本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種微藻異養培養方法，其中通過以銨鹽作為基礎氮源，以氨水作為pH調節劑和/或補充氮源而有效提高微藻生物量。
背景技術：
微藻因其富含蛋白質、脂類、多糖、維生素、抗氧化劑和其它功能性營養成分，在醫藥原料、保健食品及生物能源領域具有廣泛的應用。目前，微藻培養技術多集中于光自養體系，該培養體系存在生產效率低、占地面積大、收獲成本高等不足，嚴重制約了微藻產業的發展。通過人工大規模培養技術提高微藻生物量是微藻資源開發利用的關鍵。近年來，逐漸興起了微藻異養高細胞密度培養技術，該技術可以克服光培養體系對光的依賴，具有生長速度更快、能實現純種培養、細胞產率高、可大大降低下游后處理成本，更便于自動化控制等優勢，已成為近年來微藻培養研究的熱點。本領域需要一種高效的微藻異養高密度培養方法。
技術實現要素：
本發明提供了一種微藻例如柵藻的異養培養方法，所述方法特征在于使用銨鹽作為基礎氮源，以氨水作為pH調節劑和/或補充氮源。通過本發明的方法，可以有效地提高微藻例如柵藻的生物量。
附圖說明
圖1示出了六種不同實驗條件下柵藻細胞生物量濃度隨時間的變化情況。
發明詳述
在微藻異養培養過程中，維持pH恒定對微藻的快速生長至關重要。尿素、硝態氮(如硝酸鈉或硝酸鉀)[5]和銨態氮(氯化銨或硫酸銨)[6-7]是微藻培養過程中最常用的幾類氮源。微藻在利用銨態氮過程中隨著氮被消耗而pH會下降，現有培養模式下常用氫氧化鈉或氫氧化鉀[8]來維持pH恒定。但是，這些堿在實現調控pH調節的同時會伴隨鹽的生成，因此，發酵過程中隨著堿的添加，鹽濃度也就不斷增加，細胞生長將會受到抑制(高鹽濃度具有細胞滲透性使生物細胞脫水凋亡)。另外，微藻在利用尿素或硝態氮過程中會造成培養體系pH過高，于是現有培養模式常采用稀鹽酸[8]或硫酸[9]來調控pH。然而，酸的使用會嚴重腐蝕不銹鋼罐體及管道，進而影響設備的使用壽命。現有微藻異養培養模式均存在一定缺陷，包括細胞的增殖速度低和對設備的腐蝕問題，因而本領域仍然需要一種更實用、更高效的微藻異養高密度培養方法。
本發明人在研究中令人驚奇地發現，在微藻異養培養中，通過使用以銨鹽作為氮源的基礎培養基，在培養過程中使用氨水調節下降的pH值使之達到理想范圍，可以避免不利于微藻生長的鹽的生成，同時還能夠避免用尿素或硝態氮作為氮源時酸性pH調節劑對培養設備的腐蝕。
因此，在第一方面，本發明提供一種微藻異養培養方法，所述方法包括在初始培養中使用以銨鹽作為氮源的基礎培養基，且在培養過程中采用氨水調節pH值。在一些實施方案中，其中培養過程中使用以銨鹽為氮源或不含氮源的補料培養基進行補料。
如本發明所用，“氨水”是指氨氣的水溶液，由于氨氣在水中的溶解度在不同溫度下存在一定差別，因此氨水一般是指含氨10％-35％的水溶液。“基礎培養基”指的是用于接種微藻并起始培養的培養基。在使用基礎培養基進行初始培養一段時間后，通常需要加入補料培養基補償消耗掉的培養基成分。補料培養基通常是基礎培養基的濃縮物，不過各成分的比例可以變化。
適合微藻生長的pH值可以由本領域技術人員常規確定，這通常取決于所要培養的微藻物種。例如，對于柵藻如尖狀柵藻，培養過程中將pH控制在大約6.0±0.2。
此外，氨水本身也作為一種氮源，其在調控pH的同時可以向異養培養體系中補充適當的氮，從而可降低補料培養基中銨鹽的比例(即提高補料培養基中的碳氮比)。本發明令人驚奇地發現，在本發明的方法中，使補料培養基中的碳氮比高于基礎培養基中的碳氮比，可以獲得明顯更優的細胞生長指數。不受任何理論限制，降低補料培養基中的銨鹽比例(提高碳氮比)可以避免氨水在調控pH的同時使異養培養體系中的氮過剩，從而將整個培養過程中碳氮比維持在合適的范圍內。
如本發明所用，“碳氮比”是指培養基中碳的總含量與氮的總含量的質量比。
在一些實施方案中，其中所述以銨鹽為氮源的補料培養基的碳氮比大于所述基礎培養基的碳氮比。
在本發明的方法的一些實施方案中，其中所述基礎培養基的碳氮比為10:1至30:1。
