本發明涉及家畜基因工程疫苗領域，具體地指一種表達豬流行性腹瀉病毒S₃₁₈基因的重組乳酸乳球菌及應用。

背景技術：

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是一種由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種高度接觸性腸道傳染病，以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征。PED于1971年在英國的養殖場首次出現，隨后傳遍整個歐洲大陸，以冬季零星暴發為主要特征。豬流行性腹瀉病毒使各個年齡階段的豬頻繁發生水樣腹瀉，尤其是新生仔豬出現高死亡率。包括美洲與亞洲在內的多個國家都檢測到PEDV的陽性抗體，并通過體外培養分離到病毒。近幾年來，該病在世界范圍內廣泛流行，以韓國和中國為主的多個亞洲國家暴發了高致死率的PED，造成養豬業巨大的經濟虧損。

本病的傳染源主要是病豬的排泄物，病毒存在于腸系膜淋巴結和腸絨毛上皮細胞中，隨糞便排出體外，排出物能污染水源、飼料、周圍環境及交通工具，如果衛生條件不達標，很容易造成病毒傳播；利用病原學檢測母豬的乳汁，也能檢測到PEDV病毒，所以大多自然感染的病例都是經口攝入而染病。各個年齡段的豬都能被感染而發病，哺乳仔豬發病率嚴重時能高達100％，致死率也能高達100％。冬季從12月至第二年2月為本病高發季節，夏季也可以發生。PEDV與其他冠狀病毒相比其傳播方式有特異性，急性暴發后更容易持續存在，種豬場暴發該病后可能自然消失，也可能呈區域性流行。

該病對哺乳仔豬的危害最嚴重，發病后出現嘔吐和水樣腹瀉典型癥狀；新生仔豬感染后會發生嚴重脫水而死亡，致死率較高；對于斷奶豬和育肥豬的危害不大，會出現持續4～6天的腹瀉，大多數病豬都能夠自愈，但是生長發育會受到影響，育肥豬后期的體重出現明顯下降；母豬感染此病后，會出現精神萎靡、厭食，伴有持續大約一周的下痢。此病的傳播常有自限性，有的豬場在4～5周內便可傳遍。

PEDV S基因編碼的S蛋白是種位于病毒粒子表面的纖突Ⅰ型糖蛋白，由1383個氨基酸(aa)組成，分子量為150-220kDa之間。從N端到C端分成4個主要結構：包含一個信號肽區(1-18aa)，4個中和位點區域(499-638aa、748-755aa、764-771aa和1368-1374aa)，1個跨膜區(1334-1356aa)和1個較短的胞內區(Sato et al.,2011)。根據冠狀病毒S蛋白的同源性可以將其分為S1(1-789aa)和S2(790-1383)2個結構域，通過序列比對發現，S2更為保守。S1負責識別和結合特異性受體，因病毒多樣性而變化結構域，S2負責融合病毒膜與細胞膜，使得其結構相對單一。S蛋白位于病毒粒子的表面，當位于細胞表面上的受體與病毒粒子結合后，S蛋白就會通過膜融合方式侵入到宿主細胞內并在感染宿主體內介導產生中和抗體。此外，利用病毒在體外進行細胞培養，適應增殖，體內培養使之毒力減弱這一特性，S蛋白成為研制防疫PEDV新型有效疫苗主要的目的蛋白。同時，科學家們還利用S基因的結構來探究PEDV各病毒株之間的遺傳關系、流行性病學以及基因突變和病毒遺傳進化等多個功能方面的研究。

研究發現自然感染或實驗室感染的血清中均可檢測到特異性抗體，但sIgA是保護豬不被感染發病的關鍵因素。Kedam等(1980)和Sprino等(1982)的研究都證實了sIgA抗體產生后會轉移到乳腺部位，然后分泌到初乳和常乳內。sIgA含有分泌片，能夠避免被腸胃部的酶消化，從而持續存在于腸道中，中和豬流行性腹瀉病毒，保護小腸上皮細胞不受損傷，起到保護哺乳仔豬的作用。由于口服疫苗無早期干擾作用，感染PEDV后5天才能誘導主動免疫，所以不能寄希望于給新生仔豬接種疫苗，而是重點放在如何使哺乳仔豬頭幾天內就可以快速得到保護；因此口服、鼻腔或肌肉注射滅活苗效果均不理想。

