本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、分析化學(xué)以及組合化學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及適配體組合文庫(kù)及其構(gòu)建方法，還涉及使用所述的適配體組合文庫(kù)篩選評(píng)價(jià)所需適配體的方法以及由該方法篩選得到的適配體。本發(fā)明還涉及所述篩選得到的適配體的用途及含有所述篩選得到的適配體的試劑盒。利用本發(fā)明提供的適配體組合文庫(kù)及篩選方法篩選得到的適配體親和力更優(yōu)，并且無(wú)冗余序列。

背景技術(shù)：

寡核苷酸適配體(Oligonucleotide aptamer)，通常經(jīng)指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)篩選得到(Nature 1990,346；Science 1990,249(4968):505-510)，一般為一段短的單鏈寡核苷酸序列(ssDNA或RNA)，通過(guò)折疊成一定的三維結(jié)構(gòu)，經(jīng)空間構(gòu)型互補(bǔ)與靶分子形成高親和力、高特異性結(jié)合，又稱(chēng)為“化學(xué)抗體”(Oncotarget 2016,7(12):13446-13463)。

對(duì)于通過(guò)SELEX技術(shù)篩選得到的適配體又稱(chēng)全長(zhǎng)適配體，一般均包含引物序列和隨機(jī)序列，長(zhǎng)度一般在70～130堿基(nt)之間。全長(zhǎng)適配體和靶分子的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)一般并不明確，這導(dǎo)致了全長(zhǎng)適配體不適合作為功能性識(shí)別元件。許多經(jīng)SELEX技術(shù)篩選出的適配體，其引物區(qū)與隨機(jī)區(qū)產(chǎn)生堿基配對(duì)，某些引物區(qū)參與了特異性識(shí)別，或者隨機(jī)區(qū)序列較長(zhǎng)，存在冗余堿基序列。因此，對(duì)于全長(zhǎng)適配體序列，需對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)剪裁，以便于得到既保持結(jié)合活性、又僅有適當(dāng)長(zhǎng)度(10-40nt)的適配體，這樣的適配體更適合作為功能性識(shí)別元件。為了得到這樣的適配體，需要精確界定對(duì)識(shí)別功能產(chǎn)生貢獻(xiàn)的適配體序列(或結(jié)構(gòu)域)。

因此，適配體后篩選(post-SELEX)始終是研究熱點(diǎn)之一，已發(fā)展了結(jié)構(gòu)剪裁、化學(xué)修飾、多價(jià)組合、定點(diǎn)突變等方法，從中尋找親和性更高、特異性更強(qiáng)、序列更短的適配體，但多數(shù)尚限于以試錯(cuò)法(J.Biol.Chem.2001,276(54):48644-48654)進(jìn)行嘗試。

試錯(cuò)法一般是針對(duì)末輪文庫(kù)的富集序列，在共有的二級(jí)結(jié)構(gòu)及計(jì)算所得較低自由能(ΔG)的基礎(chǔ)上，依據(jù)一些核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗(yàn)性判斷，對(duì)適配體序列進(jìn)行較為隨機(jī)的剪裁或定點(diǎn)突變，例如，上官等采用試錯(cuò)法，對(duì)其篩選得到的呈環(huán)1-莖1-環(huán)2-莖2-環(huán)3二級(jí)結(jié)構(gòu)的肺癌細(xì)胞適配體Sgc8，進(jìn)行結(jié)構(gòu)剪裁，逐級(jí)截掉環(huán)1、莖1、環(huán)2等，最終得到莖2-環(huán)3的適配體序列Sgc8c，基本保留了原Sgc8的親和力(Chem.Bio.Chem.2007,8:603-606)。又例如，發(fā)明人之前針對(duì)重組人促紅細(xì)胞生成素-α篩選得到的全 長(zhǎng)適配體828，經(jīng)截掉全部隨機(jī)序列后得到的828r，較原來(lái)828的親和力稍?xún)?yōu)(CN102191250A；Bioorg.Med.Chem.2010，18，8016-8025)。

上述試錯(cuò)法效率較低，往往篩選得到許多無(wú)效序列。例如，F(xiàn)erreira-Bravo等采用試錯(cuò)法對(duì)經(jīng)SELEX技術(shù)篩選得到的HIV反轉(zhuǎn)錄蛋白的DNA適配體FA1進(jìn)行堿基替換，僅將適配體的四條莖部互補(bǔ)堿基序列全部簡(jiǎn)單替換為G-C堿基對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該替換對(duì)親和活性無(wú)明顯影響；同時(shí)對(duì)于適配體的四個(gè)環(huán)部結(jié)構(gòu)域，僅進(jìn)行簡(jiǎn)單隨機(jī)剪裁，亦未發(fā)現(xiàn)親和活性?xún)?yōu)的剪裁序列(Nucleic Acids Res.2015,43(20):9587-9599)。又例如，Esposito等針對(duì)15nt長(zhǎng)的凝血酶適配體TBA，創(chuàng)建了14條在不同位點(diǎn)極性反轉(zhuǎn)(自5’-3’翻轉(zhuǎn)為3’-5’)序列，雖可進(jìn)行結(jié)構(gòu)闡釋?zhuān)⑽窗l(fā)現(xiàn)活性更優(yōu)的適配體(Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2007,26(8-9):1145-1149)。上述方法很難在有限的序列范圍內(nèi)，得到親和活性更優(yōu)、特異性更強(qiáng)的優(yōu)化適配體(Improved aptamer)序列。

還有Nonaka等學(xué)者將基于遺傳算法的虛擬篩選引入post-SELEX領(lǐng)域，賦予下一代文庫(kù)中高親和力序列更高的出現(xiàn)幾率，組合隨機(jī)突變位點(diǎn)，從3代50多條等長(zhǎng)突變序列里篩選到較之原VEGF適配體序列的親和性高10倍的適配體(Anal.Chem.2013,85,1132-1137)。但仍無(wú)法回答適配體序列是否保守的問(wèn)題，也無(wú)法確定那些是關(guān)鍵堿基。說(shuō)明當(dāng)前在post-SELEX中普遍沿用的試錯(cuò)法等進(jìn)行結(jié)構(gòu)剪裁或定點(diǎn)突變的方法，工作效率較低、難度較大，尚無(wú)系統(tǒng)的理論指導(dǎo)和較好的解決方案。

在篩選和優(yōu)化適配體時(shí)，需要表征和評(píng)價(jià)適配體與靶分子間親和力。目前，用于表征和評(píng)價(jià)適配體與靶分子間親和力的方法，主要包括表面等離子體共振法(Surface Plasmon Resonance，SPR)、生物膜干涉法(Bio-Layer Interferometry，BLI)、等溫滴定量熱法(Isothermal Calorimetry，ITC)、凝膠電泳淌度變動(dòng)分析法(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)、微量熱泳動(dòng)法(Microscale Thermophoresis，MST)、后向散射干涉法(Backscattering Interferometry，BSI)以及熒光各向異性法(Fluorescence polarization，F(xiàn)P)等，依據(jù)結(jié)合作用前后的特征值變化來(lái)判定適配體與靶分子間親和力。EMSA、FP、MST均需對(duì)靶分子或配體進(jìn)行熒光或放射性標(biāo)記；ITC屬于免標(biāo)記分析技術(shù)，但靈敏度較低、需用樣品量較大；SPR、BLI、BSI和基于分子自發(fā)熒光的MST等則因其免標(biāo)記、靈敏度高等備受關(guān)注。SPR和BLI除了能夠提供親和力數(shù)據(jù)外，還可以同時(shí)提供動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，可實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)定。SPR和BLI均需對(duì)靶分子進(jìn)行固定，通過(guò)讀取表面固定后的靶分子和溶液中的配體間作用后的表面等離子體共振信號(hào)強(qiáng)度的變化、或表面厚度的增加而實(shí)施測(cè)定。

在使用SPR技術(shù)時(shí)，需要對(duì)靶分子的固定方式、相互作用的溶液體系、相互作用后的再生條件等關(guān)鍵因素進(jìn)行考察和優(yōu)化，在建立合適、穩(wěn)定、高靈敏的SPR方法體系后，方能進(jìn)行后續(xù)的適配體序列篩選評(píng)價(jià)等工作。

為了篩選、優(yōu)化親和力更優(yōu)、無(wú)冗余序列的最短適配體活性序列，需要找尋并開(kāi) 發(fā)合適的裁剪方法對(duì)全長(zhǎng)適配體(或待優(yōu)化適配體序列)進(jìn)行結(jié)構(gòu)剪裁，還需要建立合適、穩(wěn)定、高靈敏的表征和評(píng)價(jià)方法，從而能夠高效地評(píng)價(jià)所剪裁序列和靶分子間的親和力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建適配體組合文庫(kù)的方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種基于上述構(gòu)建適配體組合文庫(kù)的方法構(gòu)建的適配體組合文庫(kù)。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種通過(guò)上述構(gòu)建適配體組合文庫(kù)的方法所構(gòu)建的適配體組合文庫(kù)篩選適配體的方法。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供通過(guò)上述篩選方法篩選的適配體。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供通過(guò)上述篩選方法所篩選的適配體的用途。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有通過(guò)上述篩選方法所篩選的適配體的試劑盒。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有通過(guò)上述篩選方法所篩選的適配體的組合物。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有通過(guò)上述篩選方法所篩選的適配體的芯片。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種構(gòu)建適配體組合文庫(kù)的方法，包括以下步驟：

提供具有N個(gè)堿基的待優(yōu)化適配體，以待優(yōu)化適配體作為初始序列；

構(gòu)建第一分子群，其包含n₁個(gè)分子，所述n₁個(gè)分子各自為初始序列的5’末端截短體，并且每一個(gè)分子相對(duì)于初始序列具有不同的5’末端截短長(zhǎng)度；

構(gòu)建第二分子群，其包含n₂個(gè)分子，所述n₂個(gè)分子各自為初始序列的3’末端截短體，并且每一個(gè)分子相對(duì)于初始序列具有不同的3’末端截短長(zhǎng)度；

構(gòu)建第三分子群，其包含n₃個(gè)分子，所述n₃個(gè)分子各自為初始序列的5’和3’末端同時(shí)截短的截短體，在一個(gè)分子中5’和3’末端截短長(zhǎng)度相同，并且每一個(gè)分子相對(duì)于初始序列具有不同的末端截短長(zhǎng)度；

任選地，構(gòu)建第四分子群，其包含n₄個(gè)分子，

當(dāng)初始序列能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，所述n₄個(gè)分子各自為初始序列的環(huán)部序列延長(zhǎng)體，所述環(huán)部序列延長(zhǎng)體不包括初始序列的莖部序列，在5’末端包含1～n₄個(gè)第一序列(例如由A和G組成的序列，例如AG)，且在3’末端包含1～n₄個(gè)第二序列，所述第二序列是第一序列的反向互補(bǔ)序列(例如由C和T組成的序列，例如CT)，在一個(gè)分子中5’末端包含的第一序列和3’末端包含的第二序列數(shù)量相同，并且每一個(gè)分子相對(duì)于初始序列具有不同的末端延長(zhǎng)長(zhǎng)度；

當(dāng)初始序列不能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，所述n₄個(gè)分子各自為初始序列的延長(zhǎng)體，所述延長(zhǎng)體的5’末端包含1～n₄個(gè)第一序列(例如由A和G組成的序列，例如AG)，且在3’末端包含1～n₄個(gè)第二序列，所述第二序列為第一序列的反向互補(bǔ)序列(例如由C和T組成的序列，例如CT)，在一個(gè)分子中5’末端包含的第一序列和3’末端包含的第二序列數(shù)量相同， 并且每一個(gè)分子相對(duì)于初始序列具有不同的末端延長(zhǎng)長(zhǎng)度，

所述第一序列的長(zhǎng)度可以為1個(gè)或多個(gè)堿基，例如，1、2、3或4個(gè)堿基；

其中，N為大于零的整數(shù)(例如，30～130之間的整數(shù))，

n₁、n₂、n₃、n₄各自獨(dú)立地為大于零且小于或等于N的整數(shù)(例如，5～80之間的整數(shù))。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的構(gòu)建適配體組合文庫(kù)的方法，其中，

第一分子群的構(gòu)建方法為：從5’末端對(duì)初始序列進(jìn)行截短，共進(jìn)行n₁次，每次截短1個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3、4個(gè))堿基，由此獲得n₁個(gè)5’末端截短的分子，構(gòu)成第一分子群；

