本發明屬于環境污染生物修復領域，具體為一種鐵載體高產菌制劑及其在污染土壤重金屬修復方面的應用。

背景技術：

土壤的重金屬污染現已成為全球性環境問題，備受社會和民眾關注，亟待解決。我國許多地區(尤其是華東地區)土壤呈不同程度的重金屬污染，許多地區糧食、蔬菜、水果中鎘、砷、銅、鉛、鋅等重金屬含量超標或接近臨界值，嚴重危害人民群眾健康。

土壤重金屬污染治理迫在眉睫卻又困難重重，主要原因在于重金屬并不像有機污染物那樣能夠被生物降解，且重金屬在土壤中遷移性差。傳統的物理、化學方法如客土、淋洗、離子交換等往往只適合小規模重度污染的土壤治理，且因其成本高、破壞土壤結構，以及易引發二次污染等缺點而飽受詬病。與之相比，生物修復因具有成本低、效果好、簡單易行和無二次污染等優點而備受青睞。其中，微生物—植物聯合修復作為生物修復的一種，因其可以有效降低土壤中重金屬的毒性，吸附重金屬并改變根際微環境，進而提高植物對重金屬的吸收或固定效率，且實施成本相對低廉、環境友好，以及可大規模原位修復等優點而備受歡迎，是近年來大力發展、推行的用于治理大面積土壤重金屬污染的新技術。然而，上述聯合修復技術的效率取決于修復植物的生物量，以及土壤中重金屬的生物可利用性。換言之，植物生物量越大且能夠盡量多地從土壤中吸收重金屬，那么修復效率就越高，效果也就越好。如何提高植物修復效率成為了研究與關注的熱點。超積累植物(如蕓苔屬、庭芥屬和遏藍菜屬)通常生物量較低且難以大規模種植，因而其在實際修復中的應用十分有限。而一些生長快速、生物量大且具有重金屬富集能力的植物正越來越多地應用于重金屬污染場地修復。作為一種可用于生產生物乙醇的能源作物，甜高粱具有耐壓能力強、生長迅速、生物量大等優點，成為了目前最具競爭力的重金屬修復植物。

鐵載體(Siderophore)是微生物產生的一種對鐵具有超強絡合力的有機化合物，其功能是向微生物細胞提供鐵素養分，尤其是在低鐵環境下。鐵載體與重金屬的結合主要體現在鐵載體的生物學功能上，即在濃縮環境中的鐵并促進其轉運進入細胞的同時，鐵載體還能通過絡合作用影響其它金屬的生物可利用性，從而降低其毒性。此外，微生物鐵載體還能夠通過抑制病原微生物的生長而提升植物根系的抗病能力。鐵載體產生菌因其具有上述優點、特質，故而成為了微生物—植物聯合修復重金屬污染體系中微生物部分的熱門候選。

目前，通過人工富集、篩選等技術，已有不少鐵載體產生菌從環境中分離出，并實現了純培養。然而，已報道的這些菌株中，鐵載體高產菌株有限；兼具多種優點、特質(如多重重金屬抗性和病原真菌結抗性)的菌株匱乏；具備切實強化植物吸收土壤中重金屬能力的菌株寥寥無幾。因而，尋找并獲取性狀優異的鐵載體高產菌株成為了該研究領域的熱點和焦點。

技術實現要素：

本發明針對現有技術的不足，提供一種鐵載體高產菌制劑。

本發明的另一個目的是提供上述鐵載體高產菌制劑在農田污染土壤重金屬修復方面的應用，該應用主要是強化甜高粱修復典型重金屬污染土壤。

本發明的上述技術問題是通過以下技術方案得以實施的：

一種鐵載體高產菌制劑，所述的鐵載體高產菌制劑中含有芽孢桿菌屬細菌(Bacillus sp.)S86、假單胞菌屬細菌(Pseudomonas sp.)S17和嗜根寡養單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)LD-6的組合。