在本發明的方法的一些實施方案中，其中所述以銨鹽為氮源的補料培養基的碳氮比是所述基礎培養基的碳氮比的5-40倍。在一些實施方案中，補料培養基中不含氮源。
在本發明的方法的一些實施方案中，其中所述銨鹽選自氯化銨和硫酸銨。
在本發明的方法的一些實施方案中，其中所述基礎培養基中的碳源濃度為大約5-40g/L，例如大約5g/L、大約10g/L、大約15g/L、大約20g/L、大約25g/L、大約30g/L、大約35g/L或大約40g/L。
此外，本發明人還令人驚奇地發現，與碳源濃度變化劇烈的脈沖式補料方式相比，在本發明的方法中，通過適時檢測培養體系的碳源濃度并結合調節流加速度大小，將培養過程中培養體系的碳源濃度的變化幅度控制在較小的范圍，可以避免脈沖式補料方式下碳源濃度短時間大幅波動對細胞生長的抑制作用，獲得更理想的平均生物質生產率。
因此在本發明的方法的一些實施方案中，包括在培養過程中使培養體系中碳源濃度的變化幅度小于或等于大約5g/L。
在本發明中“碳源濃度的變化幅度小于或等于大約5g/L”指的是任意兩次測量所得的碳源濃度之間的差值小于或等于大約5g/L。
在本發明的方法的一些實施方案中，所述培養過程的碳源濃度被控制在以下范圍：大約0-5g/L、大約5-10g/L、大約10-15g/L、大約15-20g/L、大約20-25g/L、大約25-30g/L或大約35-40g/L。在一些具體實施方案中，所述培養過程的碳源濃度被控制在大約2-5g/L。
在本發明的方法的一些實施方案中，其中在培養過程中通過階段式恒速流加方式向所述培養體系添加所述補料培養基。
在一些實施方案中，其中在培養過程中大約每0.5-3小時測量培養體系中的碳源濃度，并根據測得的碳源濃度調整補料速度，從而使培養體系碳源濃度的變化幅度小于或等于大約5g/L。
在一些實施方案中，所述補料速度為大約5g/小時-大約1000g/小時。本領域技術人員可以根據測得的碳源濃度以及培養體系的體積調節所述補料速度。例如，與培養體積相關的所述補料速度可選自大約0.5g/L/h-大約25g/L/h的范圍。
在一些實施方案中，其中所述基礎培養基和補料培養基中的碳源是葡萄糖。
在一些實施方案中，所述微藻選自小球藻(Chlorella)、眼蟲藻(Euglena gracilis)、柵藻(Scenedesmus)、扁藻(Tetraselmisgracilis)、菱形藻(Nitzschia)、富油新綠藻(Neochloris oleoabundans)、微擬球藻(Nannochloropsis)、杜氏藻(Dunaliella)。
在一些實施方案中，所述微藻是尖狀柵藻(Scenedesmus acuminatus)。
在一些實施方案中，所述微藻的初始接種量為大約5-20％(v/v)，例如大約5％(v/v)、大約10％(v/v)、大約15％(v/v)或大約20％(v/v)。
在一些實施方案中，所述微藻接種后的初始細胞干重為大約0.5g/L-大約5g/L。
在一些實施方案中，所述培養在大約25-40℃下進行。對于柵藻，例如尖狀柵藻，優選所述培養在30℃±2℃下進行。
在一些實施方案中，所述培養在大約10-60％，例如10％、20％、30％、40％、50％或60％的溶氧濃度下進行。
在本發明中，“溶氧濃度”是指培養基中所溶解的氧的量相對于培養條件下培養基中氧的飽和溶解度的百分比。溶氧濃度控制方法是溶氧轉速、氧氣偶聯。具體而言，溶氧轉速、氧氣偶聯的控制方法是：當培養體系中的溶氧值低于設定值時通過自動增加攪拌轉速，來提高通入氣體中氧氣在培養體系中的溶解，當轉速增加至設定最大值而溶氧濃度仍低于設定值時，再通過增加通氣(空氣和氧氣的混合氣體)中氧氣的比例，來增加溶氧；當培養體系中的溶氧濃度高于設定值時通過自動降低通氣中氧氣的比例，來降低溶氧；當氧氣比例降至0，通100％空氣時，溶氧濃度仍高于設定值時，再通過自動降低攪拌轉速方式進一步降低溶氧濃度，直至降至設定值。
在一些實施方案中，所述培養在大約5-100000L的生物反應器中進行，所述培養體系的初始體積為大約2-40000L。
