本發明屬于分子生物學領域，涉及一種橡膠樹類萌發素蛋白基因的抗病關聯性應用。

背景技術：

類萌發素蛋白(GLPs)是植物中廣泛存在的一類蛋白家族，它們以糖蛋白的形式通過離子鍵結合存在于細胞外基質中，在植物的不同生長發育階段以及不同的生物或非生物脅迫條件下表現出重要的生物學功能。(李瑩，柳參奎.植物類萌發素蛋白研究進展[J].中國農學通報，2014，30(30)：246-254.)該基因含有β-折疊桶狀結構域，屬于cupin超級家族(Druka A,Kudrna D,Kannangara CG,von Wettstein D,Kleinhofs A.Physical and genetic mapping of barley(Hordeum vulgare)germin-like cDNAs[J].Proc Natl Acad Sci USA(2002)99(2):850～855.)。GLPs的功能多種多樣，既與植物的正常生長發育有關，又能參與植物非生物和生物脅迫的防衛反應，在寄主基礎抗性反應中發揮重要作用。該基因通常以酶、結構蛋白以及受體的形式參與多種生理生化過程，具有草酸鹽氧化酶(Oxalate Oxidase,OXO)和超氧化物歧化酶(Super-Oxide Dismutase,SOD)的活性，能催化草酸氧化，產生二氧化碳和過氧化氫，而過氧化氫迅速積累導致植物細胞壁結構的增強，觸發過氧化脂質反應和乙烯的合成，并激活程序性細胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)，同時H₂O₂能夠誘導防御基因的表達，從而提高植物的抗病性(李紅麗，劉秋迪，何華，等.類萌發素蛋白在植物防衛反應中的作用[J].植物生理學報，2013，49(4)：331-336.)。研究發現，GLPs的N端具有一個不規則的信號肽，進一步證實該蛋白定位于細胞壁和細胞外基質中。Davidson等(2010)對OsGLPs定位進行研究證實所有的OsGLPs均定位于細胞壁上，當水稻葉片遭受病原菌侵染、昆蟲咬食時，細胞壁將迅速發生交聯，以此來保護水稻葉片免受傷害(Davidson R M,Manosalva P M,SnellingJ.Rice germin-like proteins:Allelic diversity and relationships to early stress responses[J].Rice(2010)3(1):43-55.)。Banerjee等，進一步對OsGLP1的定位進行研究，發現OsGLP1主要定位于細胞壁上，特別是在亞表皮細胞中的表達量較高。這個結果說明當水稻受到病原菌侵染時，GLP大量表達，產生的H₂O₂使初生細胞壁中的木聚糖交聯，來維持結構穩定。因此，當植物受到非生物逆境脅迫處理時，植物體內的部分GLPs將發揮其結構蛋白的功能，保護植物渡過不利的環境條件，降低外界不利條件對植物的影響(Banerjee J,Maiti M K.Functional role of rice germin-like protein1in regulation of plant height and disease resistance[J].Biochemical and biophysical research communications(2010)394(1):178-183.)。

巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)是我國熱帶地區重要的經濟作物和戰略性工業原料作物，在國民經濟建設和國家安全建設中占有重要的地位。而橡膠樹棒孢霉落葉病(Corynespora leaf fall disease，CLFD)是近30年來影響橡膠樹生產上最為嚴重的葉部病害。在世界范圍內該病害僅次于南美葉疫病(South American Leaf Blight，SALB)成為威脅天然橡膠產業健康發展的第二大葉部病害。類萌發素蛋白能夠響應多主棒孢病菌侵染的防御應答，同時還參與橡膠樹的抗病過程，在橡膠樹的基礎抗性和防御反應發揮著重要作用。因此克隆類萌發素蛋白基因，分析受多主棒孢病菌誘導后在橡膠樹抗、感品種中的表達特性，將有助于進一步了解橡膠樹類萌發素蛋白基因的抗病調控機理。目前，橡膠樹類萌發素蛋白GLPs的基因及其抗病分子機理善未見報道。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種橡膠樹抗病相關蛋白及其編碼基因與應用。

本發明所提供的橡膠樹抗病相關蛋白，來源于橡膠樹，名稱為HbGLP01，是如下1)或2)的蛋白質：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與序列1所示蛋白具有相同活性的由1)衍生的蛋白質。

序列表中的序列1由327個氨基酸殘基組成。

為了便于序列1編碼的HbGLP01純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。

表1標簽的序列

上述HbGLP01可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述HbGLP01的編碼基因可通過將序列表中序列2自5′末端第1-645位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。