本發明所涉及的高產鐵載體菌Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86源自浙江省杭州市浙江科技學院內試驗田土壤，經人工富集培養、壓力篩選和分離純化得到。本發明涉及到的另一株細菌——硫丹降解菌，為本實驗自有菌株，該菌是嗜根寡養單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)LD-6，于2012年3月2日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC No.5839，該菌具有降解硫丹的能力。保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所(下同)。

S17菌株為假單胞菌屬細菌，革蘭氏染色陰性，接觸酶陽性，氧化酶陰性，V.P.試驗陰性，吲哚試驗陽性，菌體形態為短桿狀，菌落呈淡黃色、圓形、邊緣略顯毛刺、光滑濕潤，其它生理生化特征如表1所示，該菌株于2016年10月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.13104。

芽孢桿菌屬細菌(Bacillus sp.)的菌株S86，該菌株于2016年10月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC No.13105。S86菌株為芽孢桿菌屬細菌，革蘭氏染色陽性，接觸酶陽性，氧化酶陰性，V.P.試驗陽性，吲哚試驗陰性，菌體形態為桿狀，菌落呈白色、圓形、蠟質，其它生理生化特征如表2所示。

表1、菌株S17的生理生化特征

注：“+”表示生長或陽性反應；“-”表示不生長或陰性反應(下同)。

表2、菌株S86的生理生化特征

S17菌株的最適生長溫度為29℃。以五分之一LB(Luria-Bertani)或工業發酵培養基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米漿6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄ 0.05g/L，pH 7.0)培養24小時后，菌液菌體濃度可達6.5-9.2×10⁹CFU/mL(CFU，菌落形成單位)。該菌對氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、卡那霉素和四環素敏感(皆為尋常抗生素)。可以認為：當菌體被釋放到自然環境中時，不會因抗(耐)藥性問題而產生超級細菌。在病原菌拮抗測試中，發現該菌株可抑制青霉、黑曲霉和油菜菌核病三種病原真菌生長。該菌對12種測試金屬離子(Li⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺和Co⁴⁺)呈現不同程度的耐受性(或抗性)。鑒于我國重金屬污染土壤現狀——多種重金屬污染并存，可以認為——該菌株較其它不具多種重金屬耐受性或抗性的菌株而言，在實施強化修復過程中修復效果受重金屬抑制影響小。該菌株鐵載體活性單位(Siderophore unit，SU)為99.2％，達產鐵載體菌最高級，是國內已報道產鐵載體菌中，產鐵載體能力最強的菌株。此外，S17還具備一定的溶磷和產3-吲哚乙酸的能力。以1.5％葡萄糖為碳源，0.2％氯化銨為氮源，30℃，pH7.2，培養時間66h(初始接種量為2％)，該菌溶磷量為120.35mg/L。向含有L-色氨酸(200mg/L)的通用LB液體培養基中接入該菌(接種量為1％)，28℃、160r/min培養3天，隨后測定發酵液中的3-吲哚乙酸含量，測定值為72.36mg/L。

S86菌株的最適生長溫度為28℃。以五分之一LB或工業發酵培養基培養24小時后，菌液菌體濃度可達6.1-8.6×10⁹CFU/mL。該菌對氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、卡那霉素和四環素敏感或高度敏感。可以認為：當菌體被釋放到自然環境中時，不會因抗(耐)藥性問題而產生超級細菌。在病原菌拮抗測試中，發現該菌株可抑制番茄灰霉病、番茄早疫病、茄子枯萎病、棉花枯萎病、油菜菌核病和甜瓜蔓枯病病原真菌生長。該菌對12種測試金屬離子(Li⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺和Co⁴⁺)呈現不同程度的耐受性(或抗性)。可以認為——該菌株較其它不具多種重金屬耐受性或抗性的菌株而言，在實施強化修復過程中修復效果受重金屬抑制影響小。該菌株SU值為76.4％，屬于強鐵載體產生菌。