術語“培養體系”是指微藻異養培養過程中的任意時刻，容納于異養培養容器中的物質總和。培養體系主要包含培養基和微藻細胞。
在一些實施方案中，所述方法中使用如表2和表3中所示的培養基。
在一個具體的方面，本發明提供一種異養培養柵藻，例如尖狀柵藻的方法，所述方法包括以下步驟：
a)將柵藻接種于固體活化培養基上，在光強30～50μmol m-2s-1，25℃±2℃下培養15-20天；
b)挑取步驟a)中獲得的柵藻至液體一級種子培養基中，在30℃±2℃下以大約150-220rpm的轉速培養120-144小時或培養至OD750＝8-12；
c)將步驟b)中獲得的柵藻以大約5-20％(v/v)的接種量接種于液體二級種子培養基中，在30℃±2℃下以大約150-220rpm的轉速培養72-84小時或培養至OD750＝16-20；
d)將步驟c)中獲得的柵藻以大約5-20％(v/v)的接種量接種于液體三級種子培養基中，在30℃±2℃下以大約150-220rpm的轉速培養72-84小時或培養至OD750＝20-22；
e)將步驟c)中獲得的柵藻以大約5-20％(v/v)的接種量接種于發酵罐中的以銨鹽例如氯化銨為氮源的異養基礎培養基中，在30℃±2℃下以大約10-60％的溶氧濃度進行培養，其中所述異養基礎培養基包含5-20g/L的初始葡萄糖濃度和10:1至30:1的碳氮比，所述發酵罐的攪拌速度設置為與溶氧濃度偶聯控制；
f)在步驟e)培養期間通過加入氨水控制培養體系的pH為大約6.0±0.2，且通過階段式恒速流加方式添加補料培養基，其中所述補料培養基的碳氮比是異養基礎培養基的5-40倍，其中大約每0.5-3小時測量培養體系中的葡萄糖濃度并根據測得的葡萄糖濃度調整補料速度，從而使葡萄糖濃度的變化幅度小于或等于大約5g/L；和
g)任選地，收獲所培養的柵藻。
在一些實施方案中，所述方法中使用的培養基如表1-3所示。
實施例
現參照下列意在舉例說明本發明(而非限定本發明)的實施例來描述本發明。
實驗材料的準備
藻株：尖狀柵藻(Scenedesmus acuminatus)(公開于[10-11])
柵藻培養過程中所用的各培養基組成和用量見下表1-3。
表1藻種制備培養基：
表2發酵罐基礎和補料培養基組成
表3各培養基母液組成
整個柵藻培養過程包括如下5個步驟：
1)藻種活化
在無菌環境下，用接種環從已培養好的平板上挑取柵藻單菌落，于滅菌平板上(培養基組成見表1)進行劃線，將劃線后的平板置于恒溫光照培養箱中進行培養，光強30～50μmol m-2s-1，培養溫度25℃，培養15-20天直至形成明顯的柵藻單菌落。
2)一級種子培養
從活化好的新鮮平板上，挑取一環柵藻(Φ2～3mm)于50mL三角瓶中(裝液量為15mL)進行振蕩培養，培養溫度30℃，轉速180rpm，培養120-144h(OD750＝8-12)。
3)二級種子培養
將培養好的一級種子液以10％(v/v)接種量接種于250mL二級搖瓶(裝液量100mL)中進行振蕩培養，培養溫度30℃，轉速180rpm，培養72～84h(OD750＝16-20)。
4)三級種子培養
將培養好的二級種子液以10％(v/v)接種量接種于1000mL三級搖瓶(裝液量300mL)中進行振蕩培養，培養溫度30℃，轉速180rpm，培養72-84h(OD750＝20-22)。
5)發酵罐培養
將培養好的三級搖瓶種子液以10％(v/v)接種量接種于7.5L發酵罐中，培養溫度30℃，通風比為1：1(vvm)，攪拌速度和溶解氧偶聯控制，溶解氧設定為40％，培養過程中用氨水控制pH于6.0。基礎培養基采用銨鹽作為氮源，碳源(葡萄糖)與氮源中的碳氮比為10:1-30:1，初始葡萄糖濃度為5g/L，分批培養過程中當培養過程中的葡萄糖濃度較初始濃度降低3-4g/L時，使用速度可調的蠕動泵流加補料液，補料培養基為基礎培養基的濃縮液，但其中碳氮比為基礎培養基碳氮比的5-40倍，適時監控測定葡萄糖濃度，根據葡萄糖濃度的變化適時調節補料速度，控制整個培養過程中的葡萄糖濃度在2-5g/L以內。當以獲得最大細胞干重為目的時，連續兩次取樣點樣品發酵干重不變或者開始下降時，發酵結束。