動物感染豬流行性病毒(PEDV)后前期主要通過粘膜免疫的途徑清除病原體，粘膜免疫是區別于全身免疫的局部免疫，是指動物機體與外界相通的腔道(消化道、呼氣道及泌尿生殖道等)粘膜表面的免疫，粘膜不僅是動物機體與外界環境的防御屏障，同時還兼有明顯的體液及細胞免疫功能，局部抗原刺激更能有效地激發機體粘膜分泌大量的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，作為粘膜免疫系統或局部免疫系統,特別在呼吸道、消化道、泌尿生殖道及乳腺等粘膜內所發生的免疫活性成份,對機體感染的防御作用越來越引起人們的重視，粘膜免疫系統在抵抗感染方面起著極其重要的作用,粘膜表面與外界抗原直接接觸,是機體抗感染的第一道防線，研究粘膜免疫無論在理論上還是在生產實踐上均具有重要而深遠的意義。

乳酸桿菌是人體和動物體內的益生菌，能夠誘導機體產生非特異性及特異性免疫應答，有效地拮抗消化道內的致病菌。科學家利用乳酸桿菌為載體構建可以表達外源基因的質粒，在機體黏膜中增殖(姜艷平等，2010)，達到持續不斷表達病原微生物的保護性抗原基因的目的，為多功能黏膜免疫口服疫苗提供了廣闊的研究前景。葛俊偉等(2009)將含有PEDV的N基因和中和抗原位點的重組質粒構建到干酪乳桿菌中，使保護性抗原基因表達產物得到有效的表達，口服免疫外源蛋白，刺激小鼠腸道產生局部的黏膜免疫應答反應，從而達到防治PEDV的作用。他們利用PEDV的主要防治途徑是黏膜免疫這一特性，初次探究了PEDV乳酸桿菌基因工程疫苗，取得良好的進展。

技術實現要素：

本發明提供了一種表達豬流行性腹瀉病毒S₃₁₈基因的重組乳酸乳球菌及應用。其應用乳酸乳球菌MG1363的組成型表達載體pMG36e進行表達，乳酸乳球菌是公認的安全級(GARS)微生物，對動物的生長具有有益的調節作用，乳酸菌組成型表達系統表達目的蛋白不需要誘導劑，在自身生長分裂過程中合成外源目的蛋白，可消除產品中誘導劑帶來的毒性及副作用。

為實現上述目的，本發明提供了一種密碼子優化的豬流行性腹瀉病毒PEDV的重組衣殼蛋白S₃₁₈基因，該S₃₁₈基因表達的蛋白具有COE(499-638aa)、SS2(748-755aa)、SS6(764-771aa)三個抗原中和位點，可有效刺激動物機體產生中和抗體；所述重組衣殼蛋白S₃₁₈基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。該基因表達蛋白的氨基酸序列SEQ IDNO.1所示。

該重組衣殼蛋白S₃₁₈基因是以SEQ IDNO.3所示的表達靶基因為參照，然后根據乳酸乳球菌MG1363密碼子的偏愛性進行密碼子優化處理得到，該靶基因表達的蛋白序列來自于NCBI(ACESSION：AFV59239)公開的豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的S蛋白序列，由于COE(499-638aa)、SS2(748-755aa)、SS6(764-771aa)三個抗原中和位點位于PEDV S基因的第474-792氨基酸殘基內，具體來說中和位點COE位于PEDV S基因的第1497-1914bp，中和位點SS2位于PEDV S基因的2244-2265bp，中和位點SS6位于PEDV S基因的2292-2313bp，故選取PEDV S蛋白的第474-792位氨基酸殘基，即PEDV S基因全長的第1422-2376bp基因序列作為目標基因序列并命名為PEDV-S₃₁₈。

本發明還提供了一種組成型重組表達載體PEDV-S₃₁₈-pMG36e，所述組成型重組表達載體PEDV-S₃₁₈-pMG36e是在表達載體pMG36e(載體圖譜如圖4所示)的Sal Ⅰ酶切位點和Kpn Ⅰ酶切位點間插入衣殼蛋白S₃₁₈基因構建而成，其中衣殼蛋白S₃₁₈基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，上述組成型重組表達載體PEDV-S₃₁₈-pMG36e的制備方法，包括以下步驟：

1)根據密碼子優化合成的衣殼蛋白S₃₁₈基因的核苷酸序列和pMG36e載體多克隆位點(如圖5所示)設計一對引物，上游和下游分別為：

PEDV-F：GGGTCGACCATGCAAGTTGCTTTTGAT，

Sal Ⅰ

PEDV-R：GGGGTACCTTAAATTGACATTGAA；

Kpn Ⅰ

其中，上述引物分別含有Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ的限制性內切酶，且在引物PEDV-R的限制性內切酶Kpn Ⅰ結尾加一個終止密碼子TAA；

