代謝物，尋找可以預(yù)示BMSCs定向分化為神經(jīng)元樣細胞的潛能的標志物。

二、實驗方法

1、BMSCs的分離培養(yǎng)

將大鼠移至無菌操作間內(nèi)，用無菌器械剝離出四肢長骨，保留骨骺端。用含有雙抗(青霉素10⁵U/L，鏈霉素100mg/L)的D-Hank’s液沖洗大鼠長骨兩次。另取一套無菌器械去除長骨骨骺端顯露骨髓腔，以IMDM培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10％胎牛血清)反復(fù)沖洗骨髓腔，收集沖洗液經(jīng)無菌濾膜過濾，取一滴細胞懸液加入10μL 0.04％錐蟲藍混勻，血細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞，然后調(diào)整接種細胞濃度為1×10⁴L^-1，接種于無菌培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分數(shù)5％CO₂的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12h后半量換液，輕柔操作，仔細觀察細胞貼壁情況，至24h完全更換培養(yǎng)基。此后每隔2d換液，當貼壁細胞均勻鋪滿瓶底90％時，即進行傳代。

2、BMSCs的分組和體外誘導(dǎo)

A：紅景天苷體外誘導(dǎo)。將生長良好、形態(tài)均一的第2代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)48h后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次以除凈殘余生長培養(yǎng)基，分為添加20mg/L誘導(dǎo)劑紅景天苷的紅景天苷誘導(dǎo)組和不加誘導(dǎo)劑的空白對照D組。紅景天苷誘導(dǎo)組、空白對照D組分別設(shè)23個重復(fù)，其中3個重復(fù)誘導(dǎo)24h后，去除誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入不含誘導(dǎo)劑的普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6天，用于傳統(tǒng)指標的觀察，以確保紅景天苷可以成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞。剩余20個重復(fù)分別編號為HJTG 1～20和Blank D 1～20，誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后對細胞進行處理用于代謝分析，處理及分析方法見下。

B：全反式維甲酸體外誘導(dǎo)。將生長良好、形態(tài)均一的第2代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)48h后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次以除凈殘余生長培養(yǎng)基，分為添加5μg/L誘導(dǎo)劑維甲酸的維甲酸誘導(dǎo)組和不加誘導(dǎo)劑的空白對照E組。維甲酸誘導(dǎo)組、空白對照E組分別設(shè)23個重復(fù)，其中3個重復(fù)誘導(dǎo)24h后，去除誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入不含誘導(dǎo)劑的普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6天，用于傳統(tǒng)指標的觀察，以確保維甲酸可以成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞。剩余20個重復(fù)分別編號為WJS 1～20和Blank E 1～20，誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后對細胞進行處理用于代謝分析，處理及分析方法見下。

C：甲鈷胺體外誘導(dǎo)。將生長良好、形態(tài)均一的第2代大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)48h后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次以除凈殘余生長培養(yǎng)基，分為添加100mg/L誘導(dǎo)劑甲鈷胺的甲鈷胺誘導(dǎo)組和不加誘導(dǎo)劑的空白對照F組。甲鈷胺誘導(dǎo)組、空白對照F組分別設(shè)23個重復(fù)，其中3個重復(fù)誘導(dǎo)24h后，去除誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入不含誘導(dǎo)劑的普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6天，用于傳統(tǒng)指標的觀察，以確保甲鈷胺可以成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞。剩余20個重復(fù)分別編號為JKA 1～20和Blank F 1～20，誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后對細胞進行處理用于代謝分析，處理及分析方法見下。

訓(xùn)練集：HJTG 1～20和Blank D 1～20、WJS 1～20和Blank E 1～20、JKA 1～20和Blank F 1～20共同組成訓(xùn)練集。

3、細胞樣品的取出和前處理

各誘導(dǎo)組和空白組誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后將細胞消化制成不含誘導(dǎo)劑的單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10⁶個/mL，轉(zhuǎn)到凍存管中(每管1.5mL)，加入100μL血清和100μLDMSO，最終放在-80℃冰箱保存。