第二分子群的構(gòu)建方法為：從3’末端對(duì)初始序列進(jìn)行截短，共進(jìn)行n₂次，每次截短1個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3、4個(gè))堿基，由此獲得n₂個(gè)3’末端截短的分子，構(gòu)成第二分子群；

第三分子群的構(gòu)建方法為：從5’和3’末端同時(shí)對(duì)初始序列進(jìn)行截短，共進(jìn)行n₃次，每次對(duì)5’和3’末端同時(shí)截短1個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3、4個(gè))堿基，由此獲得n₃個(gè)5’和3’末端同時(shí)截短的分子，構(gòu)成第三分子群；

第四分子群的構(gòu)建方法為：

當(dāng)初始序列能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，保持初始序列的環(huán)部序列不變，將莖部序列去除，在環(huán)部序列的5’末端添加第一序列(例如由A和G組成的序列，例如AG)，且在環(huán)部序列的3’末端添加第二序列，所述第二序列為第一序列的反向互補(bǔ)序列(例如由C和T組成的序列，例如CT)，重復(fù)進(jìn)行n₄次，由此獲得n₄個(gè)5’和3’末端同時(shí)延長(zhǎng)的分子，構(gòu)成第四分子群；

當(dāng)初始序列不能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，在初始序列的5’末端添加第一序列(例如由A和G組成的序列，例如AG)，且在3’末端添加第二序列，所述第二序列為第一序列的反向互補(bǔ)序列(例如由C和T組成的序列，例如CT)，重復(fù)進(jìn)行n₄次，由此獲得n₄個(gè)5’和3’末端同時(shí)延長(zhǎng)的分子，構(gòu)成第四分子群。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的構(gòu)建適配體組合文庫(kù)的方法，其中第一分子群、第二分子群或第三分子群中長(zhǎng)度最短的分子，其為具有10～40個(gè)堿基，例如，20～30個(gè)堿基。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的構(gòu)建適配體組合文庫(kù)的方法，其中所述待優(yōu)化適配體為特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體，例如，SEQ ID NO.1所示的全長(zhǎng)適配體。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的構(gòu)建適配體組合文庫(kù)的方法，其中所述待優(yōu)化適配體為特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體，例如，SEQ ID NO.1所示的全長(zhǎng)適配體，其中N＝39，n₁＝9，n₂＝9，n₃＝9，n₄＝8，所述第一序列的長(zhǎng)度為1個(gè)堿基、2個(gè)堿基或3個(gè)堿基。

本發(fā)明還提供一種適配體組合文庫(kù)，包括：

第一分子群，其包含n₁個(gè)分子，所述n₁個(gè)分子各自為初始序列的5’末端截短體，并 且每一個(gè)分子相對(duì)于初始序列具有不同的5’末端截短長(zhǎng)度；

第二分子群，其包含n₂個(gè)分子，所述n₂個(gè)分子各自為初始序列的3’末端截短體，并且每一個(gè)分子相對(duì)于初始序列具有不同的3’末端截短長(zhǎng)度；

第三分子群，其包含n₃個(gè)分子，所述n₃個(gè)分子各自為初始序列的5’和3’末端同時(shí)截短的截短體，在一個(gè)分子中5’和3’末端截短長(zhǎng)度相同，并且每一個(gè)分子相對(duì)于初始序列具有不同的末端截短長(zhǎng)度；以及

任選地，第四分子群，其包含n₄個(gè)分子，

當(dāng)初始序列能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，所述n₄個(gè)分子各自為初始序列的環(huán)部序列延長(zhǎng)體，所述環(huán)部序列延長(zhǎng)體不包括初始序列的莖部序列，在5’末端包含1～n₄個(gè)第一序列(例如由A和G組成的序列，例如AG)，且在3’末端包含1～n₄個(gè)第二序列，所述第二序列是第一序列的反向互補(bǔ)序列(例如由C和T組成的序列，例如CT)，在一個(gè)分子中5’末端包含的第一序列和3’末端包含的第二序列數(shù)量相同，并且每一個(gè)分子相對(duì)于初始序列具有不同的末端延長(zhǎng)長(zhǎng)度；

當(dāng)初始序列不能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，所述n₄個(gè)分子各自為初始序列的延長(zhǎng)體，所述延長(zhǎng)體的5’末端包含1～n₄個(gè)第一序列(例如由A和G組成的序列，例如AG)，且在3’末端包含1～n₄個(gè)第二序列，所述第二序列為第一序列的反向互補(bǔ)序列(例如由C和T組成的序列，例如CT)，在一個(gè)分子中5’末端包含的第一序列和3’末端包含的第二序列數(shù)量相同，并且每一個(gè)分子相對(duì)于初始序列具有不同的末端延長(zhǎng)長(zhǎng)度，

所述第一序列的長(zhǎng)度可以為1個(gè)或多個(gè)堿基，例如，1、2、3、4個(gè)堿基；

其中，N為大于零的整數(shù)(例如，30～130之間的整數(shù))，

n₁、n₂、n₃、n₄各自獨(dú)立地為大于零且小于或等于N的整數(shù)(例如，5～80之間的整數(shù))，

所述初始序列為待優(yōu)化適配體。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的適配體組合文庫(kù)，其中所述待優(yōu)化適配體為特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體，例如，SEQ ID NO.1所示的全長(zhǎng)適配體。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的適配體組合文庫(kù)，由SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.36所示序列構(gòu)成。

本發(fā)明還提供一種篩選適配體的方法，該方法使用前述本發(fā)明任意項(xiàng)所述的適配體組合文庫(kù)篩選所需適配體，例如，能夠特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法，其包括：

(1)提供適配體組合文庫(kù)；

(2)將適配體組合文庫(kù)中的每一個(gè)分子與靶蛋白(例如EPO蛋白)接觸；

(3)檢測(cè)適配體組合文庫(kù)中每一個(gè)分子與靶蛋白之間的親和力。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法，該方法采用表面等離子體共振法(SPR法)檢測(cè)每一個(gè)分子與靶蛋白之間的親和力。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的適配體篩選方法，包括以下步驟：

1)將靶蛋白固定于芯片(例如SA芯片)表面；

2)進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析，進(jìn)樣，使所述適配體組合文庫(kù)中的分子與固定在芯片表面的靶蛋白結(jié)合，生成復(fù)合物，進(jìn)樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，得到各序列單點(diǎn)RU值變化曲線，根據(jù)響應(yīng)值(RU值)判斷待篩選適配體是否具有活性，RU值大于0的適配體具有活性；

3)對(duì)于具有活性的分子，進(jìn)行多循環(huán)動(dòng)力學(xué)分析(MCK分析)，得到解離常數(shù)K_D，根據(jù)K_D數(shù)值的大小判斷每個(gè)分子與靶蛋白之間的親和力，K_D數(shù)值越小，親和力越強(qiáng)。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法或任意上文適用的實(shí)施方式，其中，步驟1)是將所述靶蛋白偶聯(lián)生物素后固定在芯片表面，例如，所述靶蛋白在氨基酸殘基的氨基末端、羧基末端或糖基的唾液酸末端與生物素共價(jià)偶聯(lián)，優(yōu)選靶蛋白與生物素共價(jià)偶聯(lián)的化學(xué)計(jì)量比為1:1。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法或任意上文適用的實(shí)施方式，其中，步驟2)所述適配體組合文庫(kù)中的分子于90～98℃(例如95℃)變性5～10min(例如5min)，自然冷卻至室溫，再進(jìn)樣，進(jìn)樣溫度為20～30℃(例如25℃)，進(jìn)樣結(jié)合時(shí)間為60～180秒(例如120秒)，解離時(shí)間為120～600秒(例如300秒)，流速為20～50μL/min(例如30μL/min)，所用緩沖液為T(mén)ris-T緩沖液。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法或任意上文適用的實(shí)施方式，本發(fā)明所述的適配體篩選方法，其中，步驟3)中所述MCK分析，將所述適配體組合文庫(kù)中的分子于90～98℃(例如95℃)變性5～10min(例如5min)，自然冷卻至室溫，再進(jìn)樣，進(jìn)樣溫度為20～30℃(例如25℃)，進(jìn)樣結(jié)合時(shí)間為60～180秒(例如120秒)，解離時(shí)間為120～600秒(例如300秒)，流速為20～50μL/min(例如30μL/min)，MCK分析過(guò)程中所用緩沖液為T(mén)ris-T緩沖液。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法或任意上文適用的實(shí)施方式，其中所述的Tris-T緩沖液的配方為：20mM Tris，140mM NaCl，5mM MgCl2，5mM KCl，Tween 20，以HCl調(diào)至pH為7.4-7.6。其中，Tween 20濃度范圍為0.005％～0.1％，例如為0.05％。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的適配體的篩選方法或任意上文適用的實(shí)施方式，其中，芯片的再生條件可以為高離子強(qiáng)度的鹽，例如1～3M NaCl，例如3M NaCl；也可以為酸性條件，例如pH為1.5～2.5的10mM甘氨酸，例如pH為2.5的10mM甘氨酸；還可以為堿性條件，例如1-15mM NaOH，例如5mM NaOH。優(yōu)選的再生條件為5mM NaOH，再生時(shí)間為15秒。

本發(fā)明還提供一種能夠特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體，其選自SEQ ID NO.4～9所示的序列，以及如式I至式VII所示的序列，

N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGGTTTGGG(式I)

AGAGAGAGAGAGAGA-N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGG-TTTGGG-TCTCTC TCTCTCTCT(式II)

GAGAGAGAGAGA-N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGGTTT-GGG-TCTCTCTCTCTC(式III)

GAGAGAGAGA-N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGGTTT-GGG-TCTCTCTCTC(式IV)

AGAGAGA-N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGGTTTGGG-TCTCTCT(式V)

GAGAGA-N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGGTTTGGG-TCTCTC(式VI)

AGAGA-N-AGGT-Y-TGTTTTTGGGGTTGGTTTGGG-TCTCT(式VII)

其中，N為G、A、C或T；Y為C或T。

本發(fā)明還提供所述能夠特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體用于檢測(cè)EPO蛋白的用途。

本發(fā)明還提供用于檢測(cè)EPO蛋白的組合物、試劑盒或芯片，其中含有上述本發(fā)明所述的能夠特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體。

本發(fā)明還提供一種檢測(cè)EPO蛋白的方法，包括：

(1)提供待測(cè)樣品；

(2)使權(quán)利要求16所述的適配體與待測(cè)樣品接觸；

(3)檢測(cè)適配體與EPO之間的結(jié)合。

本發(fā)明中，所述的待優(yōu)化適配體，可以是任何與靶分子形成高親和力或高特異性結(jié)合的適配體，例如能夠特異性結(jié)合EPO蛋白的適配體。

本發(fā)明中，所述的EPO蛋白可以是天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白或rHuEP O-β蛋白，也可以是去糖基化的上述EPO蛋白。

發(fā)明詳述

發(fā)明人選擇重組人促紅細(xì)胞生成素-α(recombinant human Erythropoietin-α，rHuEPO-α，簡(jiǎn)稱(chēng)EPO-α)的單鏈DNA適配體828r作為初始序列或模式分子(參見(jiàn)CN102191250A；Bioorg.Med.Chem.2010，18，8016-8025)，具體說(shuō)明本發(fā)明的所述構(gòu)建適配體組合文庫(kù)的方法，基于上述構(gòu)建適配體組合文庫(kù)的方法構(gòu)建的適配體組合文庫(kù)，以及通過(guò)所構(gòu)建的適配體組合文庫(kù)篩選所需適配體的方法。

該EPO-α的單鏈DNA適配體的如SEQ ID NO:1所示，其序列長(zhǎng)度為39nt，在本發(fā)明中將其命名為828r-39nt(簡(jiǎn)稱(chēng)39nt)。39nt的二級(jí)結(jié)構(gòu)呈莖環(huán)狀，其與EPO-α間的解離常數(shù)K_D通過(guò)EMSA法測(cè)定為K_{D(39nt/EPO-α)}＝39±27nM，其與EPO-α間的具體作用位點(diǎn)尚不明確。