2)擴增含有上述限制性內切酶的衣殼蛋白S₃₁₈基因片段；

以合成的S₃₁₈基因作為模板進行Prime-STAR擴增，

Prime-STAR擴增體系：

Prime-STAR擴增反應程序：

預變性：98℃，2min；變性：98℃，10sec；退火：55℃，15sec；延伸：72℃，1min；后延伸：72℃，10min；cycle：30；

純化含有上述限制性內切酶的衣殼蛋白S₃₁₈基因片段；

3)上述PCR得到的衣殼蛋白S₃₁₈基因片段和表達載體pMG36e的雙酶切

用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ兩種限制性內切酶分別同時酶切衣殼蛋白S₃₁₈基因片段和表達載體pMG36e，酶切反應體系如下：

純化回收得到線性化的衣殼蛋白S₃₁₈基因片段和線性化的表達載體pMG36e；

4)重組表達載體PEDV-S₃₁₈-pMG36e

將純化回收得到線性化的衣殼蛋白S₃₁₈基因片段和線性化的表達載體pMG36e用T4DNA連接酶連接，得到重組表達載體PEDV-S₃₁₈-pMG36e。

本發明提供一種表達豬流行性腹瀉病毒S₃₁₈基因的重組乳酸乳球菌PEDV-S₃₁₈-MG1363，所述重組乳酸乳球菌PEDV-S₃₁₈-MG1363的基因組中含有上述重組表達載體PEDV-S₃₁₈-pMG36e。

本發明提供了一種上述表達豬流行性腹瀉病毒S₃₁₈基因的重組乳酸乳球菌PEDV-S₃₁₈-MG1363的制備方法，包括以下步驟：

1)根據密碼子優化合成的衣殼蛋白S₃₁₈基因的核苷酸序列和pMG36e載體多克隆位點設計一對引物，上游和下游分別為：

PEDV-F：GGGTCGACCATGCAAGTTGCTTTTGAT，

Sal Ⅰ

PEDV-R：GGGGTACCTTAAATTGACATTGAA；

Kpn Ⅰ

其中，上述引物分別含有Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ的限制性內切酶，且在引物PEDV-R的限制性內切酶Kpn Ⅰ結尾加一個終止密碼子TAA；

2)擴增含有上述限制性內切酶的衣殼蛋白S₃₁₈基因片段；

以合成的S₃₁₈基因作為模板進行Prime-STAR擴增，

Prime-STAR擴增體系：

Prime-STAR擴增反應程序：

預變性：98℃，2min；變性：98℃，10sec；退火：55℃，15sec；延伸：72℃，1min；后延伸：72℃，10min；cycle：30；

純化含有上述限制性內切酶的衣殼蛋白S₃₁₈基因片段；

3)上述PCR得到的衣殼蛋白S₃₁₈基因片段和表達載體pMG36e的雙酶切

用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ兩種限制性內切酶分別同時酶切衣殼蛋白S₃₁₈基因片段和表達載體pMG36e，酶切反應體系如下：

純化回收得到線性化的衣殼蛋白S₃₁₈基因片段和線性化的表達載體pMG36e；

4)重組表達載體PEDV-S₃₁₈-pMG36e

將純化回收得到線性化的衣殼蛋白S1基因片段和線性化的表達載體pMG36e用T4DNA連接酶連接，得到重組表達載體PEDV-S₃₁₈-pMG36e。

5)制備重組乳酸乳球菌PEDV-S₃₁₈-MG1363

使用電轉化的方法將重組表達載體PEDV-S₃₁₈-pMG36e電轉至乳酸乳球菌MG1363中，得到重組乳酸乳球菌PEDV-S₃₁₈-MG1363。

本發明提供了一種表達豬流行性腹瀉病毒S₃₁₈基因的重組乳酸乳球菌PEDV-S₃₁₈-MG1363制備豬流行性腹瀉新型粘膜免疫疫苗的方法，包括以下步驟：

1、將重組乳酸乳球菌PEDV-S₃₁₈-MG1363活化培養，得到種子菌液，加入終濃度為25％無菌甘油，混合均勻，置于-80℃低溫保存，備用；

2)將種子菌液加入滅菌M17培養基中培養，得到一級種子液；

3)再將一級種子液加入滅菌M17培養基中培養，得到二級種子液；

4)將二級種子液置于發酵罐中發酵，得到發酵產物，即為豬流行性腹瀉新型粘膜免疫疫苗，將發酵產物冷凍干燥后裝袋制成豬流行性腹瀉新型粘膜免疫疫苗成品。

豬流行性腹瀉新型粘膜免疫疫苗在治療仔豬病毒性腹瀉中的應用。將上述豬流行性腹瀉新型粘膜免疫疫苗與飼料混合，飼喂妊娠母豬和仔豬一段時間即可預防和控制由豬流行性腹瀉病毒引起的豬病毒性腹瀉等疾病。