所述橡膠樹抗病相關蛋白(HbGLP01)的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。

所述橡膠樹抗病相關蛋白(HbGLP01)的cDNA為如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述橡膠樹抗病相關蛋白的DNA分子；

3)與序列表中序列2的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且編碼蛋白對具有橡膠樹抗病相關功能的核苷酸序列。

序列表中序列2全長為999個核苷酸，編碼一個長度為327個氨基酸(序列表中序列1)，即為橡膠樹抗病相關蛋白(HbGLP01)。

上述嚴格條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。

含有所述橡膠樹抗病相關蛋白(HbGLP01)的編碼基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。

上述橡膠樹抗病相關蛋白(HbGLP01)及其編碼基因在培育能抗病性提高的橡膠樹中的應用也屬于本發明的保護范圍。

橡膠樹抗病種質創制與抗病品種選育是橡膠樹葉部病害防控最有效的途徑，而抗病相關基因的克隆與功能分析是橡膠樹抗病品種定性培育的關鍵。前期研究，證實了類萌發素蛋白(GLPs)家族成員與橡膠樹棒孢霉落葉病的抗病性關系密切，克隆和鑒定了橡膠樹抗病相關GLPs家族基因HbGLP01，明確其在橡膠樹抗、感種質中的抗病性。因此，并利用抗病GLPs基因作為靶標基因在橡膠樹種質資源抗病性早期分子診斷和抗病品種鑒選方面提供了新的途徑，也為后續抗病品種的選育提供理論依據。

附圖說明

圖1為HbGLP01基因預測結果(橡膠樹、擬南芥、煙草、苜蓿、楊樹及葡萄等6種模式)

圖2為HbGLP01基因的擴增結果M：Trans 2K PlusⅡDNA Ladder；1：以IAN873基因組為模板；2：以PR107基因組為模板；3：以IAN873第一鏈cDNA為模板；4：以PR107第一鏈cDNA為模板。

圖3為HbGLP01蛋白序列的保守結構域預測

圖4為HbGLP01蛋白信號肽預測

圖5為HbGLP01在橡膠樹受多主棒孢侵染后的差異表達分析；小寫英文字母為差異顯著性標記(P<0.05)

具體實施方式

我們克隆了橡膠樹磷酸果糖激酶基因的全長cDNA，并進行了基因表達分析將該基因命名為HbGLP01。下述實施例中所述的方法，如無特別說明，均為常規方法。

實施例1.橡膠樹類萌發素蛋白(GLPs)及其編碼基因的獲得

分析已在NCBI登陸的擬南芥、楊樹和麻風樹的類萌發素蛋白(GLPs)的核苷酸序列，通過搜索我們建立的橡膠樹葉片受多主棒孢病菌侵染后的EST序列數據庫，確定一條200bp左右的橡膠樹類萌發素蛋白(GLPs)基因EST組裝后序列(contig)，設計一對特異性引物擴增得到該cDNA片段，最終獲得包含完整讀碼框的cDNA全長序列。

具體方法如下：

<1>cDNA片段克隆

特異性引物設計如下：

F(5’端)：5'-GATGAGTCCTGAGTAACGGTG-3'

R(3’端)：5'-TGACTGCGTACCAATTCCGTC-3'。

分別以巴西橡膠樹熱研7-33-97(中國熱帶農業科學院橡膠研究所培育，中國熱帶農業科學院橡膠研究所長期有種苗出售)葉片cDNA為模板(以隨機引物反轉錄獲得)，F和R為引物，其終濃度為0.4μmol/L，在25μl反應體系中進行PCR擴增。擴增程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s，34次循環；72℃延伸10min。獲得一段1000bp左右的核苷酸片段，為類萌發素蛋白(GLPs)基因的cDNA片段。

<2>HbGLP01基因全長的克隆

差異表達片段DE-TDFs-FI7321長246nt，與熱研7-33-97全基因組序列比對結果表明其同源性為100％。提取包括該片段在內的3kb基因組序列，用Softberry軟件中的橡膠樹、擬南芥、煙草、苜蓿、楊樹及葡萄等模式進行目的基因預測，均獲得一致的結果(圖1)，將該基因命名為HbGLP01。預測該基因包含2個外顯子和1個內含子，第1個外顯子前約0.1kb處為轉錄起始位點，兩外顯子之間有一個長303nt的內含子，第2個外顯子后約0.05kb處為Poly A位點,而且內含子和外顯子交界處序列符合GT-AG規律。

