本發明涉及植物提取技術領域，尤其是涉及一種從柑橘中提取川陳皮素、橘皮素的方法。
背景技術：
柑橘(Citrus reticulata Blanco)，蕓香科下屬植物，柑橘類果皮具有很高的藥用價值，橘皮中還含有硫胺素、核黃素、揮發油、黃酮類。橘皮中的揮發油對消化道有刺激作用。可以增加胃液分泌，促進胃腸蠕動，健胃祛風。黃酮有擴張冠狀動脈，增加冠狀動脈血流量的作用。此外，橘皮還有消炎、抗潰瘍、抑菌及利膽等效果。橘皮中的維生素P，對血管硬化癥有顯著療效。
其中，川陳皮素和橘皮素是柑橘類多甲氧基黃酮類(PMFs)主要部分，盡管在柑橘類植物含量低，但其具有比一般類柑橘黃酮更強的生理活性。具文獻報道，川陳皮素和橘皮素具有消炎、抗腫瘤、降低膽固醇和抗氧化等功能。如川陳皮素有拮抗哮喘炎癥，抗肝炎C型病毒等；體外實驗表明川陳皮素對Hela細胞、THP-1細胞、Colon26細胞、S180細胞具有較好的抑制作用。桔皮素具有抗真菌作用，體外可抑制腫瘤細胞增殖，可抑制嗜堿性細胞組胺釋放。對于平滑肌的收縮亦有抑制作用。其特有的生物活性使川陳皮素和橘皮素具有很高的藥用價值和廣闊的市場前景。
橙皮苷是柑橘類黃酮中的主要成分之一，橙皮苷具有維持滲透壓，增強毛細血管韌性，防止毛細血管破裂出血的作用。橙皮苷可以降低膽固醇，在臨床上用于心血管系統疾病的輔助治療，是多種防止動脈硬化和心肌梗塞的藥物的主要原料之一。橙皮苷還具有抗炎癥和鎮痛的功效；臨床研究表明橙皮苷可以減輕婦女絕經期。
目前，關于橙皮苷、川陳皮素和橘皮素聯合提取的專利，多集中用有機溶劑提取，然后有機溶劑多次萃取，萃取后再用有機溶劑重結晶等，如專利申請CN104230871A，通過分步提取分離多甲基黃酮和橙皮苷，提取時間過長，又經過多次吸附和洗脫，其步驟復雜，不利于工業化。如專利申請CN102875509A，只提取柑橘果皮中川陳皮素，原料未充分利用，降低原料價值。
有鑒于此，特提出本發明。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供從柑橘中提取川陳皮素、橘皮素的方法，所述的方法解決了現有技術提取成分單一，洗脫次數多導致提取效率低的問題。
為了達到以上目的，本發明提供了以下技術方案：
一種從柑橘中提取川陳皮素、橘皮素的方法，包括下列步驟：
步驟A：以第一有機溶劑與水的混合液為提取劑，控制溶液pH為8-9的條件下對提取原料回流提取一次或多次，合并提取液、濃縮，得到柑橘黃酮濃縮液；
步驟B：用第二有機溶劑萃取所述柑橘黃酮濃縮液，分離出有機相和水相；
步驟C：去除所述有機相中的萃取劑，再依次采用第一洗脫液和第二洗脫液在大孔吸附樹脂中進行洗脫，并分別收集川陳皮素、橘皮素；
其中，所述第一有機溶劑選自極性有機溶劑，優選醇、酮、醚、酯、酸；優選醇，優選甲醇/乙醇；
所述第二有機溶劑優選酮、醚、酯、烷烴、石油醚，優選酯、烷烴、石油醚中的一種；
所述第一洗脫液和第二洗脫液分別獨立地選自強極性有機溶劑和弱極性有機溶劑的混合液；所述強極性有機溶劑優選選自酸/酯，所述弱極性有機溶劑優選選自烷烴/石油醚。
本發明的上述方法通過堿性條件下的回流提取、萃取、洗脫三步至少實現了多個成分(陳皮素、橘皮素)、減少洗脫次數兩個效果。
具體地，本發明首先采用極性有機溶劑和水的混合液對原料(柑橘的果皮、果肉或者整顆果實)回流提取，并加入堿，從而快速、高利用率地使原料中柑橘黃酮類物質溶出。這一步與傳統工藝中的回流提取相比，提取效率和溶出度達到提高。之后再采用萃取的方法將水溶性雜質與目標物分離開，這不僅減輕了后續洗脫的工作量和難度，而且還可以結合其他工藝回收利用水溶性的成分。第三步，本發明通過調整洗脫液的組成以及配比分別分離出上述有機相中的陳皮素、橘皮素。