本發明的有益效果在于：

1、表達的PEDV S₃₁₈蛋白與微生態制劑乳酸乳球菌MG1363的有機結合，重組菌經消化道進入動物的腸粘膜既可刺激腸道產生足量特異性sIgA保護腸道免受PEDV的入侵，又可發揮微生態制劑的多種腸道益生功能，二者聯合可有效預防豬的流行性腹瀉等腹瀉疾病，共同保障動物腸道健康；

2、豬流行性腹瀉新型粘膜免疫疫苗所用的載體pMG36e為一種組成型表達載體，蛋白的表達無需IPTG的誘導，可避免IPTG等誘導劑對動物的毒性作用；

3、豬流行性腹瀉新型粘膜免疫疫苗以活菌為主要應用形式，主要與飼料混合飼喂，無需蛋白的純化工藝，可很大程度上節約成本，也無需注射使用，避免了對動物的應激等不良因素；

4、脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁上特有成分，又稱內毒素，可引起動物發熱、微循環障礙、休克等不良反應，而乳酸乳球菌MG1363為革蘭氏陽性菌，細胞壁沒有LPS內毒素，飼喂后不會對動物產生任何不良影響；

5、重組乳酸乳球菌PEDV-S₃₁₈-MG1363以活菌的形式飼喂妊娠母豬和仔豬，重組活菌耐受胃酸和消化酶后到達豬的腸道后在一定程度上定殖并增殖于腸道粘膜上，不斷表達豬流行性腹瀉病毒的S₃₁₈蛋白，激活腸道粘膜免疫系統產生足量的特異性和非特異性sIgA抗體保護腸道健康。

附圖說明

圖1為篩選S₃₁₈基因與pMG36e載體連接的陽性克隆子電泳圖(引物PEDV-F和PEDV-R，產物約954bp)；

圖2為S₃₁₈基因與pMG36e載體連接的陽性克隆質粒用限制性內切酶Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ分別同時酶切的瓊脂糖凝膠電泳圖(S₃₁₈基因為954bp，pMG36e載體約3.6kb)；

圖3為MG1363表達S₃₁₈蛋白的WB圖(蛋白大小在37KD左右)；

圖4為pMG36e載體圖譜；

圖5為pMG36e載體的多克隆位點圖譜；

圖6為PEDV-S₃₁₈-MG1363重組乳酸菌飼喂昆明鼠后血清IgG抗體水平隨飼喂時間變化情況；

圖7為PEDV-S₃₁₈-MG1363重組乳酸菌飼喂昆明鼠后腸道sIgA抗體水平隨飼喂時間變化情況。

具體實施方式

為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但本發明的內容不僅僅局限于以下實施例。本發明所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規實驗方案，所述實際，如未特別說明，均為商業化或是已公開的試劑材料。

實施例1

目的基因及引物的合成

1.目的基因的合成

根據NCBI上發表的PEDV S基因序列(ACESSION：AFV59239)取S基因全長的的第1422-2376bp基因序列(見序列表3)，通過MG1363乳酸乳球菌的密碼子偏好性表進行密碼子優化(見序列表2)

MG1363乳酸乳球菌的密碼子偏好性表

Codon Frequency Table Used Lactococcus lactis subsp.Cremoris MG1363

2.引物合成

2.1.基因合成引物

根據密碼子優化合成的基因序列(見序列表1)和pMG36e載體多克隆位點設計一對引物，上游和下游分別為：

PEDV-F：GGGTCGACCATGCAAGTTGCTTTTGAT，

Sal Ⅰ

PEDV-R：GGGGTACCTTAAATTGACATTGAA；

Kpn Ⅰ

限制性內切酶分別為Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ，因上游會產生移碼現象故在酶切位點后加一個堿基C，并且在Sal Ⅰ酶切位點后加入一個起始密碼子ATG，Kpn Ⅰ酶切位點后加一個終止密碼子TAA。

2.2轉化子鑒定引物

由于合成的S₃₁₈基因只有954bp，基因片段不長，故依舊用基因合成引物PEDV-F和PEDV-R來鑒定重組載體，該引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列如下：

PEDV-F：GGGTCGACCATGCAAGTTGCTTTTGAT

Sal Ⅰ

PEDV-R：GGGGTACCTTAAATTGACATTGAA

Kpn Ⅰ

2.3測序引物

在pMG36e載體的起始密碼子上游設計一個鑒定引物，根據引物設計原則，用Prime5.0軟件設計，得到引物序列如下：

cexu001：GGCTTAATAAAGCGGTTACT

實施例2

重組載體PEDV-S₃₁₈-pMG36e的構建

1.目的基因片段的擴增

按照質粒小量抽提試劑盒說明書對含有合成的S₃₁₈基因的質粒和pMG36e載體進行快速抽提

用Prime-STAR擴增密碼子優化的S₃₁₈基因序列一共擴增6管，每管50μl，Prime-STAR擴增體系：

Prime-STAR擴增反應程序：

預變性：98℃，2min；變性：98℃，10sec；退火：55℃，15sec；延伸：72℃，1min；后延伸：72℃，10min；cycle：30

擴增完成后加入5.5μl10×loading buffer，用1％的瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶用凝膠回收試劑盒回收目的片段。