實驗中的測量方法：
取樣測量細胞濃度的方法：采用稱重法，即將發酵樣品稀釋至合適濃度(OD750＝2-10)后，取一定體積(1-5mL)加入經80℃烘干過夜稱重后的英國Whatman GF/C玻璃纖維濾膜上，經0.5M NaHCO3溶液沖洗抽濾后，80℃烘干過夜，計算細胞干重。
葡萄糖濃度的測量方法：將發酵樣品經離心后，取上清液，將上清液經適當稀釋后，采用安穩型血糖試紙條進行測定。
實施例1對照1(Control-1)
基礎培養基和補料培養基均以銨鹽(氯化銨)作為氮源，基礎培養基和補料培養基中碳氮比保持不變。初始葡萄糖濃度為5g/L。采用階段式恒速方式進行補料，整個培養過程中葡萄糖濃度控制在2-5g/L，培養過程中用3M NaOH調控pH恒定(6.0)。
實施例2對照2(Control-2)
基礎培養基和補料培養基均以尿素作為氮源，基礎培養基和補料培養基中碳氮比保持不變。初始葡萄糖濃度為5g/L。采用階段式恒速方式進行補料，整個培養過程中葡萄糖濃度控制在2-5g/L，培養過程中用1M HCl調控pH恒定在6.0。
實施例3實驗組1(Experiment-1)
基礎培養基以氯化銨作為氮源，補料培養基中無氮源，培養過程中用氨水調控pH在6.0并作為補充氮源。初始葡萄糖濃度為5g/L。采用階段式恒速方式進行補料，整個培養過程中葡萄糖濃度控制在2-5g/L。
實施例4實驗組2(Experiment-2)
基礎培養基和補料培養基以氯化銨作為氮源，補料培養基中碳氮比為基礎培養基碳氮比的20倍。初始葡萄糖濃度為5g/L。采用階段式恒速方式進行補料，整個培養過程中葡萄糖濃度控制在2-5g/L，采用氨水調控pH在6.0并作為補充氮源。
實施例5實驗組3(Experiment-3)
基礎培養基和補料培養基以氯化銨作為氮源，補料培養基中碳氮比為基礎培養基碳氮比的的20倍。初始葡萄糖濃度為5g/L。采用脈沖式方式進行補料，整個培養過程中葡萄糖濃度控制在0-20g/L(即在葡萄糖濃度下降至0g/L后補料至20g/L)，采用氨水調控pH在6.0并作為補充氮源。
實施例6實驗組4(Experiment-4)
基礎培養基和補料培養基以氯化銨作為氮源，補料培養基和基礎培養基中碳氮比均為12:1。初始葡萄糖濃度為5g/L。采用階段式恒速方式進行補料，整個培養過程中葡萄糖濃度控制在2-5g/L，采用氨水調控pH在6.0并作為補充氮源。
以上所有實驗的結果示于圖1并總結于表4。從表4可以看出，實驗組1-4的平均生物質生產率、最大生物量濃度(g/L)顯著好于對照1，證明用氨水調節pH優于NaOH。
實驗組3加料是脈沖式加料，所謂脈沖式加料，是指每次待培養罐中葡萄糖消耗殆盡時，一次性補充葡萄糖，使培養體系中葡萄糖瞬時達到20g/L，葡萄糖濃度變化波動極大；最后的平均生物質生產率、最大生物量濃度(g/L)，其結果低于實驗組2的連續低波動補料方式(即連續流加且葡萄糖濃度是一個溫和的變化過程)。可見連續流加補料并將葡萄糖濃度變化控制在小范圍優于葡萄糖濃度劇烈變化的脈沖式補料。
實驗組4中，補料培養基中的C:N＝12:1，表明不料培養基中含有較高的氮源，與實驗組1和實驗組2比較，由于補料培養液含氮量與基礎培養基一樣，未做減量，而氨水本身也帶來氮源，過量的氮抑制微藻的異養生長，因而實驗結果比實驗組1和實驗組2差。可見，優選補料培養基中的碳氮比高于基礎培養基中的碳氮比。
對照2以尿素作為氮源，基礎培養基和補料培養基中碳氮比都是12:1，對尿素的需求量很大，雖然營養成本高于實驗組2，但是平均生物質生產率反而低于實驗組2。此外，使用鹽酸調節pH會對發酵設備造成腐蝕。
表4
參考文獻
[1]Xie TH,Sun,Du KF,et al.Optimization of heterotrophic cultivation of Chlorella sp.for oil production.Bioresource Technology,2012,118:235-242.