根據預測結果設計引物GLP-F：5’-AGGTCAACCTCAACTAACAC-3’和GLP-R：5’-AAAGAGGCAATAGGCATATC-3’。分別以IAN873和PR107的基因組DNA和接種48h后的第一鏈cDNA作為模板進行PCR擴增，結果分別獲得約1.2kb和0.7kb的擴增產物(圖2)。測序結果比對表明，從兩個樣品基因組及cDNA中均獲得完全相同的序列。進一步的分析結果表明獲得了和預測結果一致的HbGLP01基因，該基因編碼231aa，cDNA序列和氨基酸序列與“熱研7-33-97”中同源基因的相似性分別為97％和100％。序列已提交NCBI數據庫，登錄號為KT355593。

實施例2.橡膠樹類萌發素蛋白(GLPs)生物信息學分析

對HbGLP01基因氨基酸序列的Blastp結果表明，在第63-209位氨基酸殘基間，序列與cupin-1家族典型的β-桶狀保守結構序列高度相似(圖3)。推測該基因為Cupin超蛋白家族的成員之一。SignalP 4.0預測其信號肽存在于靠近序列N端的6-25氨基酸序列區，第22及第23個氨基酸殘基間為其可能的剪切位點(圖4)，該信號肽能指導氨基酸序列進入胞外基質中。Wolf Psort亞細胞定位預測結果也表明，該蛋白可能定位于細胞外基質中。對該蛋白進行理化性質分析可知，編碼的231個aa的蛋白分子量為24.8ku，等電點5.54，不穩定系數25.07，脂肪族氨基酸指數95.84，表明此蛋白可能是一個穩定的疏水性蛋白。

對HbGLP01基因進行Blastn數據庫同源比對，該基因與麻風樹JcGLP1-13(XP_012081131.1)的同源性最高，為81％。依據比對結果，選取麻風樹JcGLP1-13，胡楊PeGLP1-13(XP_011045439.1)，三角葉楊PtGLP1(XP_002313686.1)，可可樹TcMYB113(XP_007030289.1)，雷蒙德式棉GrGLP1-14(XP_012480997.1)等GLPs基因的蛋白質序列，利用DNAMAN軟件對序列進行多序列比對(圖5)。結果表明HbGLP01蛋白包含GLPs蛋白家族中高度保守的三個寡肽序列，分別是Box A(-QDFCVAD-),Box B(G--P-H-HPRATE------G)及Box C(GL-HFQ-N-G)。序列Box B及Box C處于Cupin Domain區域內，Box B及Box C中含有1個谷氨酸(Glu,E)和3個組氨酸(His,H)等保守氨基酸殘基(圖3)。

實施例3.HbGLP01基因表達模式分析

<1>HbGLP01基因在橡膠樹抗、感種質中的特異性表達

選取基因的保守區域設計特異性熒光表達上下游引物GX-F：5’-TAATATTGCCAGCGAAACTTC-3’及GX-R：5’-CCATTTGCTTCATAATCGATA-3’，采用qRT-PCR方法分析橡膠樹品種IAN873和PR107受多主棒孢侵染后HbGLP01基因的差異表達。結果表明IAN873(抗病)及PR107(感病)葉片受侵染后HbGLP01基因的表達均出現先顯著上調隨后下降的現象。IAN873在接菌6h后表達量開始上升，在24h時達到峰值隨后下降，而PR107接菌6-24h上升緩慢，至48h時顯著上調并達到峰值，且峰值表達量明顯低于抗病品種。推測HbGLP01可能參與橡膠樹與多主棒孢的互作過程并與抗性反應相關(圖5)。

4.結論

我們首次克隆了橡膠樹類萌發素蛋白GLPs基因的全長cDNA，經qRT-PCR分析表明，HbGLP01基因在橡膠樹抗病(IAN873)品種中的表達量顯著高于感病品種(PR107)，且在不同抗病性水平(高抗、中抗、輕感、高感)的雜交F1代種質中的表達量也存在明顯的差異，說明該基因與橡膠樹的抗病性相關，并且具有橡膠樹抗病性早期分子診斷靶基因的潛力。利用抗病GLPs基因作為靶標基因在橡膠樹種質資源抗病性早期分子診斷和抗病品種鑒選方面提供了新的途徑。

以上說明對本發明而言只是說明性的，而非限制性的，本領域普通技術人員理解，在不脫離所附權利要求所限定的精神和范圍的情況下，可做出許多修改、變化或等效，但都將落入本發明的保護范圍內。

序列表

<110>中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所

<120> 橡膠樹抗病相關蛋白GLPs及其編碼基因與應用

<130> WHOI160083

<160>2

<210> 1

<211> 327

<212> PRT

<213>橡膠樹

<400> 1

Met Lys Val Ser Asn Phe Leu Val Ala Leu Ala Phe Leu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Ser Ser Phe Ala Ile Ala Tyr Asp Pro Ser Pro Leu Gln Asp Phe Cys