2.S₃₁₈基因和pMG36e載體的雙酶切

用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ兩種限制性內切酶分別同時酶切S₃₁₈基因片段和pMG36e載體，酶切反應體系如下：

混合充分后37℃反應2h，加入5μl 10×loading buffer，1％瓊脂糖凝膠電泳分別切下954bp的S₃₁₈基因和3.6kb的pMG36e載體，用凝膠回收試劑盒回收目的片段。

3.S₃₁₈基因與pMG36e表達載體的連接

將酶切后純化回收的S₃₁₈基因和pMG36e載體用T4DNA連接酶連接(S₃₁₈基因與pMG36e載體摩爾數比值為10:1左右)。

T4DNA連接酶連接體系：

體系混合均勻，4℃冰箱靜置反應16h。

4.連接產物轉化至Trans1-Blue感受態細胞中

轉化步驟與方法：

4.1-80℃冰箱取出一支Trans1-Blue感受態細胞(100μl裝)，置冰上融化(約5min)；

4.2用移液槍取10μl連接產物輕輕加至融化的Trans1-Blue感受態細胞中，冰浴30min；

4.3 42℃水浴熱擊90sec，迅速放置冰上3min；

4.4加入LB培養基500μl，37℃搖床培養50min；

4.5各取300μl涂2個LA平板(含300μg/ml的紅霉素)，37℃避光倒置培養36-48h。

5.轉化子的鑒定

5.1PCR菌落鑒定

用引物PEDV-F和PEDV-R這對引物鑒定擴增轉化子

PCR鑒定擴增體系如下：

Easy-Taq擴增反應程序：

預變性：95℃，5min；變性：94℃，30sec；退火：55℃，30sec；延伸：72℃，1min；后延伸：72℃，5min；cycle：30

擴增完成加入2μl 10×loading buffer，混合均勻，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定有約954bp的目的條帶的疑似陽性菌落見圖1所示；

5.2雙酶切鑒定

用質粒小量提取試劑盒抽提疑似陽性菌的質粒，用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ兩種限制性內切酶酶切疑似陽性菌質粒，得到大小分別為954bp和3.6kb的DNA條帶見圖2所示；

5.3將PCR鑒定為陽性的轉化子擴大培養后，用質粒小量提取試劑盒抽提質粒，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序引物為cexu001：GGCTTAATAAAGCGGTTACT，測序結果與預期100％匹配，無突變和移碼現象。將測序正確的菌株用終濃度為25％的滅菌甘油-80℃保存。

實施例3

重組菌PEDV-S₃₁₈-MG1363重組菌的構建

1.相關培養基及試劑的配制

SGM17培養基：10mlM17培養基，1562μl50％蔗糖，200μl50％葡萄糖，100μl2mol/LMgCl₂，40μl 0.5mol/LCaCl₂。

Solution Ⅰ：84mlM17培養基，1ml50％葡萄糖，10ml 10％甘氨酸，5ml ddH₂O

Solution Ⅱ：34ml50％蔗糖，10ml甘油，56ml ddH₂O

2.MG1363乳酸乳球菌感受態的制備(現制現用)

MG1363乳酸乳球菌感受態的制備步驟如下：

2.1用移液槍取50μl MG1363種子液，加入至滅菌的5ml M17培養基中，30℃靜置培養10h；

2.2將培養10h的MG1363種子液以2％的接種量接至滅菌的15ml Solution Ⅰ培養基中，30℃靜置培養；

2.3在波長600nm下測定菌液的吸光度，當OD₆₀₀＝0.8時4℃3000r/m離心10min，棄上清，置冰上；

2.4用滅菌的Solution Ⅱ輕洗沉淀，4℃3000r/m離心10min，棄上清，置冰上；

2.5重復步驟2.4兩次；

2.6用200μl的無菌Solution Ⅱ重懸MG1363沉淀，置冰上待后續用。

3.重組載體PEDV-S₃₁₈-pMG36e電轉至乳酸乳球菌MG1363中

用質粒小量提取試劑盒提取PEDV-S₃₁₈-pMG36e重組質粒

MG1363感受態的電轉化步驟：

3.1取浸泡在無水乙醇中的1mm電轉杯置超凈臺中，待電轉杯中無水乙醇充分揮發后移至冰上15min；

3.2用移液槍分別取3μl的PEDV-S₃₁₈-pMG36e重組質粒和pMG36e質粒，加入至制備好的MG1363感受態細胞中，冰浴5min；

3.3用移液槍輕輕吸取混合液于預冷的1mm電轉杯中，輕輕在超凈臺臺面敲擊電轉杯，使混合液均勻進入電轉杯底部，冰浴10min；

3.4取2×600μl SGM17滅菌培養基于1.5mlEP管中，冰浴10min；

3.5打開電轉儀，設置參數：電壓1100V、電容25μF、電阻250Ω，將預冷的電轉杯放入，按下Pulse鍵，待蜂鳴聲停止后，迅速加入600μl預冷的SGM17培養基，混合均勻，轉移至1.5mlEP管中，30℃溫箱靜置復蘇2h；