發(fā)明人則巧妙地借助了組合化學(xué)思路，提出“序列中相鄰堿基位點(diǎn)極可能通過(guò)堿基堆積影響空間相互作用”的假說(shuō)，發(fā)明設(shè)計(jì)了四組步進(jìn)型序列，構(gòu)成步進(jìn)型適配體組合文庫(kù)。該文庫(kù)中的四組序列分別命名為向左收縮(Left contraction)分子群、向右收縮(Right contraction)分子群、兩端收縮(Inner contraction)分子群、和兩端擴(kuò)展(又稱(chēng)莖部延長(zhǎng)，Stem-nbp)分子群。

其中，向左收縮分子群是指在初始序列39nt的基礎(chǔ)上，從其5’末端逐級(jí)剪裁掉相鄰的兩個(gè)堿基，構(gòu)成從Left contraction 37、35、33、……、一直到Left contraction 21(簡(jiǎn)稱(chēng)L37、L35、L33、……、L21)等9條序列。向右收縮分子群則正好相反，是在初始序列807-39nt的基礎(chǔ)上，從其3’末端逐級(jí)剪裁掉相鄰的兩個(gè)堿基，構(gòu)成從Right contraction 37、35、33、……、一直到Right contraction 21(簡(jiǎn)稱(chēng)R37、R35、R33、……、R21)等9條序列。兩端收縮分子群是指在初始序列39nt的基礎(chǔ)上，從其5’和3’末端兩側(cè)各逐級(jí)剪裁掉單個(gè)堿基，構(gòu)成從Inner contraction 37、35、33、……、一直到Inner contraction 21(簡(jiǎn)稱(chēng)In37、In35、In33、……、In21)等9條序列。如此三組各9條序列，共得到27條序列(參見(jiàn)圖1)。莖部延長(zhǎng)分子群則指在保持適配體環(huán)部序列不變的情況下，其莖部序列改為第一序列(例如包含G和A的序列，例如GA、AGA、AGAGA、GAGAGA、AGAGAGA、GAGAGAGAGA、GAGAGAGAGAGA、AGAGAGAGAGAGAGA、)……第二序列(例如包含C和T的序列，例如TC、TCT、TCTCT、TCTCTC、TCTCTCT、TCTCTCTCTC、TCTCTCTCTCTC、TCTCTCTCTCTCTCT)互補(bǔ)堿基，構(gòu)成從Stem-2bp、3bp、5bp、6bp、7bp、10bp、12bp到Stem-15bp等8條序列。如此構(gòu)成的適配體步進(jìn)型組合文庫(kù)，僅用了35條序列，即涵蓋了能產(chǎn)生特異親和作用的大多數(shù)可能范圍，同時(shí)能夠明確特異性適配體中關(guān)鍵堿基位點(diǎn)的作用。這就為得到最短適配體，及探討可能的結(jié)合機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明人使用上述所構(gòu)建的步進(jìn)型適配體組合文庫(kù)篩選親和活性高的特異性結(jié)合EPO-α蛋白的適配體。篩選時(shí)，采用SPR法表征和評(píng)價(jià)適配體與靶分子間親和力。具體地，所使用的儀器可以是Biacore T100、T200(美國(guó)GE公司)、ProteOn XPR36(美國(guó)伯樂(lè)公司)、Reichert4SPR(美國(guó)Reichert公司)等。

在測(cè)定親和活性時(shí)，采用鏈霉親和素包被的葡聚糖芯片(簡(jiǎn)稱(chēng)SA芯片)固定靶蛋白EPO-α。將EPO-α與生物素共價(jià)偶聯(lián)后，固定在SA芯片表面。

EPO-α與生物素共價(jià)偶聯(lián)后的產(chǎn)物稱(chēng)為生物素化EPO-α。EPO-α可以通過(guò)多種方式與生物素共價(jià)偶聯(lián)，共價(jià)偶聯(lián)的方式取決于EPO-α分子結(jié)構(gòu)中的末端基團(tuán)類(lèi)型。例如，所述EPO-α可以通過(guò)其氨基酸殘基的末端氨基偶聯(lián)生物素，或是其氨基酸殘基的末端羧基偶聯(lián)生物素，或是可以通過(guò)其糖基的末端唾液酸基團(tuán)偶聯(lián)生物素。

偶聯(lián)試劑的結(jié)構(gòu)中一般分為生物素基團(tuán)、反應(yīng)基團(tuán)以及連接臂部分。適當(dāng)?shù)倪B接臂長(zhǎng)度可以有效克服固定時(shí)的空間位阻?？梢愿鶕?jù)EPO-α末端基團(tuán)的類(lèi)型選擇不同的偶聯(lián)試劑。

例如，當(dāng)EPO-α的氨基酸殘基末端為氨基基團(tuán)時(shí)，選擇的生物素偶聯(lián)試劑可以為不同形式的琥珀酰亞胺化生物素，例如Sulfo-NHS-LC-Biotin(Sulfosuccinimidyl-6-[biotin-amido]hexanoate，6-[生物素酰胺基]己酸磺酸基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin(Sulfosuccinimidyl-6-[biotin-amido]-6-hexanamido hexanoate，6-[生物素酰胺基]-6-己酰氨基己酸-磺酸基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、NHS-LC-Biotin(Succinimidyl 6-(biotinamido)hexanoate，6-[生物素酰胺基]己酸-N-羥基琥 珀酰亞胺酯)、NHS-LC-LC-Biotin(Succinimidyl-6-(biotin-amido)-6-hexanamido hexanoate，6-[生物素酰胺基]-6-己酰氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、NHS-PEG4-Biotin(生物素四聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯)、NHS-PEG12-Biotin(生物素十二聚乙二醇N-羥基琥珀酰亞胺酯)等。

當(dāng)EPO-α的氨基酸殘基末端為羧基基團(tuán)時(shí)，選擇的生物素偶聯(lián)試劑可以為末端氨基化生物素，例如，Amine-PEG3-Biotin(生物素三聚乙二醇胺)、Biocytin Hydrazide(生物素酰肼)等，偶聯(lián)時(shí)需同時(shí)加入碳二亞胺(EDC)。

當(dāng)EPO-α的糖基末端為唾液酸時(shí)，選擇的生物素偶聯(lián)試劑可以為生物素化的肼，例如Biocytin Hydrazide(生物素酰肼)、Biotin-LC-Hydrazide(6-(biotinamido)hexanehydrazide，6-[生物素酰胺]-己酰肼)、Biotin-PEG4-Hydrazide(生物素四聚乙二醇酰肼)，偶聯(lián)時(shí)需先將唾液酸基團(tuán)以高碘酸鈉氧化成醛。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，EPO-α與偶聯(lián)試劑以1:1摩爾比共價(jià)偶聯(lián)，稱(chēng)為單分子生物素化EPO-α蛋白，簡(jiǎn)稱(chēng)Bio-EPO-α。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，EPO-α的氨基酸殘基末端為氨基基團(tuán)時(shí)，選取偶聯(lián)試劑Sulfo-NHS-LC-Biotin與EPO-α共價(jià)偶聯(lián)，得到單分子生物素化的NH₂-Bio-EPO-α。EPO-α的氨基酸殘基末端為羧基基團(tuán)時(shí)，選取偶聯(lián)試劑Biotin Hydrazide與EPO-α共價(jià)偶聯(lián)，得到單分子生物素化的COOH-Bio-EPO-α。EPO-α的糖基末端為唾液酸基團(tuán)時(shí)，選取偶聯(lián)試劑Biocytin Hydrazide與EPO-α共價(jià)偶聯(lián)，得到單分子生物素化的Sialyl-Bio-EPO-α。

在芯片表面固定靶蛋白時(shí)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，可以選擇不同水平的靶蛋白濃度。在進(jìn)行多循環(huán)動(dòng)力學(xué)(MCK)分析時(shí)，選擇適宜濃度，使目標(biāo)分析物的最大結(jié)合量(Rmax)≧30響應(yīng)單位(RU)即可。而若進(jìn)行穩(wěn)態(tài)分析，則靶蛋白濃度可以更高，以使固定量達(dá)到飽和。Rmax＝配體固定量×(目標(biāo)分析物的分子量/配體的分子量)×結(jié)合計(jì)量比。

在芯片表面固定靶蛋白時(shí)，還需要考察并優(yōu)化固定時(shí)間、流速等條件。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，首先以50mM NaOH、1M NaCl溶液進(jìn)行通道初始化，進(jìn)樣3次，流速為20μL/min，每次進(jìn)樣的時(shí)間為60秒，然后用70％甘油水溶液對(duì)芯片進(jìn)行歸一化處理。然后在將1μM的單分子生物素化的Sialyl-Bio-EPO或NH₂-Bio-EPO-α，在流速10μL/min，進(jìn)樣時(shí)間60秒的條件下，固定于SA芯片上。再生條件為5mM NaOH，流速30μL/min，再生時(shí)間為15秒。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用單點(diǎn)進(jìn)樣方式進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)，即單點(diǎn)篩選法，篩選出各適配體分子群中與EPO-α具有親和力的序列(又稱(chēng)活性序列)，具體表現(xiàn)為結(jié)合-解離曲線(即進(jìn)樣后，響應(yīng)值(RU值)的變化曲線)具有正響應(yīng)。單點(diǎn)進(jìn)樣，也就是單一濃度進(jìn)樣，能夠直觀地表示出樣品是否與靶蛋白存在結(jié)合活性的響應(yīng)(即RU值>0))。

SPR動(dòng)力學(xué)分析能夠確定在一個(gè)給定的時(shí)間跨度內(nèi)，適配體與固定在芯片上的靶蛋白 形成的復(fù)合物是否能夠結(jié)合和完全解離，進(jìn)樣后，適配體和靶蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，響應(yīng)值(RU值)增加；然后結(jié)束進(jìn)樣，注入空白緩沖溶液，復(fù)合物解離，RU值下降。

采用單點(diǎn)法篩選具有活性的適配體序列時(shí)，進(jìn)樣后，所述適配體組合文庫(kù)中的待篩選適配體與固定在芯片表面的靶蛋白結(jié)合，生成復(fù)合物，進(jìn)樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，得到各序列單點(diǎn)RU值變化曲線，根據(jù)響應(yīng)值(RU值)判斷待篩選適配體是否具有活性，RU值大于0的適配體具有活性。

對(duì)于具有活性的適配體序列，再進(jìn)行多循環(huán)動(dòng)力學(xué)分析(MCK分析)，得到親和力參數(shù)解離常數(shù)K_D，以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合速率常數(shù)K_a和解離速率常數(shù)K_d。其中K_D＝K_d/K_a。根據(jù)K_D數(shù)值的大小判斷待篩選適配體與靶蛋白之間的親和力，K_D數(shù)值越小，親和力越強(qiáng)，從而篩選出親和力強(qiáng)的適配體序列。

在進(jìn)行單點(diǎn)篩選或者進(jìn)行MCK分析時(shí)，所述適配體組合文庫(kù)中的待篩選適配體在進(jìn)樣前，均先于90～98℃(例如95℃)變性5～10min(例如5min)，自然冷卻至室溫，然后再進(jìn)樣。進(jìn)樣溫度為20～30℃(例如25℃)，進(jìn)樣結(jié)合時(shí)間為60～180秒(例如120秒)，解離時(shí)間為120～600秒(例如300秒)，流速為20～50μL/min(例如30μL/min)，所用緩沖液為T(mén)ris-T緩沖液。再生條件為5mM NaOH，流速30μL/min，再生時(shí)間為15秒。

其中所述的Tris-T緩沖液的配方為：20mM Tris，140mM NaCl，5mM MgCl2，5mM KCl，Tween 20，以HCl調(diào)至pH7.4-7.6。其中，Tween 20濃度范圍為0.005％～0.1％，優(yōu)選為0.05％。

在進(jìn)行單點(diǎn)篩選時(shí)，所述步進(jìn)型適配體組合文庫(kù)中的各序列進(jìn)樣濃度可以為200～1000nM，例如500nM。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，單點(diǎn)篩選可以通過(guò)以下具體步驟得以實(shí)現(xiàn)：

1)各適配體分子群的各序列進(jìn)樣濃度為500nM。各序列首先于95℃，5min變性后，自然冷卻至室溫。緩沖液Tris-T緩沖液的配方為：20mM Tris，140mM NaCl，5mM MgCl₂，5mM KCl，0.05％Tween 20，以HCl調(diào)至pH 7.4-7.6；