嗜根寡養單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)LD-6，菌可在好養條件下，10日內實現對100mg/L硫丹的完全降解，且降解產物低毒或無毒、環境降解快速；菌株LD-6對常用抗生素四環素和卡那霉素敏感，對13種供試重金屬呈現耐受性；該菌對白色念珠菌(Candida albicans)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、黃萎病菌(Verticillium dahliae)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)和辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum)呈現明顯抑制作用；此外，該菌株具備在實際土壤環境下高效降解硫丹的能力，能夠顯著縮短硫丹降解時長，具備實際應用意義和價值。該菌的最適生長條件為：pH 7.2，溫度為30℃。以五分之一LB(Luria-Bertani)或工業發酵培養基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米漿6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O2g/L，MnSO₄ 0.05g/L，pH 7.2)培養24-36小時后，菌液濃度可達5-8×10⁹CFU/mL。嗜根寡養單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)LD-6在土壤修復方面的應用見ZL201210106224.1。

當S86菌株、S17菌株和LD-6菌株在五分之一LB或工業發酵培養基中29℃，pH7.3，150r/min共同培養24時后(S86、S17、LD-6初始接種量為各自單獨接種培養時的三分之一)，發現菌懸液菌體密度(5.6-10.2×10⁹CFU/mL)要明顯高于各自單獨培養時的菌懸液菌體密度。

作為優選，所述的制劑是由五分之一LB(Luria-Bertani)或工業發酵培養基接種菌種培養22-24小時后得到，工業發酵培養基的配方為：玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米漿6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄ 0.05g/L。進一步的，所述的制劑發酵培養的溫度為29±1℃，pH7.2-7.4。

一種所述的鐵載體高產菌制劑在農田污染土壤重金屬修復方面的應用。

作為優選，該應用是強化甜高粱修復重金屬污染土壤，方法為在生長期的甜高粱的根部噴灑含有所述的鐵載體高產菌制劑，鐵載體高產菌制劑中菌體的總濃度為1-5×10⁸CFU/mL。

綜上所述，本發明同現有技術相比具有如下優點：

本發明的Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86菌株均為強鐵載體產生菌。其中，Pseudomonas sp.S17菌株已達產鐵載體能力最高級，產鐵載體能力為國內已報到菌株中最強。S17和S86菌株對常用抗生素敏感，對12種重金屬呈現不同程度耐受性或抗性，并兼具病原真菌結抗性。而嗜根寡養單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)LD-6具有高效降解硫丹的能力，且降解產物低毒或無毒、環境降解快速；對常用抗生素四環素和卡那霉素敏感，對13種供試重金屬呈現耐受性；對白色念珠菌(Candida albicans)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、黃萎病菌(Verticillium dahliae)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)和辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum)呈現明顯抑制作用；此外，該菌株具備在實際土壤環境下高效降解硫丹的能力，能夠顯著縮短硫丹降解時長，具備實際應用意義和價值。而將三者共同培養時，發現其菌體密度要顯著高于相同條件下各自單培養的菌體密度，存在互補增生效應。此外，S17菌株還具備溶磷能力和產3-吲哚乙酸能力。上述的這些優點和特點對微生物—植物聯合修復重金屬污染土地而言，意義重大！使得這一修復體系能夠更為實際、更為高效地應用于污染場地修復。

具體實施方式

以下結合具體實施例來對本發明作進一步說明。應當理解，本發明的實施并不局限于下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護范圍。

在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設備和原料等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。

實施例1：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的分離與鐵載體產生能力測試

以通用五點采樣法現場采集浙江省杭州市浙江科技學院內試驗田土壤100g，用無菌信封盛裝，并迅速帶回實驗室。

通用CAS檢測液和MSA液體培養基根據陳紹興等報道(陳紹興，趙翔，沈萍，等.高靈敏假單胞菌鐵載體的平板檢測方法.微生物學通報，2006，33：122-127)配制。固體檢測平板則是在MSA液體培養基中加入5％的CAS檢測液和2％的瓊脂粉凝固而成。