3.6用移液槍分別取300μl復蘇的乳酸乳球菌細胞涂布含15μg/ml紅霉素的M17平板，30℃倒置培養，2-3天后觀察電轉結果，挑取轉化子PCR菌落鑒定得到陽性的PEDV-S₃₁₈-MG1363重組菌和pMG36e-MG1363空載菌。

實施例4

PEDV-S₃₁₈-MG1363重組菌的表達及WB鑒定

1.相關試劑的配制

1.1SDS-PAGE分離膠的制備

1.2SDS-PAGE濃縮膠的制備

1.3考馬斯亮藍染色液

稱取1.0g考馬斯亮藍R-250，加入50ml冰醋酸、25ml無水乙醇和425mlddH₂O，攪拌溶解后過濾；

1.4考馬斯亮藍脫色液

50ml冰醋酸、25ml無水乙醇，用ddH₂O定容至500ml；

1.5 1×Tris-Glycine電泳緩沖液(0.5L)

1.51gTris粉末、9.4g甘氨酸、0.5gSDS、ddH₂O定容至0.5L；

1.6轉膜緩沖液(1L)

3.03gTris粉末、14.4g甘氨酸、200ml甲醇、ddH₂O定容至1000ml；

1.7 5×SDS-PAGE loading buffer

ddH₂O溶解后定容至5ml，室溫保存。

1.8 1.0mol/L Tris-HCl

30.29gTris粉末、200ml ddH₂O，溶解后用濃鹽酸調節PH至所需點(下表所示)，最后用ddH₂O定容至250ml，高壓蒸汽滅菌后室溫保存；

1.9 0.01mol/LPBS(pH＝7.2-7.4)

19ml 0.2mol/LNaH₂PO₄、81ml0.2mol/L Na₂HPO₄、17gNaCl、ddH₂O定容至2L；

1.10TBS緩沖液

10ml 1mol/LTris-HCl(pH＝7.5)、8.8gNaCl、ddH₂O定容至1L；

1.11TBST緩沖液

1.65ml20％Tween20、700mlTBS；

1.12 1％BSA封閉液

0.1gBSA粉末、10mlTBST緩沖液；溶解后4℃保存；

2.PEDV-S₃₁₈-MG1363重組菌的表達及Western blot鑒定

以2％接種量分別接種PEDV-S₃₁₈-MG1363重組菌和pMG36e-MG1363空載菌于100ml M17培養基中，30℃溫箱靜置培養約12h，12000r/m離心5min，棄上清，用500μl的無菌PBS重懸，取80μl的重懸液，加入20μl的5×SDS-PAGE loading buffer，煮沸5min，迅速置冰上2min，再煮沸5min，如此重復3次，12000r/m離心5min，取25μl上樣，以蛋白質標準分子量為參考，在分離膠為10％的SDS-PAGE蛋白膠上進行電泳分析；

組裝好蛋白電泳槽，按配方配制好10％的分離膠，各成分加入后迅速混勻，用移液器加入已封閉固定好的膠板中，用500μl甲醇封閉上層，待分離膠凝固后(約40min)用濾紙吸干，按配方配制濃縮膠，混合均勻加入分離膠之上，插上上樣梳，靜置45min，待濃縮膠完全凝固后拔出梳子，注入1×Tris-Glycine電泳緩沖液，在上樣孔中依次加入樣品，濃縮膠80V、分離膠120V電泳至溴酚藍遷移至凝膠底部，停止電泳，卸下膠板，切下合適大小的蛋白膠，用直尺量膠的尺寸，剪下6張同樣大小的濾紙和一張同樣大小的硝酸纖維膜，打開轉膜用的夾子，依次在上面放一張海綿墊、3張取剪好的用轉膜液浸潤的濾紙、蛋白膠、轉膜液浸潤的硝酸纖維膜、3張取剪好的用轉膜液浸潤的濾紙，注意在添加過程中要檊走氣泡，最后蓋上另外一塊海綿墊，兩邊的濾紙不能接觸，不然會產生短路，將夾子放入移液槽中，蛋白膠在負極，硝酸纖維膜在正極，在轉膜緩沖液中加入冰袋降溫，100V電泳1.5h，預測蛋白37KD左右。