2)進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析實(shí)驗(yàn)(n≧2)，依據(jù)每條適配體序列的RU值篩選出具有活性的適配體序列，RU值>0的適配體序列具有活性。實(shí)驗(yàn)時(shí)，進(jìn)樣溫度選擇25℃，進(jìn)樣結(jié)合時(shí)間120s，解離時(shí)間300s，流速30μL/min；

3)再生條件可以為高離子強(qiáng)度的鹽，例如1～3M NaCl；也可以為酸性條件，例如10mM甘氨酸，pH 1.5～2.5；還可以為堿性條件，例如1-15mM NaOH。優(yōu)選再生條件為5mM NaOH，再生時(shí)間設(shè)為15秒。

在進(jìn)行MCK分析時(shí)，可以根據(jù)待分析適配體序列與EPO-α的單點(diǎn)結(jié)合的RU值，選擇合適的濃度梯度范圍進(jìn)行MCK分析。例如500nM的Stem-3bp，其RU值較低，僅為3，所選擇的濃度梯度則酌情選擇為較高濃度范圍，例如125nM～2000nM(各點(diǎn)間為倍增關(guān)系)；而500nM的Stem-7bp，其RU值較高，為80RU，選擇的濃度梯度為12.5nM ～400nM。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，MCK分析通過(guò)以下具體步驟得以實(shí)現(xiàn)：

1)各序列首先于95℃，5min變性后，自然冷卻至室溫。結(jié)合緩沖液為T(mén)ris-T緩沖液。

2)進(jìn)行MCK分析，進(jìn)樣結(jié)合時(shí)間設(shè)為120s，解離時(shí)間300s，流速30μL/min；再生條件為5mM NaOH，15秒。

3)對(duì)MCK結(jié)果進(jìn)行非線性擬合，得出K_a，K_d和K_D值。

在進(jìn)行MCK分析時(shí)，還需從擬合結(jié)果符合度判斷該非線性擬合結(jié)果是否正常。擬合結(jié)果符合度由U值和Chi²值決定。U值一般需≦15，說(shuō)明擬合符合度較高；U值越低，符合度越高，U值最低為1；Chi²一般需≦0.1Rmax，說(shuō)明擬合符合度較高。

采用本發(fā)明所述的適配體的篩選方法對(duì)所構(gòu)建的步進(jìn)型適配體組合文庫(kù)進(jìn)行篩選，結(jié)果表明：

1)向左收縮分子群，僅L37、L35、L33為活性序列，其K_D值分別為320±30nM、360±110nM和390±30nM，呈現(xiàn)從低到高逐漸增加的特征；

2)向右收縮分子群，僅R37、R35、R33、R31為活性序列，其K_D值分別為560±170nM、1300±150nM和140±40nM、130±30nM，基本呈現(xiàn)從高到低逐漸降低的特征；

3)兩端收縮分子群，In37、In35、In33、In31、In29、In27、In25有活性，但活性差別較大。其K_D值分別為310±120nM(In37)、390±40nM(In35)、750±30nM(In33)、390±50nM(In31)、200±1nM(In29)、52±4nM(In27)和2060±125nM(In25)，其K_D值從In37到In33逐漸升高，然后至In27又逐漸降低，In27的K_D值降低最為明顯，而后In25的K_D值又急劇升高，In23、In21的親和活性基本喪失；In 27是所有剪裁序列中親和活性最高的序列；

4)莖部延長(zhǎng)分子群，所有8條序列均有活性，其K_D值分別為390±50nM(Stem-2bp)、440±40nM(Stem-3bp)、80±10nM(Stem-5bp)、40±2nM(Stem-6bp)、30±5nM(Stem-7bp)、40±20nM(Stem-10bp)、40±0.1nM(Stem-12bp)、50±20nM(Stem-15bp)。其中僅Stem-2bp、Stem-3bp的親和活性較低，其K_D值從2bp一直到7bp逐漸降低，從7bp到15bp，其K_D值基本一致。親和活性最高的為Stem-7bp。同時(shí)，Stem-7bp、Stem-6bp、Stem-10bp、Stem-12bp、Stem-15bp的親和活性均優(yōu)于39nt。

可以看出，通過(guò)對(duì)本發(fā)明提供的步進(jìn)型適配體組合文庫(kù)進(jìn)行親和力及動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)，可迅速篩選得到親和力更強(qiáng)、序列更短的適配體序列In 27。

另外，根據(jù)上述4組適配體分子群的親和力及動(dòng)力學(xué)特征，也可以判斷適配體序列中是否存在關(guān)鍵識(shí)別位點(diǎn)。向左收縮分子群中，僅有能夠形成高級(jí)結(jié)構(gòu)G-四聚體結(jié)構(gòu)(GQ)的L37、L35、L33存在親和識(shí)別能力，并且隨著莖部結(jié)構(gòu)的縮短，親和活性也逐漸下降。

向右收縮分子群中，亦只有能夠形成高級(jí)結(jié)構(gòu)GQ的R37、R35、R33、R31具有親和活性，特別地，該分子群中，7A8A堿基是否充分暴露對(duì)親和活性有較大的影響。7A8A的 完全暴露(R33)較之被掩蔽(R35、R37)時(shí)，適配體的活性基本恢復(fù)。而7A8A去除前后(R33、R31)，活性基本相同。

而兩端收縮分子群中，隨著莖部的縮短，親和活性逐漸降低，而保留了整個(gè)環(huán)部的In27親和力完全恢復(fù)，提示可能形成了新的高級(jí)結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明還針對(duì)所得到的最短適配體In27，構(gòu)建了其定點(diǎn)突變分子群，以明確具體堿基位點(diǎn)對(duì)結(jié)合的貢獻(xiàn)。In27的二級(jí)序列特征為，僅保留了39nt的環(huán)部序列；其一級(jí)結(jié)構(gòu)序列特征為，--GG---------GGGG--GG--GGG；結(jié)合其圓二色譜結(jié)果，推測(cè)In27可能形成了以GQ為骨架的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

將最短適配體In27的堿基序列劃分為GQ骨架結(jié)構(gòu)和除GQ骨架外的5個(gè)結(jié)構(gòu)域(Domain)。從而構(gòu)建了各定點(diǎn)突變分子群，共7組，分別命名為D1、D2、D3&4、D5、GQ和簡(jiǎn)并序列定點(diǎn)突變分子群，共31條序列。其中：

D1定點(diǎn)突變分子群包括：1A堿基改為C/T/G/X、2A堿基改為T(mén)/G、以及1A2A堿基同時(shí)改為T(mén)堿基等7條序列；

D2定點(diǎn)突變分子群包括：6C堿基改為T(mén)/A/G/X、8G堿基改為T(mén)堿基、6C8G同時(shí)改為T(mén)堿基、11T堿基改為X(X代表該位點(diǎn)的堿基缺失)，以及10T11T堿基同時(shí)改為X等8條序列；

D3&4定點(diǎn)突變分子群包括：18T堿基改為A堿基、以及23T堿基改為A堿基等2條序列；

D5定點(diǎn)突變分子群包括：27G堿基改為A/T/X等3條序列；

GQ定點(diǎn)突變分子群包括：25G改為T(mén)/X(X代表該位點(diǎn)的堿基缺失)，即25T、25X；在6位的C改為T(mén)的前提下，14G、15G、16G、17G中的G堿基分別改為T(mén)堿基，即為14T、15T、16T、17T，以及14G15G、15G16G、16G17G、14G17G中的兩個(gè)G堿基均改為T(mén)堿基，即14T15T、15T16T、16T17T、14T17T等10條序列；

簡(jiǎn)并序列分子群包括1A6C堿基同時(shí)改為T(mén)堿基，即1T6T、1A6C27G堿基分別改為1T16T27A堿基、以及1A27G堿基改為1T27A堿基等3條序列。

利用單點(diǎn)篩選法，對(duì)所述定點(diǎn)突變分子群進(jìn)行其親和活性的篩選和評(píng)價(jià)。

結(jié)果表明，GQ骨架對(duì)識(shí)別非常重要，25G參與了GQ中GG骨架的形成，14-17位的G堿基均可能與GQ骨架相關(guān)；D2結(jié)構(gòu)域是最短適配體In27與EPO-α發(fā)生相互作用的主要結(jié)構(gòu)域；D2、D3、D4環(huán)上的序列保守性較高，除6C外，其他堿基不能任意改動(dòng)。該結(jié)果表明了In27的高度保守性。

從而可得到其簡(jiǎn)并序列為：

¹NAGGT⁶YTGT¹⁰TTTTGGGGTT²⁰GGTTTGGG

其中，N代表A、G、T或C，Y代表C或T。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果包括以下一個(gè)或多個(gè)方面：

1)本發(fā)明提供的構(gòu)建適配體組合文庫(kù)的方法，采用高效的結(jié)構(gòu)剪裁方式構(gòu)建內(nèi)含較少序列的組合文庫(kù)，所構(gòu)建的適配體組合文庫(kù)涵蓋了能產(chǎn)生特異親和作用的大多數(shù)可能范圍，為得到最短適配體，及探討可能的結(jié)合機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

2)本發(fā)明提供的適配體篩選方法，使用本發(fā)明提供的適配體組合文庫(kù)篩選適配體，可篩選出親和力更優(yōu)、無(wú)冗余序列的最短適配體活性序列，并能夠明確特異性適配體中關(guān)鍵堿基位點(diǎn)的作用。

3)應(yīng)用本發(fā)明提供的適配體篩選方法，篩選得到了親和力更優(yōu)的序列：Stem-7bp、Stem-6bp、Stem-10bp、Stem-12bp、Stem-15bp、In27，其中In27為無(wú)冗余序列的最短適配體活性序列。這些序列可以用于檢測(cè)EPO蛋白。

4)對(duì)于篩選得到的該最短適配體序列In27，結(jié)合該序列的特征，利用定點(diǎn)堿基突變，闡明了關(guān)鍵堿基對(duì)結(jié)合的貢獻(xiàn)。

5)得到最短適配體In27的簡(jiǎn)并序列。In27及其簡(jiǎn)并序列均具備和EPO-α間良好的親和活性，適于用作親和傳感功能元件。

附圖說(shuō)明

圖1.步進(jìn)型適配體組合文庫(kù)的序列構(gòu)成圖；

圖2.各定點(diǎn)突變分子群序列構(gòu)成圖；

圖3A.EPO-α的氨基酸殘基末端為氨基基團(tuán)時(shí)，與生物素共價(jià)偶聯(lián)的反應(yīng)流程圖；

圖3B.EPO-α的氨基酸殘基末端為羧基基團(tuán)時(shí)，與生物素共價(jià)偶聯(lián)的反應(yīng)流程圖；

圖3C.EPO-α的糖基末端為唾液酸基團(tuán)時(shí)，與生物素共價(jià)偶聯(lián)的反應(yīng)流程圖；

圖4.在SA芯片上固定Bio-EPO-α(1μM)后的適配體序列(500nM，39nt)的結(jié)合響應(yīng)，其中：

(A)為在SA芯片上固定Bio-NH₂-EPO-α?xí)r的RU值變化曲線，RU_stability＝2342，固定條件：進(jìn)樣流速為10μL/min，進(jìn)樣時(shí)間為60秒；

(B)為500nM 39nt作為分析物評(píng)價(jià)Bio-NH₂-EPO的固定效果時(shí)的RU值變化曲線；

(C)為在SA芯片上固定Bio-Sialyl-EPO-α?xí)r的RU值變化曲線，RU_stability＝2342，固定條件：進(jìn)樣流速為10μL/min，進(jìn)樣時(shí)間為60秒；

(D)為500nM 39nt作為分析物評(píng)價(jià)Sialyl-NH₂-EPO的固定效果時(shí)的RU值變化曲線；

圖5A.SA芯片上固定Bio-NH₂-EPO-α?xí)r，39nt的結(jié)合解離譜圖；

圖5B.SA芯片上固定Sialyl-Bio-EPO-α?xí)r，39nt的的結(jié)合解離譜圖；

圖6.向左收縮適配體分子群各序列的單點(diǎn)RU值變化曲線；

圖7.向右收縮適配體分子群各序列的單點(diǎn)RU值變化曲線；

圖8.兩端收縮適配體分子群各序列的單點(diǎn)RU值變化曲線；

圖9.兩端延展適配體分子群各序列的單點(diǎn)RU值變化曲線；

圖10為In27在含不同濃度K⁺的Tris-HCl緩沖液中的圓二色譜圖；

圖11A.GQ定點(diǎn)突變適配體分子群中，14-17位的G堿基的定點(diǎn)突變單點(diǎn)篩選結(jié)果，參比序列為In27，每條序列濃度為500nM；