將土壤樣品用10倍遞減法稀釋，涂布于五分之一LB固體平板(即所有營養成分為通用LB培養基的1/5)上。25℃培養，出現菌落后，將不同形態的菌落逐一以無菌牙簽挑出、轉接到新的五分之一LB固體平板上，直至純化成單菌落。所有純菌株依次編號，并進行常規菌種保藏，以斜面的形式存放于4℃冰箱之中。

將上述純化菌株，逐一轉接至固體檢測平板上，28℃倒置培養2天。觀察菌落周圍是否產生變色圈，并做詳細記錄，以變色圈的直徑大小作為產鐵載體菌產鐵載體能力強弱的初步判定。此外，須同時設置Escherichia coli DH5α菌株為陰性對照。

鐵載體定量測定依照陳紹興等報道(陳紹興，趙翔，沈萍，等.高靈敏假單胞菌鐵載體的平板檢測方法.微生物學通報，2006，33：122-127)進行，將各自供試菌株培養液以1％的量接入到30mL MSA液體培養基，28℃，200r/min培養24h，10000r/min離心15min，上清液用0.22微米的微孔濾膜過濾，并與等體積CAS檢測液混合均勻。室溫條件下，放置充分后測定各樣品的OD₆₈₀(As)值，以雙蒸水作對照調零。相同方法測定以未接菌的各液體培養基作為上清液的吸光值，以此為參比值(Ar)。鐵載體的濃度用鐵載體活性單位表示，每處理重復4次。隨后，依據Persmark等人的報道(Persmark M,Expert D,Neilands JB.Isolation,characterization,and synthesis of chrysobactin,a compound withsiderophore activity from Erwinia chrysanthemi.The Journal of Biological Chemistry,1989,264:3187-3193)對各菌株產鐵載體能力進行分級。

結果，在五分之一LB固體平板上共計獲得可培養菌株126株，其中9株具備鐵載體產生能力(參見表3)。在具備鐵載體產生能力的菌株中，又以S17菌株的能力最強，S86菌株次之。

表3、鐵載體產生菌產鐵載體能力記錄表

實施例2：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的抗生素敏感性試驗與病原真菌拮抗能力測試

抗生素敏感試驗采用濾紙片法，選擇氨芐青霉素、四環素、氯霉素、卡那霉素和鏈霉素五種常用抗生素，以各個抗生素濾紙片在培養鐵載體產生菌S17和S86平板上的抑菌圈直徑大小，作為敏感或者耐(抗)藥的判定標準。表4和表5給出的試驗結果表明，菌株S17和S86對上述供試抗生素均呈不同程度敏感反應。

表4、菌株S17的抗生素敏感性試驗結果

注：抑菌圈直徑大于中度敏感范圍上限值的為高度敏感，小于敏感范圍下限值的為抗性(下同)。

表5、菌株S86的抗生素敏感性試驗結果

本實施例說明當Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86菌體被釋放到自然環境中時，不會因抗(耐)藥性問題而成為超級細菌，這就為其后續實際應用提供了安全保證。

以10種病原菌——番茄灰霉病病菌、番茄早疫病病菌、茄子枯萎病病菌、甜瓜蔓枯病病菌、油菜菌核病病菌、青霉、棉花枯萎病病菌、黑曲霉、小麥紋枯病病菌和小麥葉枯病病菌為指示菌，利用平板對峙法測定S17和S86的病菌真菌拮抗能力。在通用PDA平板中央接種指示菌，四周分別接種S17和S86，每組試驗重復5次，通過菌落半徑和抑菌帶寬度明確菌株S17和S86的拮抗能力。

結果如表6所示，Pseudomonas sp.S17對供試的青霉、黑曲霉和油菜菌核病病菌呈明顯拮抗性，Bacillus sp.S86則對番茄灰霉病、番茄早疫病、茄子枯萎病、棉花枯萎病、油菜菌核病和甜瓜蔓枯病病菌呈不同程度結抗性。

表6、Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的拮抗能力測試

注：陰性記為“-”；抑菌圈直徑0-5mm記為“+”；抑菌圈直徑5-10mm記為“++”；抑菌圈直徑10-15mm記為“+++”；抑菌圈直徑大于15mm的記為“++++”。