將凍存在-80℃的細胞樣品取出來，迅速放在37℃溫水中恒溫解凍，25℃條件下3000rpm離心5min；將上清的培養(yǎng)基去掉，沉淀加入1mL的PBS溶液搖晃潤洗30s使之懸浮，同樣采取上述條件離心后，棄去上清液；上述沉淀再次加入1.5mL的PBS搖晃30s懸浮后，再經(jīng)過上述條件離心后，去掉上清PBS溶液；加入-80℃甲醇0.5mL，對細胞樣品進行破碎提取；將樣品放在-80℃冰箱30min，取出使之溶化，置超聲儀中超聲1min；再于4℃條件10000rpm離心10min，取上清，氮氣常溫吹干樣品，置-80℃冰箱保存；進樣前30min將樣品取出，以100μL的10％乙腈復(fù)溶后，4℃條件10000rpm離心10min，取上清進樣分析。

4、細胞樣品LC-MS分析條件

色譜系統(tǒng)：Waters Acquity HPLC/Q-TOF；

色譜柱：Phenomenex Luna C18(4.6mm×150mm×3μm)；

流動相：A相為水(含5mM己胺，乙酸調(diào)節(jié)pH至5.5)；B相為乙腈-水(乙腈和水體積比為8:2；水中含20mM乙酸銨，氨水調(diào)節(jié)pH至8.5)；

梯度條件：0-20min，10-25％B；20-35min，25-95％B；35-40min，95％B；40-45min，95-10％B；45-50min，10％B；

流速：0.8mL/min；柱溫：35℃；

MS條件：Q-TOF/MS ESI離子源，負離子模式，掃描范圍m/z 50-1500；毛細管電壓3.0kV，錐孔電壓35kV，離子源溫度100℃，干燥氣溫度為350℃，流速800L/h，錐孔氣流量50L/h。

5、誘導(dǎo)組與空白對照組差異代謝物的篩選

定性分析。將LC-MS得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA軟件(version 13.0.2，Umetrics)進行多元統(tǒng)計分析。通過建立OPLS-DA模型，尋找誘導(dǎo)組(包括樣品HJTG 1～20、WJS 1～20和JKA1～20，共60個樣品)和空白對照組(包括樣品Blank D 1～20、Blank E 1～20和Blank F 1～20，共60個樣品)之間代謝輪廓貢獻較大(VIP＞1.0且p＜0.01)的代謝物，然后將這些代謝物的分子量數(shù)據(jù)提交至在線數(shù)據(jù)庫KEGG(http://wwwkeg.com)、METLIN(http://www.metlin.scipps.edu)、HMDB(http://www.hmdb.ca)搜尋，解析化合物質(zhì)譜，對化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，最終通過這些化合物標準品確證差異代謝物的結(jié)構(gòu)。

定量分析。通過Q-q-Q質(zhì)譜對差異代謝物定量分析，統(tǒng)計誘導(dǎo)組中上述差異代謝物相對于空白對照組的變化倍數(shù)。

6、用測試集驗證標志物

測試集樣品的制備：按照訓(xùn)練集樣品的制備方法，制備測試集樣品，包括誘導(dǎo)組HJTG31～90、WJS 31～90、JKA 31～90和空白對照組Blank D 31～90、Blank E 31～90和Blank F 31～90，共180個誘導(dǎo)樣品和180個空白對照樣品。

用上述差異代謝物區(qū)分誘導(dǎo)樣品和空白樣品的能力，得到可以用于區(qū)分誘導(dǎo)樣品和空白樣品進而用于預(yù)示骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為神經(jīng)元樣細胞的潛能的標志物。

三、實驗結(jié)果

1、原代骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)