圖11B.圖11A中方框部分的局部放大圖，可以看到25位G堿基的定點(diǎn)突變單點(diǎn)篩選結(jié)果；

圖12.D1定點(diǎn)突變適配體分子群各序列的單點(diǎn)篩選結(jié)果，參比序列為In27，每條序列濃度為500nM；

圖13.D2定點(diǎn)突變適配體分子群各序列的單點(diǎn)篩選結(jié)果，參比序列為In27，每條序列濃度為500nM；

圖14.D3&4定點(diǎn)突變適配體分子群各序列的單點(diǎn)篩選結(jié)果，參比序列為In27，每條序列濃度為500nM；

圖15.D5定點(diǎn)突變適配體分子群各序列的單點(diǎn)篩選結(jié)果，參比序列為In27，每條序列濃度為500nM；

圖16.簡(jiǎn)并序列適配體分子群各序列的單點(diǎn)篩選結(jié)果，參比序列為In27，每條序列濃度為500nM；

圖17A.在SA芯片上固定3’-Biotin-39nt時(shí)，EPO-α的MCK譜圖，每條序列濃度為500nM；

圖17B.在SA芯片上固定3’-Biotin-12T-In27時(shí)，EPO-α的MCK譜圖，每條序列濃度為500nM。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)敘述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件和制造商建議的條件進(jìn)行，所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的產(chǎn)品。

本發(fā)明的實(shí)施例中采用SPR法表征和評(píng)價(jià)適配體與靶分子間親和力。具體地，所使用的儀器是BIAcore T100生物大分子相互作用儀，購(gòu)自美國(guó)GE公司。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，樣品以恒定的流速和濃度流過(guò)芯片表面，樣品中的待分析物(例如本發(fā)明所構(gòu)建的適配體步進(jìn)型組合文庫(kù)中的適配體)和固定在芯片表面的分子(例如NH₂-Bio-EPO-α或Sialyl-Bio-EPO-α)發(fā)生結(jié)合形成復(fù)合物，芯片表面物質(zhì)的質(zhì)量發(fā)生改變，儀器記錄下對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值(Response Unit，以下簡(jiǎn)稱(chēng)RU值)的變化。結(jié)束進(jìn)樣后，使空白緩沖液流過(guò)芯片表面，復(fù)合物發(fā)生解離，芯片表面物質(zhì)的質(zhì)量再次發(fā)生改變，儀器記錄對(duì)應(yīng)的RU值的變化。

該技術(shù)能夠跟蹤記錄樣品中的待分析物與芯片表面的分子結(jié)合、解離整個(gè)過(guò)程的變化，記錄RU值的變化，生成結(jié)合-解離曲線。通過(guò)多循環(huán)動(dòng)力學(xué)(Multiple Cycle Kinetics，MCK)分析，還能提供動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(例如，結(jié)合速率常數(shù)K_a、解離速率常數(shù)K_d)以及親和力數(shù)據(jù)(例如，解離常數(shù)K_D，K_D＝K_d/K_a)。

待分析的適配體序列與偶聯(lián)在芯片表面的分子結(jié)合后，RU值>0的適配體序列具有活性。對(duì)于具有活性的適配體序列，進(jìn)行MCK分析，可以得到各條適配體序列與EPO-α間的親和力及動(dòng)力學(xué)參數(shù)。親和力以解離常數(shù)K_D表征，K_D越低，則親和力越高。動(dòng)力學(xué)參數(shù)中，結(jié)合速率常數(shù)K_a表示分析物與配體分子間形成復(fù)合物的快慢，其數(shù)值相當(dāng)于1M的分析物與配體混合時(shí)形成的復(fù)合物的數(shù)量，單位為M^-1s^-1；解離速率常數(shù)K_d表示復(fù)合物解離的快慢，其數(shù)值相當(dāng)于復(fù)合物每秒解離的比例，單位為s^-1)。依活性不同，各條適配體與EPO-α的K_D值一般在nM～μM范圍。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的緩沖液如下：

1)5×PBS緩沖液，其配方為：0.75M NaCl，0.1M Na₃PO₄，pH值為7.2；

2)1×PBS緩沖液，其配方為：0.15M NaCl，0.02M Na₃PO₄，pH值為7.2；

3)5×Tris-HCl緩沖液，其配方為100mM Tris，700mM NaCl，25mM MgCl₂，25mM KCl，pH值為7.4-7.6；

4)Tris-T緩沖液，其配方為20mM Tris，140mM NaCl，5mM MgCl₂，5mM KCl，0.05wt％Tween 20，以HCl調(diào)至pH 7.4-7.6。

實(shí)施例1適配體步進(jìn)型組合文庫(kù)的構(gòu)建

如圖1所示，選擇SEQ ID NO:1所示的EPO-α的單鏈DNA適配體作為初始序列，分別構(gòu)建向左收縮分子群、向右收縮分子群、兩端收縮分子群和莖部延長(zhǎng)分子群，由這四個(gè)分子群共同構(gòu)成適配體步進(jìn)型組合文庫(kù)。

1)向左收縮分子群的構(gòu)建

在初始序列39nt的基礎(chǔ)上，從其5’末端逐級(jí)剪裁掉相鄰的兩個(gè)堿基，得到如表1中所示的Left contraction 37、35、33、……、一直到Left contraction 21(分別簡(jiǎn)稱(chēng)L37、L35、L33、……、L21)等9條序列。

2)向右收縮分子群的構(gòu)建

向右收縮分子群則正好相反，在初始序列39nt的基礎(chǔ)上，從其3’末端逐級(jí)剪裁掉相鄰的兩個(gè)堿基，得到如表1中所示的Right contraction 37、35、33、……、一直到Right contraction 21(分別簡(jiǎn)稱(chēng)R37、R35、R33、……、R21)等9條序列。

3)兩端收縮分子群的構(gòu)建

兩端收縮分子群是在初始序列39nt的基礎(chǔ)上，從其5’和3’末端兩側(cè)分別逐級(jí)剪裁掉一個(gè)堿基，得到如表1中所示的Inner contraction 37、35、33、……、一直到Inner contraction21(分別簡(jiǎn)稱(chēng)In37、In35、In33、……、In21)等9條序列。

4)莖部延長(zhǎng)分子群的構(gòu)建

莖部延長(zhǎng)分子群則是在保持適配體環(huán)部序列不變的情況下，其莖部序列改為包含G和A的第一序列……包含C和T的第二序列互補(bǔ)堿基，其中第一序列分別為：GA、AGA、AGAGA、GAGAGA、AGAGAGA、GAGAGAGAGA、GAGAGAGAGAGA、AGAGAGAGAGAGAGA，第二序列分別為：TC、TCT、TCTCT、TCTCTC、TCTCTCT、TCTCTCTCTC、TCTCTCTCTCTC、TCTCTCTCTCTCTCT。得到如表1中所示的Stem-2bp、Stem-3bp、Stem-5bp、Stem-6bp、Stem-7bp、Stem-10bp、Stem-12bp、Stem-15bp(分別簡(jiǎn)稱(chēng)為S2bp、S3bp、S5bp、S6bp、S7bp、S10bp、S12bp、S15bp)等8條序列。

本實(shí)施例所構(gòu)建的適配體步進(jìn)型組合文庫(kù)，僅用了35條序列，即涵蓋了能產(chǎn)生特異親和作用的大多數(shù)可能范圍。使用上述步進(jìn)型組合文庫(kù)篩選適配體，可以確定特異性適配體中關(guān)鍵堿基的位點(diǎn)，從而得到親和活性更優(yōu)、特異性更強(qiáng)的優(yōu)化適配體序列。

上述適配體步進(jìn)型組合文庫(kù)由上海生工生物工程公司合成。

表1步進(jìn)型組合文庫(kù)的序列表

實(shí)施例2EPO-α的氨基酸殘基末端為氨基基團(tuán)時(shí)，與生物素的共價(jià)偶聯(lián)

EPO-α的氨基酸殘基末端為氨基基團(tuán)時(shí)，與生物素共價(jià)偶聯(lián)的反應(yīng)流程如圖3A所示。

稱(chēng)取偶聯(lián)試劑(Sulfo-NHS-LC-Biotin，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司)0.35mg，252μL 5×PBS緩沖液，1008μL滅菌超純水，配制成1260μL的0.5mM Sulfo-NHS-LC-Biotin溶液，該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，并且避光操作。取15.5μL的EPO-α蛋白原液(3.25g/L，深圳賽保爾生物藥業(yè)公司贈(zèng)送)，加入20μL 5×PBS和64.5μL滅菌超純水，配制成100μL的0.5g/L EPO-α溶液。向該100μL 0.5mg/mL的EPO-α溶液中，加入6.25μL的0.5mM Sulfo-NHS-LC-Biotin溶液，混勻后，于室溫振蕩溫育30min。溫育反應(yīng)完成后，進(jìn)行純化，將反應(yīng)液加入到脫鹽小柱(如Zeba Spin脫鹽小柱，購(gòu)自Thermo公司)中，除去剩余的未反應(yīng)分子。重復(fù)純化2次。

將純化后的溶液離心濃縮至50μL，并利用紫外可見(jiàn)分光光度法，以HABA/Avidin法表征，得到生物素的標(biāo)記個(gè)數(shù)為1，即得到了單分子生物素化的NH₂-Bio-EPO-α。用紫外可見(jiàn)分光光度法對(duì)該NH₂-Bio-EPO-α的濃度進(jìn)行測(cè)定，濃度計(jì)算公式為：蛋白濃度(mg/mL)＝1.55A₂₈₀-0.76A₂₆₀)，計(jì)算得到的濃度為1.04g/L，回收率為103％。

實(shí)施例3EPO-α的氨基酸殘基末端羧基基團(tuán)時(shí)，與生物素的共價(jià)偶聯(lián)

EPO-α的氨基酸殘基末端為羧基基團(tuán)時(shí)，與生物素共價(jià)偶聯(lián)的反應(yīng)流程如圖3B所示。

稱(chēng)取偶聯(lián)試劑(Biotin Hydrazide，購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司)0.34mg，229μL滅菌超純水，配制成4mM Biotin Hydrazide溶液，該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，并且避光操作。取4mM Biotin Hydrazide溶液50μL，加入100μL的0.5M 2-(N-嗎啡啉)-乙磺酸溶液(MES溶液，pH＝5.0)和350μL滅菌超純水，配制成0.4mM Biotin Hydrazide溶液，緩沖體系為0.1M MES(pH 5.2)。稱(chēng)取碳二亞胺(EDC)5.57mg，加入1166μL滅菌超純水配制成25mM EDC溶液。取40μL的25mM EDC溶液，加入200μL的0.5M MES溶液(pH＝5.0)，760μL滅菌超純水配制成1mM EDC溶液，緩沖體系為0.1M MES(pH 5.2)。 取15.5μL的EPO-α蛋白原液(3.25g/L)，加入20μL的0.5M MES緩沖液和64.5μL滅菌超純水配制為100μL的0.5g/L EPO-α溶液。向該100μL 0.5g/L的EPO-α溶液中，加入7.5μL的0.4mM Biotin Hydrazide溶液和15μL的1mM EDC溶液混勻后，于室溫振蕩溫育2h。溫育反應(yīng)完成后，進(jìn)行純化，將反應(yīng)液加入到脫鹽小柱(如Zeba Spin脫鹽小柱，購(gòu)自Thermo公司)中，除去剩余的未反應(yīng)分子，并把反應(yīng)緩沖體系換成PBS緩沖液。重復(fù)純化2次，得到純化后的溶液。

將純化后的溶液離心濃縮至50μL，并利用紫外可見(jiàn)分光光度法，以HABA/Avidin法表征，得到生物素的標(biāo)記個(gè)數(shù)為1，即得到了單分子生物素化的COOH-Bio-EPO-α。用紫外可見(jiàn)分光光度法對(duì)該COOH-Bio-EPO-α的濃度進(jìn)行測(cè)定，濃度計(jì)算公式同實(shí)施例1，計(jì)算得到的濃度為1.07g/L，回收率為109％。