實施例3：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的重金屬最小抑制濃度(MIC)測試

MIC試驗設計參照Filali等人的研究進行(Filali BK，Taoufik J，Zeroual Y，Dzairi FZ，Talbi M，Blaghen M.Waste water bacterial isolates resistant to heavymetals and antibiotics.Current Microbiology，2000，41：151-156)，分別挑取等大、經活化處理的S17和S86單菌落于培養試管中，30℃，160r/min振蕩培養32小時。依菌體長勢判定MIC值，每組設3個重復，分別測試菌株對12種金屬離子的耐受情況。結果如表7所示，供試菌株具多重重金屬耐受(抗)性，性狀優異。

表7、MIC測試結果

注：表中數據為3個測定值的平均值。

實施例4：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的溶磷與產3-吲哚乙酸能力測試

用接種環分別從試管斜面上取一環Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86，分別接種于盛有50mL液體LB培養基的三角瓶中，160r/min振蕩培養24h，然后各自取1mL(約1×10⁸CFU)培養物，分別接種到以Ca₃(PO₄)₂為唯一磷源的100mL無機磷發酵培養基【葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 1g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.002g，MnSO₄·H₂O 0.002g，Ca₃(PO₄)₂ 5g，蒸餾水定容至1000mL，pH 7.5】中，30℃振蕩培養(160r/min)48h，設置3個重復。運用通用鉬銻抗比色法測定磷含量——各自取1mL培養液于相應編號的離心管中，5000r/min離心10min。準確取1mL上清于相應編號的25mL容量瓶中，再加入2.5mL鉬銻抗顯示劑，然后用蒸餾水定容。在室溫下反應30min后，使用分光光度計測定700nm波長處吸光值，用mg P₂O₅/L來表示。以不接菌的處理為空白對照，實驗設3個重復。結果，測得Pseudomonas sp.S17溶磷量為88.6±2.26mg/L，Bacillus sp.S86不具溶磷能力。

向含有L-色氨酸(200mg/L)的LB液體培養基中分別接入Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86，28℃、160r/min培養3天。隨后以分光光度法測定各自菌懸液的OD₆₀₀值，然后將菌懸液10000r/min離心10min，取上清液加入等體積Salkowski比色液(Libbert E and Risch H.Interactions between plants andepiphytic bacteria regarding their auxin metabolism[J].Physiologia Plantarum，1969，22：51–58)，避光靜置30min使其顯色，測定OD₅₃₀值。計算單位體積菌液中3-吲哚乙酸的含量，設置3個重復，并以不產3-吲哚乙酸的E.coli DH5α為陰性對照。結果，測得S17菌株3-吲哚乙酸得率為62.8±0.86mg/L，S86菌株和陰性對照均未檢測到3-吲哚乙酸。

人們在以往重金屬污染場地修復過程中發現——不少修復植株會因營養匱乏(特別是缺少磷元素)、吸收受限，以及生長受抑制等原因無法最大程度地發揮修復吸收作用。本實施例表明，Pseudomonas sp.S17具備溶磷和產3-吲哚乙酸的能力，而這對強化植株存活、生長及其修復效用而言是非常實際且重要的。

實施例5：Pseudomonas sp.S17、Bacillus sp.S86和Stenotrophomonas rhizophilaLD-6共同強化甜高粱吸收重金屬的應用

一種鐵載體高產菌制劑，該制劑由A、B、C三種菌液復配獲得。

A菌液：以Pseudomonas sp.S17為初始接種物，29℃，工業發酵培養基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米漿6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄0.05g/L，pH 7.2)發酵培養24小時制得。

B菌液：以Bacillus sp.S86為初始接種物，28℃，工業發酵培養基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米漿6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄0.05g/L，pH 7.5)發酵培養24小時制得。

C菌液：以Stenotrophomonas rhizophila LD-6為初始接種物，30℃，工業發酵培養基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米漿6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄ 0.05g/L，pH 7.2)發酵培養24小時制得。