將轉好的硝酸纖維膜放入1％BSA封閉液中室溫搖床封閉30min；室溫搖床孵育用TBST稀釋好的一抗2h，TBST洗滌5次，每次6min；孵育二抗1h，TBST洗滌5次，每次6min；顯膜觀察結果見圖3所示，結果表明PEDV-S₃₁₈-MG1363重組乳酸乳球菌成功表達目的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

實施例5

PEDV-S₃₁₈-MG1363重組乳酸菌的小鼠安全性實驗及免疫保護力試驗

1.實施方案

1.1實驗動物

4周齡的雌性昆明鼠，購自湖北省疾病預防控制中心。

1.2實驗分組

PBS對照組28只4周齡昆明雌鼠；

pMG36e-MG1363空載菌組28只4周齡昆明雌鼠；

PEDV-S₃₁₈-MG1363重組菌組28只4周齡昆明雌鼠。

1.3免疫方法自灌胃之日算起，每4天灌胃一次，每只小白鼠灌胃約100μl(10⁷cfu)，分別于第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天、第49天每組隨機取4只小白鼠眼球放血并頸部脫臼處死，收取小白鼠血清及腸粘膜刮取液，用ELISA分別測特異性IgG和腸道特異性sIgA抗體水平。

1.4血清收集方法將小白鼠用乙醚麻醉后摘取眼球，血液收集于1.5ml的無菌EP管中，37℃恒溫箱靜置1h，4℃冰箱過夜后3000rpm離心15min，用移液器收集血清于1.5mlEP管中-20℃暫存待后續ELISA抗體檢測及血清中和實驗。

1.5腸粘膜刮取液收集方法

采血完成后將小白鼠頸部脫臼致死，打開腹腔，剪開小腸，用無菌PBS緩沖液沖洗小腸后刮取0.5g腸道表面粘液于500μl無菌PBS緩沖液，混合均勻于-20℃暫存待后續ELISA抗體檢測及腸粘液中和實驗。

2.ELISA香港相關試劑配方：

2.1包被液配方25mmol/L的碳酸鹽緩沖液(調節pH至9.6)

2.2洗滌液配方含0.05％吐溫-20的PBS(pH7.4)

3.ELISA檢測的步驟與方法

3.1抗原包被

用PET32a表達載體表達純化S₃₁₈蛋白，并測定純化后的蛋白濃度為1.1mg/ml，采用方陣滴定的方法確定重組蛋白的最佳包被濃度為200ng/100μl，稀釋蛋白至2ng/μl，向96孔ELISA板每孔加入100μl蛋白稀釋液，37℃包被2h或4℃冰箱包被過夜；

3.2洗滌用排槍向每孔加入200μl的PBST洗滌液，37℃靜置5min，然后倒掉洗滌液，重復操作5次；

3.3封閉向每孔中加入100μl含2％BSA或5％脫脂奶粉的PBST緩沖液，37℃封閉2h或4℃封閉過夜；

3.4洗滌操作見步驟3.2；

3.5一抗孵育向酶標板第一列和第七列加入195μl的PBST緩沖液，其余每孔加入100μl的PBST，將采集的不同樣品(抗體)加入至第一和第七列，每孔5μl，并以2倍稀釋度依次倍比稀釋至第6個孔和第12個孔,37℃靜置1h；

3.6洗滌操作見步驟3.2；

3.7二抗孵育向每孔中加入100μl用TBST適當比例稀釋的HRP標記的二抗(羊抗豬或羊抗鼠)，37℃孵育30min；

3.8洗滌操作見步驟3.2；

3.9顯色向每孔中加100μl由底物A和B等體積混合的混合液，室溫靜置10min后向每孔加入50μl終止液，讀取OD₆₃₀值。

4.特異性抗體的檢測

由于PEDV感染后動物機體主要通過粘膜免疫的途徑來消除病原體，故本實驗主要用ELISA的方法來檢測血清中的特異性IgG抗體水平和腸道內的特異性sIgA抗體水平。

4.1抗體的檢測結果

4.1.1血清中的特異性IgG抗體檢測結果(1:40稀釋)

由圖6可知小鼠灌服重組乳酸乳球菌后血清中特異中和抗體滴度隨著時間逐漸升高，并在第28d達到最高峰，隨后逐漸降低并維持在中等水平，有助于中和進入血液中的PEDV病毒。

4.1.2腸道sIgA抗體測定結果(1:10稀釋)