實(shí)施例4EPO-α的糖基末端為唾液酸基團(tuán)時(shí)，與生物素的共價(jià)偶聯(lián)

EPO-α的糖基末端為唾液酸基團(tuán)時(shí)，與生物素共價(jià)偶聯(lián)的反應(yīng)流程如圖3C所示。

避光稱(chēng)取8.96mg高碘酸鈉(NaIO₄)，加入873.8μL滅菌超純水，得到終濃度為50mM的NaIO₄儲(chǔ)備液，取4μL的50mM NaIO₄儲(chǔ)備液加入40μL的0.5M醋酸鈉(NaAc)溶液(pH＝5.5)，156μL滅菌超純水配制成1mM NaIO₄溶液，緩沖體系為0.1M NaAc(pH5.5)。取15.5μL的EPO-α蛋白原液(3.25g/L)，加入20μL 0.5M NaAc溶液和64.5μL滅菌超純水配制成100μL的0.5g/L EPO-α溶液。向該100μL的0.5g/L EPO-α溶液中，加入2.35μL的1mM NaIO₄溶液混勻，于4℃避光振蕩溫育30min。溫育反應(yīng)完成后，進(jìn)行純化，將反應(yīng)液加入到脫鹽小柱(如Zeba Spin脫鹽小柱，購(gòu)自Thermo公司)中，除去剩余的未反應(yīng)分子，并把反應(yīng)緩沖體系換成PBS緩沖液。重復(fù)純化2次，得到純化后的EPO-α反應(yīng)液。

避光稱(chēng)取0.31mg偶聯(lián)試劑Biocytin Hydrazide，加入333.8μL的PBS緩沖液，得到終濃度為2.5mM的Biocytin Hydrazide溶液。向純化后的EPO-α反應(yīng)液中，加入4.7μL的2.5mM Biocytin Hydrazide溶液，混勻，于室溫下避光振蕩溫育2小時(shí)。溫育反應(yīng)完成后，進(jìn)行純化，將反應(yīng)液加入到脫鹽小柱(如Zeba Spin脫鹽小柱，購(gòu)自Thermo公司)中，除去剩余的未反應(yīng)分子。重復(fù)純化2次，得到純化后的溶液。

將純化后的溶液離心濃縮至50μL。并利用紫外可見(jiàn)分光光度法，以HABA/Avidin法表征，得到生物素的標(biāo)記個(gè)數(shù)為1，即得到了單分子生物素化的Sialyl-Bio-EPO-α。用紫外可見(jiàn)分光光度法對(duì)該Sialyl-Bio-EPO-α的濃度進(jìn)行測(cè)定，濃度計(jì)算公式同實(shí)施例1，計(jì)算得到的濃度為1.38mg/mL，回收率為137％。

實(shí)施例5SA芯片上NH₂-Bio-EPO-α的固定

取2.7μL的NH₂-Bio-EPO-α儲(chǔ)備液(該儲(chǔ)備液用超純水配置，濃度為36.5μM)，加入20μL的5×Tris-HCl緩沖液和77.3μL純化水，即得到1μM的NH₂-Bio-EPO-α溶液。

取用一塊新的SA芯片，首先以50mM NaOH，1M NaCl溶液進(jìn)行通道初始化。進(jìn)樣3次，流速為20μL/min，每次進(jìn)樣的時(shí)間為60秒。然后用70％甘油水溶液對(duì)SA芯片進(jìn)行歸一化處理。

在流速為10μL/min的條件下進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間為60秒，將1μM的NH₂-Bio-EPO-α(制備方法見(jiàn)實(shí)施例2)固定于SA芯片的通道2上。進(jìn)樣過(guò)程中，Bio-NH₂-EPO-α與SA芯片形成生物素-鏈霉親和素強(qiáng)非共價(jià)結(jié)合，RU值上升。進(jìn)樣結(jié)束時(shí)，RU值上升至最大值。然后再以空白緩沖液沖洗SA芯片表面，除去附著的Bio-NH₂-EPO-α，RU值會(huì)略有下降。RU值變化曲線參見(jiàn)圖4中的(A)，上升后的最大RU值減去下降后的RU值，即得到響應(yīng)穩(wěn)定性(stability)RU值為2342，即，RU_stability＝2342。

以通道1為參比通道，使用500nM的39nt，對(duì)通道2上固定的Bio-NH₂-EPO-α蛋白的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。進(jìn)樣的流速為30μL/min，進(jìn)樣時(shí)間為120秒。進(jìn)樣后，39nt與Bio-NH₂-EPO-α蛋白形成非共價(jià)結(jié)合，RU值上升。進(jìn)樣結(jié)束時(shí)，RU值上升至最大值。然后再以空白緩沖液沖洗SA芯片表面，非共價(jià)結(jié)合物解離，RU值下降。RU值變化曲線(即結(jié)合-解離曲線)參見(jiàn)圖4中的(B)，39nt與Bio-NH₂-EPO-α蛋白結(jié)合的過(guò)程中，RU最大值減去RU最小值即為相應(yīng)穩(wěn)定性ΔRU，2-1通道的響應(yīng)穩(wěn)定性ΔRU為30。說(shuō)明該固定方式下，EPO-α和39nt間保留著親和活性。

再生條件為5mM NaOH，流速30μL/min，再生時(shí)間為15秒。

實(shí)施例6SA芯片上Sialyl-Bio-EPO-α的固定

取1.8μL的Sialyl-Bio-EPO-α儲(chǔ)備液(該儲(chǔ)備液用超純水配置，濃度為54.3μM)，加入20μL的5×Tris-HCl緩沖液和78.2μL純化水，即得到1μM Sialyl-Bio-EPO溶液。

取用一塊新的SA芯片，首先以50mM NaOH、1M NaCl溶液進(jìn)行通道初始化。進(jìn)樣3次，流速為20μL/min，每次進(jìn)樣的時(shí)間為60秒。然后用70％甘油水溶液對(duì)芯片進(jìn)行歸一化處理。

在流速為10μL/min的條件下進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間為60秒，將1μM的Sialyl-Bio-EPO-α(制備方法見(jiàn)實(shí)施例4)固定于SA芯片通道4上。RU值變化曲線參見(jiàn)圖4中的(C)，響應(yīng)穩(wěn)定性(stability)RU值上升了1159，即，RU_stability＝1159。

以通道3為參比通道，使用500nM的39nt，對(duì)通道4上固定的Sialyl-Bio-EPO-α蛋白的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。進(jìn)樣的流速為30μL/min，進(jìn)樣時(shí)間為120秒。RU值變化曲線參見(jiàn)圖4中的(D)，4-3通道的響應(yīng)穩(wěn)定性ΔRU為50。說(shuō)明該固定方式下，EPO-α和39nt間仍然保留著親和活性。

再生條件為5mM NaOH，流速30μL/min，再生時(shí)間為15秒。

實(shí)施例7 39nt的MCK分析

取2μL的100μM 39nt儲(chǔ)備液(該儲(chǔ)備液用超純水配置)，加入4μL的5×Tris-HCl 緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，以及12μL滅菌超純水，得到10μM的39nt溶液。取該39nt溶液20μL，加入380μL的Tris-T緩沖液，即得到500nM的39nt溶液。采用Tris-T緩沖液倍比稀釋的方法，制備得到濃度分別為25、50、100、200、400nM的39nt溶液，于95℃下變性5分鐘，再自然冷卻至室溫。

在SA芯片上，使用NH₂-Bio-EPO-α(通道2)和Sialyl-Bio-EPO-α(通道4)，進(jìn)行EPO-α和39nt間的親和力和動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)合時(shí)間為120秒，解離時(shí)間為300秒，流速為30μL/min。再生條件為5mM NaOH，進(jìn)樣時(shí)間為15秒，流速為30μL/min。包含以空白溶劑為零點(diǎn)在內(nèi)的39nt六個(gè)濃度的進(jìn)樣順序?yàn)?、25nM、50nM、100nM、200nM、400nM，得到結(jié)合解離譜圖，如圖5A和圖5B所示，其中圖5A為通道2(固定NH₂-Bio-EPO-α)得到的結(jié)合解離譜圖，圖5B為通道4(固定Sialyl-Bio-EPO-α)得到的結(jié)合解離譜圖。

采用Biacore數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)圖5A和圖5B所示的結(jié)合解離譜圖進(jìn)行非線性擬合。結(jié)果表明，利用通道2-1數(shù)據(jù)得到39nt與EPO-α相互作用的解離常數(shù)K_D＝55nM，結(jié)合速率常數(shù)K_a＝1.6×10⁴M^-1s^-1，解離速率常數(shù)K_d＝8.9×10^-4s^-1(U-value＝1，Chi²＝0.13)。利用通道4-3數(shù)據(jù)得到39nt與EPO-α相互作用的解離常數(shù)K_D＝52nM，結(jié)合速率常數(shù)K_a＝1.8×10⁴M^-1s^-1，解離速率常數(shù)K_d＝9.3×10^-4s^-1(U-value＝1，Chi²＝0.07)。上述結(jié)果表明以NH₂-Bio-EPO-α和Sialyl-Bio-EPO-α為固定方式時(shí)，兩者符合度較好，也說(shuō)明了SPR方法已經(jīng)成功建立。

較之Sialyl-Bio-EPO-α，NH₂-Bio-EPO-α對(duì)5mM NaOH為再生條件的耐受性更高。

實(shí)施例8向左收縮適配體分子群在SA芯片上的單點(diǎn)活性評(píng)價(jià)及活性序列的MCK分析

待評(píng)價(jià)的適配體序列為：向左收縮適配體分子群中的所有序列，包括L21、L23、L25、L27、L29、L31、L33、L35、L37，以及參比序列39nt，共10條序列。分別量取2μL上述10條序列的儲(chǔ)備液(該儲(chǔ)備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲(chǔ)備液。取20μL的各序列中間儲(chǔ)備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的向左收縮適配體分子群中的各序列以及參比序列39nt作為分析物，采用單點(diǎn)篩選法進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析。具體實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例7。進(jìn)樣后，待分析物與SA芯片上的EPO-α結(jié)合，生成復(fù)合物，進(jìn)樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，各序列單點(diǎn)RU值變化曲線圖如圖6所示。

結(jié)果表明，僅有能夠形成高級(jí)結(jié)構(gòu)G-四聚體(以下簡(jiǎn)稱(chēng)GQ)結(jié)構(gòu)的L37、L35、L33存在親和識(shí)別能力，并且隨著莖部結(jié)構(gòu)的縮短，響應(yīng)值也逐漸下降。

針對(duì)L37、L35、L33這三條活性序列，分別選取濃度為31.25-1000nM(L37)；62.5-2000 nM(L35)；62.5-2000nM(L33)，進(jìn)行MCK分析。具體SPR條件同實(shí)施例7。得到親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如表2所示。結(jié)果表明，其K_D值分別為320±30nM、360±110nM和390±30nM，呈現(xiàn)從低到高逐漸增加的特征。

表2向左收縮適配體分子群的親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

實(shí)例9向右收縮適配體分子群在SA芯片上的單點(diǎn)活性評(píng)價(jià)及活性序列的MCK分析

待評(píng)價(jià)的適配體序列為：向右收縮適配體分子群中的所有序列，包括R21、R23、R25、R27、R29、R31、R33、R35、R37，以及參比序列39nt，共10條序列。分別量取2μL上述10條序列的儲(chǔ)備液(該儲(chǔ)備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲(chǔ)備液。取20μL的各序列中間儲(chǔ)備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的向右收縮適配體分子群中的各序列以及參比序列39nt為分析物，采用單點(diǎn)篩選法進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析。具體實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例7。進(jìn)樣后，待分析物與SA芯片上的EPO-α結(jié)合，生成復(fù)合物，進(jìn)樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，各序列單點(diǎn)RU值變化曲線圖如圖7所示。

結(jié)果表明，只有能夠形成高級(jí)結(jié)構(gòu)GQ的R37、R35、R33、R31具有親和活性，特別地，該分子群中，7A8A位點(diǎn)的堿基是否充分暴露對(duì)響應(yīng)值有較大的影響。7A8A位點(diǎn)的的堿基完全暴露(R33)較之被掩蔽(R35、R37)時(shí)，適配體的活性基本恢復(fù)。而7A8A位點(diǎn)的堿基去除前(R33)和去除后(R31)，響應(yīng)值基本相同。