20 25 30

Val Ala Thr Asp Asp Ala Ser Ser Gly Gly Met Gln Pro Leu Met Leu

35 40 45

Phe Pro Phe Ile Thr Ala Ile Asn Val Leu Phe Leu Ser Gly Ile Phe

50 55 60

Lys Phe Ile Phe Ile Phe Ser Lys Phe Cys Tyr Ser Asn Asp Tyr Asp

65 70 75 80

Lys Ser Tyr Val Ile Phe Ile Val Ile Met Trp Ile Ile Ile Tyr Asp

85 90 95

Asn Ser Arg Val Asn Ser Ile Ile Ile Lys Trp Ile Ser Ser Ser Met

100 105 110

Ile Lys Ile Tyr Leu Leu Tyr Ile Gly Leu His Ala Leu Met Ala Ile

115 120 125

Lys Leu Cys Leu His Phe Phe His Ala Val Leu Val Asn Gly Lys Phe

130 135 140

Cys Lys Asp Pro Asp His Val Thr Ala Asp Asp Phe Phe Tyr Ser Gly

145 150 155 160

Leu Asn Ile Ala Ser Glu Thr Ser Lys Gln Leu Gly Ala Arg Thr Asn

165 170 175

Leu Leu Thr Val Asp Ser Ile Pro Gly Leu Asn Thr Asn Gly Leu Ser

180 185 190

Ile Val Arg Ile Asp Tyr Glu Ala Asn Gly Gly Leu Asn Pro Pro His

195 200 205

His His Pro Arg Ala Ser Glu Ile Leu Thr Val Leu Glu Gly Thr Leu

210 215 220

Tyr Ala Gly Phe Ile Thr Ser Asn Pro Asp His Arg Val Phe Ala Lys

225 230 235 240

Val Leu Lys Ala Gly Asp Val Phe Val Phe Pro Phe Gly Leu Ile His

245 250 255

Phe Gln Leu Asn Ile Gly Lys Asn Pro Ala Val Ala Ile Ala Ala Leu

260 265 270

Asn Ser Gln Asn Pro Gly Val Val Thr Thr Ala Asn Thr Val Phe Gly

275 280 285

Ala Ser Pro Ser Ile Asn Pro Asp Val Leu Thr Arg Ala Phe His Leu

290 295 300

Asp Lys Asp Leu Val Thr Lys Leu Gln Arg Gln Glu Trp Val Asn Pro

305 310 315 320

Ser Asp Leu Asn Ser Tyr Ser

325

<210> 2

<211> 999

<212> DNA

<213> 橡膠樹

<400> 2

atgaaagttt ctaatttcct cgtagctctt gctttcttgg ctttggcttc ctcatttgcc 60

attgcttatg accctagccc tctccaggac ttctgtgtgg caactgatga tgctagctct 120

ggtggtatgc aaccgcttat gctatttcct tttattactg ctattaattg agtacttttt 180

ttgagcggca ttttcaaatt tattttcatt ttttcaaaat tttgttatag taatgattat 240

gataagtctt atgtgatttt catagtaatc atgtggatta taatctatga taactctcgt 300

gtgaattcca tcataatcaa atggatttca tcataatcta tgattaaaat atatttgttg 360

tacatatgag ggttacacgc attaatggca ataaaattgt gctaatgatt acatttcttt 420

catgcagtgt tggtgaatgg aaaattttgc aaggacccag accatgtcac agcagatgat 480

ttcttctatt ctgggcttaa tattgccagc gaaacttcca aacaacttgg agcacgtacc 540

aaccttttga ctgtggattc gataccagga cttaatacta atggcctatc cattgttcgt 600

atcgattatg aagcaaatgg tggactaaac ccaccccacc atcaccctcg agcttcagag 660

atcttaactg tcttggaagg aaccttgtat gctggtttta tcacatccaa tcctgatcat 720

cgtgtttttg ctaaagttct caaggcagga gatgtttttg tatttccatt tggactcatt 780

cacttccagt tgaatattgg aaaaaatcct gcagttgcca tagcagcatt aaacagtcaa 840

aatccaggag ttgtgacgac agcaaataca gtttttggag ctagcccatc cattaatcct 900

gatgttctaa caagagcatt ccatcttgac aaggatttag ttaccaaact tcagagacaa 960

gaatgggtga atccatcaga tcttaacagc tattcttga 999