骨髓懸液中原代細胞呈懸浮狀態(tài)，大小不一，數(shù)目較多，并混有大量紅細胞；接種24h后，可見有少部分細胞貼壁，多呈類圓形或紡錘形，換液后去除未貼壁的細胞。此后每隔2d換液，貼壁細胞逐漸伸出突起，呈扁平三角形或多邊形，核大而飽滿。10d后細胞胞體呈現(xiàn)典型的成纖維細胞狀，核圓形或橢圓形，位于細胞中心，多數(shù)細胞排布規(guī)則呈放射狀生長。14d左右細胞集落融合超過90％時即可傳代。傳代后的細胞生長迅速，排列較為一致。

2、體外誘導(dǎo)四周后形態(tài)學(xué)和標記物變化

2.1形態(tài)學(xué)變化

利用免疫熒光法標記細胞骨架β-Tubulin觀察誘導(dǎo)前后細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。第2代骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)紅景天苷、全反式維甲酸、甲鈷胺誘導(dǎo)后，細胞形態(tài)漸漸出現(xiàn)與空白對照D、E、F組不同的形態(tài)。空白對照組BMSCs形態(tài)多呈多角形或紡錘形，紅景天苷、全反式維甲酸、甲鈷胺誘導(dǎo)12h時可見部分細胞胞體變大，有突起形成，24h后大多數(shù)細胞胞體普遍增大、可見2個以上不等的突起形成，誘導(dǎo)6d后形成典型的神經(jīng)樣細胞，胞體變小、突起細長。

2.2免疫細胞化學(xué)變化

各誘導(dǎo)組的骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)6d時，神經(jīng)細胞特異性標志分子NSE和β-Tubulin均呈陽性表達，空白對照D、E、F組NSE和β-Tubulin均呈陰性表達。陽性率見下表。

結(jié)果表明，紅景天苷、全反式維甲酸、甲鈷胺可以有效誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞體外分化成神經(jīng)元樣細胞，為有效誘導(dǎo)劑。

3、誘導(dǎo)組與空白對照組差異代謝物的篩選

通過定性和定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比，誘導(dǎo)組中苯丙氨酸上調(diào)3.7～4.3倍，半胱氨酸上調(diào)3.2～3.9倍，磷酸烯醇式丙酮酸上調(diào)2.5～2.9倍，草酰乙酸上調(diào)3.4～3.8倍。

4、測試集驗證結(jié)果

從測試集中，選擇30個空白對照樣品，測定其中苯丙氨酸、半胱氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸的含量各自取均值作為空白參考值。其余測試集樣品隨機分析，且分析人員不知道其分析的樣品是誘導(dǎo)樣品還是空白對照樣品，如果該樣品與空白參考值相比同時符合下述條件即歸為誘導(dǎo)樣品，否則為空白對照樣品：苯丙氨酸上調(diào)≥3.7倍、半胱氨酸上調(diào)≥3.2倍、磷酸烯醇式丙酮酸上調(diào)≥2.5倍、草酰乙酸上調(diào)≥3.4倍。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法準確性非常高，能準確區(qū)分150個樣品為誘導(dǎo)樣品還是空白對照樣品，準確率100％，苯丙氨酸、半胱氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸可以聯(lián)合作為預(yù)示骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCs定向分化為神經(jīng)元樣細胞的潛能的標志物。

該實施例表明：苯丙氨酸、半胱氨酸、磷酸烯醇式丙酮酸和草酰乙酸聯(lián)合預(yù)示價值非常高，可以作為預(yù)示BMSCs定向分化為神經(jīng)元樣細胞的潛能的標志物，用于高通量篩選可以誘導(dǎo)BMSCs定向分化為神經(jīng)細胞的誘導(dǎo)劑，效率高，不需等待數(shù)天才能獲知誘導(dǎo)結(jié)果。

發(fā)明人還考察了BMSCs不同培養(yǎng)基(含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)對標志物結(jié)果的影響，結(jié)果證明不同培養(yǎng)基并不影響上述結(jié)果。

上述具體實施例僅用于解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當明白，本發(fā)明的保護范圍并不受限于上述具體實施例。