針對(duì)R37、R35、R33、R31這三條活性序列，分別選取濃度為31.25-1000nM(R37)；125-4000nM(R35)；31.25-1000nM(R33)；31.25-1000nM(R31)，進(jìn)行MCK分析。具體SPR條件同實(shí)施例7。得到親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如表3所示。結(jié)果表明，其K_D值分別為560±170nM、1300±150nM、140±40nM和130±30nM，呈現(xiàn)從高到低逐漸降低的特征。

表3向右收縮適配體分子群的親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

實(shí)施例10兩端延展適配體分子群在SA芯片上的單點(diǎn)活性評(píng)價(jià)及活性序列的MCK分析

待評(píng)價(jià)的適配體序列為：兩端延展適配體分子群中的所有序列，包括Stem-2bp、Stem-3bp、Stem-5bp、Stem-6bp、Stem-7bp、Stem-10bp、Stem-12bp、Stem-15bp，以及參比序列39nt，共10條序列。分別量取2μL上述10條序列的儲(chǔ)備液(儲(chǔ)備液的濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列儲(chǔ)備液。取20μL的各序列儲(chǔ)備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的兩端延展適配體分子群中的各序列以及參比序列39nt為分析物，采用單點(diǎn)篩選法進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析。具體實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例7。進(jìn)樣后，待分析物與SA芯片上的EPO-α結(jié)合，生成復(fù)合物，進(jìn)樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，各序列單點(diǎn)RU值變化曲線圖如圖8所示。

結(jié)果表明，從Stem-2bp到Stem-7bp，隨著莖部的延長(zhǎng)，響應(yīng)值逐漸升高。而從Stem-7bp一直到Stem-15bp，響應(yīng)值則逐漸下降。除Stem-5bp外，其它序列的響應(yīng)值均高于陽(yáng)性序列39nt。而親和活性的最大增強(qiáng)出現(xiàn)于Stem-7bp。

針對(duì)兩端延展適配體分子群中的所有序列，分別選取濃度為31.25-1000nM(2bp)、125-4000nM(3bp)、31.25-500nM(5bp)、31.25-500nM(6bp)、31.25-500nM(7bp)、31.25-500nM(10bp)、31.25-500nM(12bp)、31.25-500nM(15bp)，進(jìn)行MCK分析。具體SPR條件同實(shí)施例7。得到親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如表4所示。結(jié)果表明，K_D值從Stem-2bp一直到Stem-7bp逐漸降低，然從Stem-7bp到Stem-15bp，其K_D值基本趨平。親和活性最高的為Stem-7bp。同時(shí)，Stem-7bp、Stem-6bp的親和活性均優(yōu)于39nt。

表4兩端延展適配體分子群的親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

實(shí)施例11兩端收縮適配體分子群在SA芯片上的單點(diǎn)活性評(píng)價(jià)及活性序列的MCK分析

待評(píng)價(jià)的適配體序列為：兩端收縮適配體分子群中的所有序列，包括In21、In23、In25、In27、In29、In31、In33、In35、In37，以及參比序列39nt，共10條序列。分別量取2μL上述10條序列的儲(chǔ)備液(該儲(chǔ)備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中 間儲(chǔ)備液。取20μL的各序列中間儲(chǔ)備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的兩端收縮適配體分子群中的各序列以及參比序列39nt為分析物，采用單點(diǎn)篩選法進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析。具體實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例7。進(jìn)樣后，待分析物與SA芯片上的EPO-α結(jié)合，生成復(fù)合物，進(jìn)樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，各序列單點(diǎn)RU值變化曲線圖如圖9所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著莖部的縮短，響應(yīng)值逐漸降低，而保留了整個(gè)環(huán)部的In27親和力完全恢復(fù)，提示可能形成了新的高級(jí)結(jié)構(gòu)。

針對(duì)In37、In35、In33、In31、In29、In27、In25這七條活性序列，分別選取濃度為31.25-1000nM(In37、In31)、125-4000nM(In35、In33、In25)、62.5-2000nM(In29)、12.5-400nM(In27)，進(jìn)行MCK分析。具體SPR條件同實(shí)施例7。得到親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如表5所示。結(jié)果表明，K_D值從In37到In33逐漸升高，然后又逐漸降低，In27的K_D值降低最為明顯，而后In25的K_D值又急劇升高，In 27是所有剪裁序列中親和活性最高的序列。

表5兩端收縮適配體分子群的親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

實(shí)施例12采用圓二色譜測(cè)定In27可能形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)

分別取0.6OD(0.6OD相當(dāng)于0.6*33μg＝19.8μg)的In27凍干粉溶解于含有不同濃度K⁺的三種Tris-HCl(20mM Tris，140mM NaCl，5mM MgCl₂，以HCl調(diào)至pH 7.4-7.6)緩沖液中，其中KCl分別為0、5、100mM。設(shè)定溫度為25℃，進(jìn)行圓二色譜測(cè)定，得到如圖10所示的圓二色譜圖。所用儀器為MOS-450多功能圓二色光譜儀，法國(guó)BioLogic Science Instruments公司，比色池光程1cm。

從圖10所示的圓二色譜圖可以看出，在不同濃度K⁺的Tris-HCl緩沖液中，In27均在260nm處形成了負(fù)峰，在290nm處形成了正峰，符合反平行G-四聚體(GQ)的高級(jí)構(gòu)象特征。說(shuō)明In27在Tris-HCl緩沖液中形成了反平行G四聚體結(jié)構(gòu)。K⁺具有誘導(dǎo)促進(jìn)G-四聚體高級(jí)結(jié)構(gòu)形成的作用，但該圓二色譜圖中可以看出，K⁺的濃度為0和5mM時(shí)，所形成的譜圖幾乎重合，說(shuō)明In27自身便可形成G-四聚體，且該高級(jí)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，K⁺存在與否對(duì)In27的高級(jí)結(jié)構(gòu)影響不顯著。

實(shí)施例13構(gòu)建In27的定點(diǎn)突變適配體分子群

針對(duì)最短適配體In27，構(gòu)建其定點(diǎn)突變分子群，以明確In27與EPO-α特異性結(jié)合時(shí)，具體堿基位點(diǎn)的貢獻(xiàn)。

In27的二級(jí)序列特征為：僅保留了39nt的環(huán)部序列，其一級(jí)結(jié)構(gòu)序列特征為，--GG---------GGGG--GG--GGG；結(jié)合其圓二色譜結(jié)果，推測(cè)In27可能形成了以GQ為骨架的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

除In27上的GG骨架外，其它序列按-GG(G)-為間隔，劃分為D1～5個(gè)結(jié)構(gòu)域(Domain)，進(jìn)行定點(diǎn)突變。如圖2所示，構(gòu)建了各定點(diǎn)突變分子群，共6組，分別命名為GQ、D1、D2、D3&4、D5和簡(jiǎn)并序列定點(diǎn)突變分子群，共31條序列。突變遵循的大原則是：基于經(jīng)驗(yàn)的試錯(cuò)法，其目的在于找到簡(jiǎn)并序列，使該優(yōu)化適配體能夠有更廣泛的適用性?？紤]到G-C配對(duì)，不引入C堿基；考慮到G四聚體高級(jí)結(jié)構(gòu)的連接子一般為T(mén)n或T+A等有序結(jié)構(gòu)，將非T堿基換為T(mén)；對(duì)于有序結(jié)構(gòu)如從第9位T開(kāi)始的T5G4T2G2T3G3(此處“T5G4T2G2T3G3”是指連續(xù)的5個(gè)T、4個(gè)G等等)，僅采取連續(xù)T截短、T突變?yōu)锳等處理；對(duì)于前8位中的非G堿基，基本上采用窮舉法。

如表6中所示，

D1定點(diǎn)突變適配體分子群包括：1A堿基改為C/T/G/X、2A堿基改為T(mén)/G、以及1A2A堿基同時(shí)改為T(mén)堿基等7條序列；

D2定點(diǎn)突變適配體分子群包括：6C堿基改為T(mén)/A/G/X、8G堿基改為T(mén)堿基、6C8G同時(shí)改為T(mén)堿基、11T堿基改為X，以及10T11T堿基同時(shí)改為X等8條序列；

D3&4定點(diǎn)突變適配體分子群包括：18T堿基改為A堿基、以及23T堿基改為A堿基等2條序列；

D5定點(diǎn)突變適配體分子群包括：27G堿基改為A/T/X等3條序列；

GQ定點(diǎn)突變適配體分子群包括：25G改為T(mén)/X(X代表無(wú))，即25T、25X；在6位的C改為T(mén)的前提下，14G、15G、16G、17G中的G堿基分別改為T(mén)堿基，即為14T、15T、16T、17T，以及14G15G、15G16G、16G17G、14G17G中的兩個(gè)G堿基均改為T(mén)堿基，即14T15T、15T16T、16T17T、14T17T等10條序列；

簡(jiǎn)并序列適配體分子群包括1A6C堿基同時(shí)改為T(mén)堿基，即1T6T；1A6C27G堿基分別改為1T6T27A堿基；以及1A27G堿基改為1T27A堿基等3條序列。

上述適配體步進(jìn)型組合文庫(kù)由上海生工生物工程公司合成。

表6In27的定點(diǎn)突變適配體分子群

注：表6中，“～”表示該位置的堿基缺失。

實(shí)施例14GQ定點(diǎn)突變分子群在SA芯片上的單點(diǎn)活性評(píng)價(jià)

GQ定點(diǎn)突變適配體分子群中的所有序列，包括如SEQ ID NO.57～SEQ ID NO.66所示的In27-6T14T、In27-6T15T、In27-6T16T、In27-6T17T、In27-6T1415TT、In27-6T1516TT、In27-6T1617TT、In27-6T1417T、In27-6T25X、In27-6T25T，以及參比序列In27(如SEQ ID NO.33所示)，共11條序列，分別量取2μL上述11條序列的儲(chǔ)備液(該儲(chǔ)備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲(chǔ)備液。取20μL的各序列中間儲(chǔ)備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自 然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的GQ定點(diǎn)突變適配體分子群中的各序列以及參比序列In27為分析物，采用單點(diǎn)篩選法進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析。具體實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例7。進(jìn)樣后，待分析物與SA芯片上的EPO-α結(jié)合，生成復(fù)合物，進(jìn)樣結(jié)束，注入空白緩沖溶液，芯片上的復(fù)合物發(fā)生解離，各序列單點(diǎn)RU值變化曲線如圖11A和圖11B所示。

結(jié)果表明，與In27相比，對(duì)14到17位上的G堿基進(jìn)行突變，其響應(yīng)值都大大降低，說(shuō)明在第三對(duì)GG骨架的形成可能具有一定的流動(dòng)性。而In27-25X和In27-25T活性也基本喪失，說(shuō)明25G可能參與了第四對(duì)GG骨架形成。

實(shí)施例15D1定點(diǎn)突變適配體分子群在SA芯片上的單點(diǎn)活性評(píng)價(jià)

D1定點(diǎn)突變適配體分子群中的所有序列，包括如SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.43所示的In27-1X、In27-1T、In27-1G、In27-1C、In27-2G、In27-2T、In27-1T2T，以及參比序列In27、39nt，共9條序列，分別量取2μL上述9條序列的儲(chǔ)備液(該儲(chǔ)備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲(chǔ)備液。取20μL的各序列中間儲(chǔ)備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的D1定點(diǎn)突變適配體分子群中的各序列以及參比序列In27、39nt為分析物，采用單點(diǎn)篩選法進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析。具體實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例7。各序列單點(diǎn)RU值變化曲線如圖12所示。

結(jié)果表明，與In27相比，In27-1T的響應(yīng)值略有升高，In27-1G與In27的響應(yīng)值基本持平，In27-1C的響應(yīng)值與39nt基本持平。而In27-2G、In27-2T和In27-1T2T的響應(yīng)值下降明顯。說(shuō)明在D1結(jié)構(gòu)域中1A能改為其它三種堿基而不影響活性，而2A堿基具有特異性。

實(shí)施例16D2定點(diǎn)突變適配體分子群在SA芯片上的單點(diǎn)活性評(píng)價(jià)