由圖7可知小鼠灌服重組乳酸乳球菌后腸道特異sIgA抗體滴度隨著時間逐漸升高，并在第28d基本保持不變并維持在中高等水平，有助于清除腸道內PEDV病毒。

5.小鼠血清中和PEDV試驗

由于PEDV是典型的“糞－口－腸”途徑傳染，腸道黏膜感染是本病突出的特征，局部黏膜免疫是抵抗病原的第一道防線，也是最重要的免疫途徑，并且血清中IgG抗體水平對感染的抵抗力并不相關，因此能否刺激腸道產生足量的特異性sIgA抗體是預防本病的關鍵。

5.1測PEDV的TCID₅₀

5.1.1將消化好的Vero細胞接96孔板，放37℃5％CO₂的恒溫培養箱培養至長出單層細胞；

5.1.2在滅菌EP管中用DMEM將PEDV病毒液連續10倍稀釋，從10^-1至10^-10；

5.1.3將稀釋好的病毒接種到長有單層Vero細胞的96孔板中，每一稀釋度接種一縱排，共8個孔，每孔接種病毒量為100μl，第11縱排和第12縱排接無病毒的DMED對照，放37℃5％CO₂的恒溫培養箱孵育2h；

5.1.4用移液器小心吸出液體，加入100μl細胞培養液(含2％的血清)，放37℃5％CO₂的恒溫培養箱培養96h；

5.1.5觀察并記錄結果，按Reed-Muerch兩氏法計算PEDV的TCID₅₀

lgTCID₅₀＝-6.33，TCID₅₀＝10^-6.33/0.1ml

5.2細胞中和實驗

5.2.1細胞中和實驗步驟

5.2.1.1將PEDV原毒稀釋成200TCID₅₀/50μl

5.2.1.2將存放于-20℃的腸道粘液置4℃12000r/min離心機離心20min，取上清用0.22μm的濾器過濾后置于無菌EP管中；

5.2.1.3取10個無菌EP管，各管加入90μl無菌PBS，向第一管加入90μl腸道粘液上清，混合均勻后取90μl加入第二管，依次類推至第十管，再向各管加入360μlPBS和450μl稀釋好的200TCID₅₀/50μl病毒液，渦旋儀上混勻，37℃恒溫箱孵育1.5h；

5.2.1.4取長有單層Vero細胞的96孔細胞培養板，用無菌PBS洗兩遍，每管加孵育好的病毒腸粘液混合液一縱排共8孔，每孔100μl，第11縱排加稀釋好的病毒液50μl作對照，第12縱排加100μl無菌PBS作對照，放置于37℃5％CO₂的恒溫培養箱孵育2h；

5.2.1.5取出96孔細胞培養板，用移液器吸出液體，加入配好的DMEM細胞培養液(含2％血清)，放置于37℃5％CO₂的恒溫培養箱培養96h，觀察并記錄細胞病變結果；

5.2.2細胞中和實驗結果及分析(細胞未病變孔數)

根據中和試驗結果，如下表所示，第7d、14d、21d和21d重組菌在腸道粘液稀釋到160倍，100％能有效抵抗200TCID₅₀病毒對細胞的攻擊，而對照組在稀釋160倍時，僅有25％能抵抗病毒對細胞的攻擊，由此可以看出飼喂重組乳酸乳球菌后小鼠腸道分泌的特異性sIgA抗體在一定程度上能中和PED病毒。

實施例6

上述重組乳酸乳球菌PEDV-S₃₁₈-MG1363制備豬流行性腹瀉新型粘膜免疫疫苗的方法，包括以下步驟方法：

1、重組乳酸乳球菌PEDV-S₃₁₈-MG1363構建完成后得到種子菌液放-80℃低溫保存；

2、取出15μl種子液加15ml滅菌M17培養基中，放置30℃溫箱培養10h，作為發酵的一級種子液；

3、取10ml一級種子液，加入1L無菌M17培養基中，放置30℃溫箱培養10h，作為發酵的二級種子液；

4、將二級種子液加入100L發酵罐中發酵約48h，得到發酵產物即為豬流行性腹瀉新型粘膜免疫疫苗，將發酵產物冷凍干燥后裝袋制成豬流行性腹瀉新型粘膜免疫疫苗成品。

其它未詳細說明的部分均為現有技術。盡管上述實施例對本發明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可以根據本實施例在不經創造性前提下獲得其他實施例，這些實施例都屬于本發明保護范圍。

<110>華中農業大學

<120>表達豬流行性腹瀉病毒S318基因的重組乳酸乳球菌及應用

<211> 318aa

<212> PRT

<213>衣殼蛋白S318

<400> 1

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<210>2

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<212>cDNA

<213>重組衣殼蛋白S318基因

<400> 2

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<210>3

<211> 954bp

<212>cDNA

<213>衣殼蛋白S318基因

<400> 3

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GTATT