綜上，與現有工藝相比，本發明首先提取的成分種類多，至少包含陳皮素、橘皮素，提高了生產效益；其次本發明縮短了提取時間，提高了生產效率，更利于工業化。
此外，本發明在回流提取之前還需對原料進行常規預處理，例如干燥、磨粉等。
本發明所述的控制溶液pH是針對回流提取的整體溶液。
上述方法還可以進一步改進：
優選地，所述步驟A的回流提取次數以及濃縮的程度根據成本與效益的權衡選擇，另外，濃縮還應當考慮黃酮類物質的穩定性。優選的濃縮溫度為70-80℃。
優選地，所述第一有機溶劑優選考慮與黃酮類物質化學結構相似的溶劑，但同時應當兼顧安全性、成本、回流難度等因素。其中最佳選擇為醇，主要指C1-5的低級醇，例如甲醇、乙醇、正丁醇。
優選地，在選用所述第一洗脫液和第二洗脫液時，應當選用極性相差大的兩種或兩種以上的溶劑組成。
優選地，所述步驟A中控制溶液pH的方法為：加入水溶性的無機堿調節，所述無機堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣等中的一種或多種。
加入堿的主要目的是增加黃酮類物質的溶出速度和溶出率，因此在選擇堿時應當考慮性質穩定、溶解度大、不破壞目標物結構等方面。另外，堿以溶液形式加入。實際操作中，pH并不需要滿足預設的絕對值，允許存在常規的誤差或波動。
優選地，所述步驟A中回流提取的pH為8。
優選地，所述回流提取的溫度為60-80℃，優選70-80℃。
控制溫度能夠防止黃酮類物質氧化或者降低活性。
優選地，所述步驟A中的提取劑，第一有機溶劑與水的體積比為50-80:30-50；每次回流提取的時間優選為1-2小時，優選回流提取3次。
優選地，所述步驟A中，提取劑與提取原料的重量比為3-6:1。
優選地，所述步驟B中，第二有機溶劑與所述柑橘黃酮濃縮液的體積比為3-5L：1kg，每次萃取的時間優選為0.5-1.5h，優選1-1.5h；優選萃取2-3次。
優選地，所述步驟B的萃取劑為低極性有機溶劑。
優選地，去除所述有機相中的萃取劑時，采用真空旋轉蒸發回收法，環保且效率高。
優選地，所述步驟C中，第一洗脫液為酯：烷烴/石油醚＝1：1-2(v/v)，優選乙酸乙酯：正己烷＝1：1-2(v/v)，更優選乙酸乙酯：正己烷＝1：1(v/v)；
優選地，第二洗脫液為酯：烷烴/石油醚＝1：1-2(v/v)，優選乙酸乙酯：正己烷＝1：1-2(v/v)，更優選乙酸乙酯：正己烷＝1：2(v/v)。
在洗脫時，針對川陳皮素、橘皮素的極性差異，選用的洗脫液有所區分，以加強分離效果。
洗脫時的樹脂選擇非極性或弱極性大孔樹脂為中壓層析柱填充料，例如選自AB-8、D-101、DM301、HPD-100、AS-5、AS-8中的一種。
優選地，所述步驟C中洗脫的流速為30-50mL/min，柱壓1-3MPa。
本發明洗脫后所得的川陳皮素、橘皮素為溶液態，如果要得到純品，還需經過常規的濃縮、干燥、精提等過程，常用的精提方法為重結晶。針對川陳皮素、橘皮素，優選的重結晶溶劑為含量大于80％乙醇水溶液或無水乙醇。
本發明還有很重要的一個改進點是回收利用步驟B水相中的橙皮苷，具體如下：
調節所述水相的pH＝11-13，過濾去雜質，濾液調pH＝5-6，靜置，收集沉淀、干燥。
所述靜置的時間視情況而定。
綜上，與現有技術相比，本發明達到了以下技術效果：
(1)提高了生產效率：體現在回流提取速率快、洗脫次數少、工藝流程簡化等方面。
(2)降低了成本，提高了生產效益：體現在設備簡單、工藝流程簡化、提取成分種類多、提取率高等方面。
具體實施方式