復配前，A、B、C三種菌液分別以無菌水或自來水各自調節菌體濃度至1.0×10⁸CFU/mL。然后，按照V_A:V_B:V_C＝2:2:1(體積比)比例進行復配，即得鐵載體高產菌制劑。

試驗所用土壤采自未受重金屬污染的菜園，其主要理化性質如下：有機質4.84％，總氮832.6mg/kg，總磷292.1mg/kg，總鉀220.3mg/kg，速效氮68.2mg/kg，速效磷18.1mg/kg，速效鉀58.3mg/kg，pH6.2。重金屬含量為鎘0.21mg/kg，銅58mg/kg，鋅101mg/kg。風干過篩后，分別加入不同含量的溶液態氯化鎘、氯化鋅和硫酸銅，使土壤中Cd²⁺的濃度為25mg/kg，Zn²⁺的濃度為800mg/kg，Cu²⁺的濃度為800mg/kg。充分混勻污染土壤，60％濕度條件下穩定2個月后測試。

修復植物甜高粱的種子購于臨安市江橋路門市。種子先萌芽，待幼苗長至10cm左右時，挑選長勢一致的幼苗移栽入1.5kg先前穩定好的重金屬污染土壤塑料盆(高13cm，直徑17cm)中，每盆1顆。移栽7天后，待植株生長正常，在各自植株的根部接入1mL新鮮配置，且搖勻的鐵載體高產菌制劑。

為避免培養基中的營養成分影響測試結果，上述接入菌液為經無菌水洗滌3遍后，以無菌水重新懸浮的菌液。試驗設4個處理：未種植物且未加菌的空白對照(C)、只種植物不接菌(P)、不種植物但加菌(M)，以及既種植物也加菌(PM)，每個處理設5個平行樣。定期澆水，保持每天8h的光照，甜高粱在溫室下生長82天后收獲，根系洗凈后用10mmol的EDTA溶液浸泡30min，再用去離子水沖洗2遍。植株在105℃殺青后80℃烘至恒重，稱取根、地上部的干重。植物組織消解(HClO₄∶HNO₃＝1∶4)后，測定其重金屬含量，全程序做空白對照以消除干擾。

結果如表8所示，接入Pseudomonas sp.S17、Bacillus sp.S86和Stenotrophomonas rhizophila LD-6能夠顯著提高甜高粱的生物量和重金屬吸收量。其中，地上部和根部的干重比未接菌的對照分別增加了31.2％和36.0％(PM處理與P處理相比)，而甜高粱地上部Cd²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺的總含量分別提高了75.5％、74.5％和72.9％。證實S17、S86和LD-6復配菌劑具備促進甜高粱生長、強化甜高粱吸收供試重金屬的能力。

表8、甜高粱地上部與根部的重金屬吸收量

注：重金屬含量＝生物量×重金屬濃度；提取效率為植株提取的重金屬總量(根部與地上部之和)與初始土壤中重金屬總含量之比；*表示該值與相應的對照值存在顯著差異(P<0.05)。

同最接近的現有技術相比(張璐.產鐵載體細菌強化甜高粱修復土壤重金屬污染.環境科學與技術，2014，37：74-79)，本發明“植物+微生物”處理的地上部干重，地上部Cd²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺的總含量，及各自提取效率較其分別提升了8.8％，17.7％、13.8％和21.0％，及18.1％、14.8％和21.4％，效果更佳，優勢顯著。而在提取率提升方面(PM處理提取率/P處理提取率)，本發明三種重金屬提取率提升效果較其分別提升了39.5％、95.6％和26.0％，優勢顯著。此外，需要指明的是，Pseudomonas sp.S17同上述張璐研究中的Pseudomonas sp.T07不是同一種菌。因為，其在生理生化特征方面有著明顯區別(參見表1)，具體表現在接觸酶、氧化酶、葡萄糖利用能力和甲基紅試驗四個測試項目上。