D2定點(diǎn)突變適配體分子群中的所有序列，包括如SEQ ID NO.44～SEQ ID NO.51所示的In27-6X、In27-6T、In27-6A、In27-6G、In27-8T、In27-6T8T、In27-11X、In27-10X11X，以及參比序列In27，共9條序列，分別量取2μL上述9條序列的儲(chǔ)備液(100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲(chǔ)備液。取20μL的各序列中間儲(chǔ)備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的D2定點(diǎn)突變適配體分子群中各序列以及參比序列In27為分析物，采用單點(diǎn)篩選法進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析。具體實(shí) 驗(yàn)條件同實(shí)施例7。各序列單點(diǎn)RU值變化曲線如圖13所示。

結(jié)果表明，與In27相比，In27-6T(RU 60)的親和活性略高，而In27-6A(RU 30)和In27-6G(RU 29)的響應(yīng)值有所下降。In27-6X(RU 15)、In27-11X(RU 3)和In27-10X11X(RU 5)的響應(yīng)值下降明顯，且與其它序列的動(dòng)力學(xué)特征不同，這三條序列結(jié)合和解離的速率都非常迅速。從而說(shuō)明D2結(jié)構(gòu)域是重要的識(shí)別位點(diǎn)，其11個(gè)堿基形成的結(jié)構(gòu)保證了識(shí)別活性的發(fā)揮。

實(shí)施例17D3&D4定點(diǎn)突變適配體分子群在SA芯片上的單點(diǎn)活性評(píng)價(jià)

D3&D4定點(diǎn)突變適配體分子群中的所有序列，包括如SEQ ID NO.52～SEQ ID NO.53所示的In27-18A、In27-23A，以及參比序列In27，共3條序列，分別量取2μL上述3條序列的儲(chǔ)備液(該儲(chǔ)備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲(chǔ)備液。取20μL的各序列中間儲(chǔ)備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的D3&D4定點(diǎn)突變適配體分子群中的各序列以及參比序列In27為分析物，采用單點(diǎn)篩選法進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析。具體實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例7。各序列單點(diǎn)RU值變化曲線如圖14所示。

結(jié)果表明，與In27相比，In27-18A(RU 8)以及In27-23A(RU 8)的響應(yīng)值下降明顯。說(shuō)明D3和D4結(jié)構(gòu)域在識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用。

實(shí)施例18D5定點(diǎn)突變適配體活性簇分子群在SA芯片上的單點(diǎn)活性評(píng)價(jià)

D5定點(diǎn)突變適配體分子群中的所有序列，包括如SEQ ID NO.54～SEQ ID NO.56所示的In27-27X、In27-27A、In27-27T，以及參比序列In27，共4條序列，分別量取2μL上述4條序列的儲(chǔ)備液(該儲(chǔ)備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1wt％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲(chǔ)備液。取20μL的各序列中間儲(chǔ)備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的D5定點(diǎn)突變適配體分子群中的各序列以及參比序列In27為分析物，采用單點(diǎn)篩選法進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析。具體實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例7。各序列單點(diǎn)RU值變化曲線如圖15所示。

結(jié)果表明，與In27相比，In27-27X(RU 6)、In27-27T(RU 5)和In27-27A(RU 3)的響應(yīng)值下降明顯。說(shuō)明27G堿基具有特異性。

實(shí)施例19簡(jiǎn)并序列適配體分子群在SA芯片上的單點(diǎn)活性評(píng)價(jià)

簡(jiǎn)并序列適配體分子群中的所有序列，包括如SEQ ID NO.67～SEQ ID NO.69所示的In27-1T6T、In27-1T27A、In27-1T6T27A，以及參比序列In27，共4條序列，分別量取2μL上述4條序列的儲(chǔ)備液(該儲(chǔ)備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入4μL的5×Tris-HCl緩沖液，2μL的1％Tween 20，12μL滅菌超純水，得到10μM的各序列中間儲(chǔ)備液。取20μL的各序列中間儲(chǔ)備液(10μM)，加入380μL的Tris-T緩沖液，得到500nM的各序列工作溶液，于95℃下變性5min，自然冷卻至室溫。

使用固定了NH₂-Bio-EPO-α的SA芯片，以所述500nM的簡(jiǎn)并序列適配體分子群中的各序列以及參比序列In27為分析物，采用單點(diǎn)篩選法進(jìn)行SPR動(dòng)力學(xué)分析。具體實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例7。各序列單點(diǎn)RU值變化曲線如圖16所示。

結(jié)果表明，與In27相比，1T6T的響應(yīng)值明顯升高，同時(shí)1T6T的響應(yīng)值介于1T和6T之間。1T27A和1T27A6T響應(yīng)值下降明顯，再次說(shuō)明27位堿基(G)在識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，而與兩端1T27A的配對(duì)無(wú)關(guān)。

實(shí)施例20以In27為識(shí)別元件，與EPO-α進(jìn)行親和識(shí)別檢測(cè)

取2μL的3’-dT₁₂-Biotin-In27(由上海生工生物工程有限公司合成，在In27的3’端修飾上一個(gè)Biotin分子)儲(chǔ)備液(該儲(chǔ)備液用超純水配置，濃度為100μM)，加入5×Tris-HCl緩沖液8μL，4μL的1wt％Tween 20，26μL滅菌超純水，得到5μM的3’-dT₁₂-Biotin-In27中間儲(chǔ)備液。取4μL的中間儲(chǔ)備液(5μM)，加入396μL的Tris-T緩沖液，得到50nM的固定溶液，于95℃下變性5min，4℃放置。

依上述方法，配置400μL的50nM的3’-Biotin-39nt(由上海生工生物工程有限公司合成，在39nt的3’端修飾上一個(gè)Biotin分子)的固定溶液。

取用一塊新的SA芯片，固定前處理同實(shí)施例5。將50nM的3’-Biotin-39nt固定溶液，在流速10μL/min，進(jìn)樣時(shí)間300秒的條件下，固定于SA芯片通道2上，此時(shí)響應(yīng)穩(wěn)定性(stability)RU值上升了1550。將50nM的3’-dT₁₂-Biotin-In27固定溶液，在流速10μL/min，進(jìn)樣時(shí)間300秒的條件下，固定于SA芯片通道4上，此時(shí)響應(yīng)穩(wěn)定性(stability)RU值上升了1800。

在SA芯片上，使用3’-Biotin-39nt(通道2)和3’-dT₁₂-Biotin-In27(通道4)，進(jìn)行EPO-α和39nt及In27間的親和力和動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)合時(shí)間為120秒，解離時(shí)間為300秒，流速為30μL/min。再生條件為5mM NaOH，進(jìn)樣時(shí)間15秒，流速為30μL/min。包含以空白溶劑為零點(diǎn)在內(nèi)的EPO-α六個(gè)濃度的進(jìn)樣順序?yàn)?、0、6.25、12.5、25、50、100、200nM，得到結(jié)合解離譜圖，如圖17A和圖17B所示。

非線性擬合結(jié)果表明，39nt與EPO-α相互作用的解離常數(shù)K_D＝55nM，結(jié)合速率常數(shù)K_a＝2.7×10⁴M^-1s^-1，解離速率常數(shù)K_d＝1.4×10^-4s^-1(U-value＝1，Chi²＝0.23)；In27與EPO-α相互作用的解離常數(shù)K_D＝78nM，結(jié)合速率常數(shù)K_a＝2.2×10⁴M^-1s^-1，解離速率常數(shù)K_d＝1.7×10^-4s^-1(U-value＝1，Chi²＝0.06)。說(shuō)明In 27作為識(shí)別元件，很好地實(shí)現(xiàn)了對(duì)EPO-α蛋白的親和識(shí)別與檢測(cè)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所

<120> 一種適配體組合文庫(kù)、其構(gòu)建方法及用途

<130> IDC160136

<160> 69

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 1

gattgaaagg tctgtttttg gggttggttt gggtcaata 39

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 2

gaaaggtctg tttttggggt tggtttgggt c 31

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 3

agaaaggtct gtttttgggg ttggtttggg tct 33

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 4

agagaaaggt ctgtttttgg ggttggtttg ggtctct 37

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 5

gagagaaagg tctgtttttg gggttggttt gggtctctc 39

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 6

agagagaaag gtctgttttt ggggttggtt tgggtctctc t 41

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 7

gagagagaga aaggtctgtt tttggggttg gtttgggtct ctctctc 47

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 8

gagagagaga gaaaggtctg tttttggggt tggtttgggt ctctctctct c 51

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 9

agagagagag agagaaaggt ctgtttttgg ggttggtttg ggtctctctc tctctct 57

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 10

gattgaaagg tctgtttttg gggttggttt gggtcaa 37

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 11

gattgaaagg tctgtttttg gggttggttt gggtc 35

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 12

gattgaaagg tctgtttttg gggttggttt ggg 33

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 13

gattgaaagg tctgtttttg gggttggttt g 31

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 14

gattgaaagg tctgtttttg gggttggtt 29

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 15

gattgaaagg tctgtttttg gggttgg 27

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 16

gattgaaagg tctgtttttg gggtt 25

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 17

gattgaaagg tctgtttttg ggg 23

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 18

gattgaaagg tctgtttttg g 21

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 19

ttgaaaggtc tgtttttggg gttggtttgg gtcaata 37

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 20

gaaaggtctg tttttggggt tggtttgggt caata 35

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 21

aaggtctgtt tttggggttg gtttgggtca ata 33

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 22

ggtctgtttt tggggttggt ttgggtcaat a 31

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 23

tctgtttttg gggttggttt gggtcaata 29

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 24

tgtttttggg gttggtttgg gtcaata 27

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 25

tttttggggt tggtttgggt caata 25

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 26

tttggggttg gtttgggtca ata 23

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 27

tggggttggt ttgggtcaat a 21

<210> 28

<211> 37

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 28

attgaaaggt ctgtttttgg ggttggtttg ggtcaat 37

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 29

ttgaaaggtc tgtttttggg gttggtttgg gtcaa 35

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 30

tgaaaggtct gtttttgggg ttggtttggg tca 33

<210> 31

<211> 31

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 31

gaaaggtctg tttttggggt tggtttgggt c 31

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 32

aaaggtctgt ttttggggtt ggtttgggt 29

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 33

aaggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 34

aggtctgttt ttggggttgg tttgg 25

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 35

ggtctgtttt tggggttggt ttg 23

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 36

gtctgttttt ggggttggtt t 21

<210> 37

<211> 26

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 37

aggtctgttt ttggggttgg tttggg 26

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 38

taggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 39

gaggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 40

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 40

caggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 41

agggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 42

atggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 43

ttggtctgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 44

<211> 26

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 44

aaggttgttt ttggggttgg tttggg 26

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 45

aaggtttgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 46

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 46

aaggtatgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 47

aaggtgtgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 48

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 48

aaggtctttt tttggggttg gtttggg 27

<210> 49

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 49

aaggtttttt tttggggttg gtttggg 27

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 50

aaggtctgtt ttggggttgg tttggg 26

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 51

aaggtctgtt tggggttggt ttggg 25

<210> 52

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 52

aaggtctgtt tttggggatg gtttggg 27

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 53

aaggtctgtt tttggggttg gtatggg 27

<210> 54

<211> 26

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 54

aaggtctgtt tttggggttg gtttgg 26

<210> 55

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 55

aaggtctgtt tttggggttg gtttgga 27

<210> 56

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 56

aaggtctgtt tttggggttg gtttggt 27

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 57

aaggtttgtt ttttgggttg gtttggg 27

<210> 58

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 58

aaggtttgtt tttgtggttg gtttggg 27

<210> 59

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 59

aaggtttgtt tttggtgttg gtttggg 27

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 60

aaggtttgtt tttgggtttg gtttggg 27

<210> 61

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 61

aaggtttgtt tttttggttg gtttggg 27

<210> 62

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 62

aaggtttgtt tttgttgttg gtttggg 27

<210> 63

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 63

aaggtttgtt tttggttttg gtttggg 27

<210> 64

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 64

aaggtttgtt ttttggtttg gtttggg 27

<210> 65

<211> 26

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 65

aaggtttgtt tttggggttg gtttgg 26

<210> 66

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 66

aaggtttgtt tttggggttg gttttgg 27

<210> 67

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 67

taggtttgtt tttggggttg gtttggg 27

<210> 68

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 68

taggtctgtt tttggggttg gtttgga 27

<210> 69

<211> 27

<212> DNA

<213> 適配體

<400> 69

taggtttgtt tttggggttg gtttgga 27