下面將結合具體實施方式對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，但是本領域技術人員將會理解，下列所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例，僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
下文實施例1至5所用的樹脂為大孔吸附樹脂AB-8。
實施例1
原料橘皮產自四川金堂縣，將橘皮干燥至水分低于10％，干燥后粉碎過30目篩。
取200g橘皮粉末，加1200mL 70％乙醇水溶液，然后用5％NaoH溶液調pH＝8；在80℃下回流提取2小時，過濾收集濾液；濾料再次用1000mL pH＝8的70％乙醇水溶液在80℃下回流提取2次，每次1小時。合并三次濾液共3000mL。用旋轉蒸發儀回收乙醇得450mL柑橘黃酮濃縮液。
將柑橘黃酮濃縮液按1:3加入乙酸乙酯萃取3次，每次一小時，分離水相和有機相；有機相回收乙酸乙酯后得多甲氧基黃酮濃縮液約30mL。用恒流泵將乙酸乙酯泵入中壓層析柱至溶劑流出，將多甲氧基黃酮濃縮液泵入中壓層析柱，然后泵入正己烷，以乙酸乙酯：正己烷＝1:1比例為洗脫液，洗脫3-5次，收集含川陳皮素的流分；以乙酸乙酯：正己烷＝1:2比例為洗脫液，洗脫3-5次，收集含橘皮素的流分；流速30-50mL/min，柱壓1-3MPa；兩種流份分別濃縮，干燥，用無水乙醇重結晶，獲得川陳皮素和橘皮素。
將萃取后水相減壓回收至無乙酸乙酯味，加NaoH溶液調pH＝11，過濾去雜質，濾液調pH＝6收集沉淀，重結晶，得橙皮苷。
實施例2
原料橘皮產自四川金堂縣，將橘皮干燥至水分低于10％，干燥后粉碎過30目篩。
取200g橘皮粉末加5g生石灰混勻，然后加1200mL 50％乙醇水溶液，在80℃下回流提取2小時，過濾收集濾液；濾料再次用1000mL 50％乙醇水溶液在80℃下回流提取2次，每次1小時。合并三次濾液共2900mL。用旋轉蒸發儀回收乙醇得400mL柑橘黃酮濃縮液。
將柑橘黃酮濃縮液按1:3加入乙酸乙酯萃取3次，每次一小時，分離水相和有機相；有機相回收乙酸乙酯后得多甲氧基黃酮濃縮液約30mL。用恒流泵將乙酸乙酯泵入中壓層析柱至溶劑流出，將多甲氧基黃酮濃縮液泵入中壓層析柱，然后泵入正己烷，以乙酸乙酯：正己烷＝1:1比例為洗脫液，洗脫3-5次，收集含川陳皮素的流分；以乙酸乙酯：正己烷＝1:2比例為洗脫液，洗脫3-5次，收集含橘皮素的流分；流速30-50mL/min，柱壓1-3MPa；兩種流份分別濃縮，干燥，用無水乙醇重結晶，獲得川陳皮素和橘皮素。
將萃取后水相減壓回收至無乙酸乙酯味，加NaoH溶液調pH＝11，過濾去雜質，濾液調pH＝5收集沉淀，重結晶，得橙皮苷。
實施例3
原料橘皮產自四川金堂縣，將橘皮干燥至水分低于10％，干燥后粉碎過30目篩。
取200g橘皮粉末加1g氫氧化鉀，然后加1200mL 80％甲醇水溶液，在75℃下回流提取2小時，過濾收集濾液；濾料再次加1g氫氧化鉀，用1000mL80％甲醇水溶液在75℃下回流提取2次，每次1小時。合并濾液共2900mL。用旋轉蒸發儀回收乙醇得400mL柑橘黃酮濃縮液。
將柑橘黃酮濃縮液按1:3加入正己烷萃取3次，每次一小時，分離水相和有機相；有機相回收正己烷后得多甲氧基黃酮濃縮液約30mL。用恒流泵將正己烷泵入中壓層析柱至溶劑流出，將多甲氧基黃酮濃縮液泵入中壓層析柱，然后泵入乙酸乙酯，以乙酸乙酯：正己烷＝1:1比例為洗脫液，洗脫3-5次，收集含川陳皮素的流分；以乙酸乙酯：正己烷＝1:2比例為洗脫液，洗脫3-5次，收集含橘皮素的流分；流速30-50mL/min，柱壓1-3MPa；兩種流份分別濃縮，干燥，用95％乙醇重結晶，獲得川陳皮素和橘皮素。