[2]Azma M,Mohamed MS,Mohamad R,et al.Improvement of medium composition for heterotrophic cultivation of green microalgae,Tetraselmis suecica,using response surface methodology.Biochemical Engineering Journal,2011,53:187-195.
[3]Pahl SL,Lewis DM,Chen F,et al.Heterotrophic growth and nutritional aspects of the diatom Cyclotella cryptica(Bacillariophyceae):Effect of some environmental factors.Journal of Bioscience and Bioengineering,2010,109:235-239.
[4]Li TT,Zheng YB,Yu L,High productivity cultivation of a heat-resistant microalga Chlorella sorokiniana for biofuel production.Bioresource Technology,2013,131:60-67.
[5]Morales-Sánchez D,Tinoco-Valencia R,Caro-Bermúdez MA,et al.Culturing Neochloris oleoabundans microalga in a nitrogen-limited,heterotrophic fed-batch system to enhance lipid and carbohydrate accumulation.Algal Research,2014,5:61-69.
[6]Zheng YB,Li TT,Yu XC,et al.High-density fed-batch culture of a thermotolerant microalga Chlorella sorokiniana for biofuel production.Applied Energy,2013,108:281-287.
[7]Graverholt OS,Eriksen NT.Heterotrophic high-cell-density fed-batch and continuous-flow cultures of Galdieria sulphuraria and production of phycocyanin.Appl Microbiol Biotechnol,2007,77:69-75.
[8]Pleissner D,Lam WC,Sun Z,et al.Food waste as nutrient source in heterotrophic microalgae cultivation.Bioresource Technology,2013,137:139-146.
[9]Endo H,Nakajima K,Chino R,et al.Growth Characteristics and Cellular Components of Chlorella regularis,heterotrophic fast growing strain.Agr.Biol.Chern.,1974,38:9-18.
[10]羅舒懷等，低氮對產油尖狀柵藻熒光特性及色素蛋白復合物的影響，植物生理學報Plant Physiology Journal 2015,51(9):1425-1432。
[11]雷學青等，利用平板反應器大量培養高產油綠藻—尖狀柵藻的生長和油脂積累規律，中國生物工程雜志China Biotechnology，2014，34(11):91-99。