將萃取后水相減壓回收至無乙酸乙酯味，加NaOH溶液調pH＝13，過濾去雜質，濾液調pH＝6收集沉淀，重結晶，得橙皮苷。
實施例4
原料橘皮產自四川金堂縣，將橘皮干燥至水分低于10％，干燥后粉碎過30目篩。
取1kg橘皮粉末加5L 70％乙醇水溶液，用NaoH溶液調pH＝8，在80℃下回流提取2小時，過濾收集濾液；濾料再次用4L pH＝8的70％乙醇水溶液在80℃下回流提取2次，每次1小時。合并三次濾液共12L。用旋轉蒸發儀回收乙醇得約1.5L柑橘黃酮濃縮液。
將柑橘黃酮濃縮液按1:3加入正己烷萃取3次，每次一小時，分離水相和有機相；有機相回收正己烷后得多甲氧基黃酮濃縮液約200mL。用恒流泵將正己烷泵入中壓層析柱至溶劑流出，將多甲氧基黃酮濃縮液泵入中壓層析柱，然后泵入乙酸乙酯，以乙酸乙酯：正己烷＝1:1比例為洗脫液，洗脫3-5次，收集含川陳皮素的流分；以乙酸乙酯：正己烷＝1:2比例為洗脫液，洗脫3-5次，收集含橘皮素的流分；流速30-50mL/min，柱壓1-3MPa；兩種流份分別濃縮，干燥，用90％乙醇重結晶，獲得含量大于90％川陳皮素2.4g和含量大于85％橘皮素1.7g。
將萃取后水相減壓回收至無乙酸乙酯味，加NaoH溶液調pH＝12，過濾去雜質，濾液調pH＝6收集沉淀，重結晶，得含量95％橙皮苷31.3g。
實施例5
原料橘皮產自四川金堂縣，將橘皮干燥至水分低于10％，干燥后粉碎過30目篩。
取5kg橘皮粉末加5g氫氧化鈉，然后加30L 75％乙醇水溶液，在70℃下回流提取2小時，過濾收集濾液；濾料再次加5g氫氧化鈉，用25L 75％乙醇水溶液在70℃下回流提取2次，每次1小時。合并三次濾液共73L。回收乙醇得8L柑橘黃酮濃縮液。
將柑橘黃酮濃縮液按1:2加入乙酸乙酯萃取3次，每次一小時，分離水相和有機相；有機相回收乙酸乙酯后得多甲氧基黃酮濃縮液約1000mL。用恒流泵將乙酸乙酯泵入中壓層析柱至溶劑流出，將多甲氧基黃酮濃縮液分次泵入中壓層析柱，然后泵入乙酸乙酯，以乙酸乙酯：正己烷＝1:1比例為洗脫液，洗脫3-5次，收集含川陳皮素的流分；以乙酸乙酯：正己烷＝1:2比例為洗脫液，洗脫3-5次，收集含橘皮素的流分；流速30-50mL/min，柱壓1-3MPa；兩種流份分別濃縮，干燥，用95％乙醇重結晶，獲得含量大于90％川陳皮素13.3g和含量大于85％橘皮素9.2g。
將萃取后水相減壓回收至無乙酸乙酯味，加NaoH溶液調pH＝11，過濾去雜質，濾液調pH＝6收集沉淀，重結晶，得95％橙皮苷169g。
實施例6-9
與實施例1的區別在于回流提取所用的溶劑不同，分別為：甲醇/水＝50:50(v/v)，甲醇/水＝85:15(v/v)，甲醇/水＝30:70(v/v)，乙醇/水＝30:70(v/v)。
實施例10
與實施例1的區別在于回流提取時加入的堿量不同，需加至溶液的pH約為9。
實施例11-13
與實施例1的區別在于萃取時所用的溶劑不同，分別為：乙酸甲酯，環己烷，乙酸乙酯與環己烷混合物。
實施例14
與實施例1的區別在于洗脫所用的洗脫液不同，收集川陳皮素的洗脫液為乙酸乙酯：石油醚＝1:1(V/V)，收集橘皮素的洗脫液為乙酸乙酯：石油醚＝1:2(V/V)。
實施例15-19
與實施例1的區別在于所用的吸附樹脂不同，分別為大孔吸附樹脂D-101、DM301、HPD-100、AS-5、AS-8。
對比以上所有實施例的提取效果，結果如表1。
表1
最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。