本發明涉及一種從鐵皮石斛中提取抗酪氨酸酶活性物質的方法，屬于化學提取領域。

背景技術：

鐵皮石斛Dendrobium officinale是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，主要分布于西南和江南各省。我國的石斛屬植物有76種，其中有33個種作為商品石斛的原植物被收購。鐵皮石斛是《中華人民共和國藥典》中被收載的5種石斛屬植物之一。

分析表明，鐵皮石斛的莖的黏性物質主要是水溶性的多糖，鐵皮石斛的水溶性多糖為一類免疫增強劑，對提高小鼠外周白細胞和促進淋巴細胞產生移動因子具有明顯的作用。鐵皮石斛是含有鼓槌菲(chrysotoxene)和毛蘭素(erianin)兩種抗癌物質的5個種之一。藥理研究表明，這兩個菲類化合物具有對肝癌和艾氏腹水癌細胞抑制活性。目前對鐵皮石斛的開發研究主要集中在鐵皮石斛以及提取根莖中的多糖，鐵皮石斛葉片的開發還不多。

技術實現要素：

本發明的目的首先在于提供一種具有抗酪氨酸酶活性的有效部位，是從鐵皮石斛葉片中提取的具有較強抗酪氨酸酶活性的含有兩種多酚類化合物的有效部位，所述兩種多酚類化合物是草大戟素、桑辛素M。

本發明的另外一個目的是提供所述具抗酪氨酸酶活性的有效部位的制備方法，通過以下步驟實現：

(1)取二年生萌條的新鮮鐵皮石斛葉片，粉碎后，于30℃，用3倍質量的75％乙醇浸沒超聲提取2次以上，每次1小時，超聲功率200W，提取液合并后，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯與提取液的體積比為3：1，乙酸乙酯相經過減壓濃縮得到干燥物；

(2)干燥物用95％乙醇溶解，過濾；

(3)步驟(2)所得過濾液與大孔樹脂D101混合拌樣，減壓濃縮至干；其中，大孔樹脂D101的用量與步驟(1)所得干燥物的質量比例為2:1；

(4)將步驟(3)所得混合物上D101大孔樹脂，分別用6倍柱體積量的15％、30％、40％濃度的乙醇洗脫；

(5)收集步驟(4)30％乙醇洗脫的洗脫液，濃縮得干燥樣品，干燥樣品進一步用硅膠柱層析分離，先后分別用20倍柱體積的體積比20:1的二氯甲烷-甲醇和體積比30:1的甲醇-水洗脫，先后分別得到草大戟素、桑辛素M。

本發明的另外一個目的是提供所述的具有酪氨酸酶抑制活性的有效部位在制備抗果蔬酶促褐變抑制劑、化妝品美白劑、預防和治療黑色素異常導致的人體色素沉著性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病癥的藥物中的應用。

本發明的兩種從鐵皮石斛中提取的具有酪氨酸酶抑制活性的多酚類化合物可以作為活性成分，制備成制劑。所述的劑型包括固體粉末、水溶液、醇溶液、乳液、面膜、巴布劑、注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、口含劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、口崩劑、微丸等。

本發明對于鐵皮石斛的葉片進行了開發利用，從中分離得到兩種具有酪氨酸酶抑制活性的有效部位。有效部位在50、30、10μg/mL三個濃度下，對酪氨酸酶的抑制率分別為37.1％、22.5％、14.3％；而陽性對照曲酸對酪氨酸酶的抑制率分別為24.7％、14.2％、9.3％。可見，本發明提供的鐵皮石斛提取物可在開發抗果蔬酶促褐變抑制劑、化妝品美白劑、預防和治療黑色素異常導致的人體色素沉著性疾病、黑色素瘤的藥物中，發揮應用價值。

附圖說明

圖1草大戟素的結構式

圖2桑辛素M的結構式

具體實施方式

高效液相檢測條件：

儀器：Waters 1525液相色譜儀配以紫外檢測器(2487)。

色譜柱：Alltima C18(250×4.6mm,5μm)。

流動相：A相：含0.1％甲酸的去離子水；B相：甲醇。線性洗脫梯度：0min，10％B；20min，30％B；30min，50％B；40min，70％B；50min，100％B。流速：1.0mL/min，檢測波長：280nm。

實施例1有效部位的提取

(1)取1kg二年生萌條的新鮮鐵皮石斛葉片，粉碎后，于30℃，用3倍質量的75％乙醇浸沒超聲提取2次以上，每次1小時，超聲功率200W，提取液合并后，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯與提取液的體積比為3：1，乙酸乙酯相經過減壓濃縮得到干燥物；

(2)干燥物用95％乙醇溶解，過濾；

(3)步驟(2)所得過濾液與大孔樹脂D101混合拌樣，減壓濃縮至干；其中，大孔樹脂D101的用量與步驟(1)所得干燥物的質量比例為2:1；

(4)將步驟(3)所得混合物上D101大孔樹脂，分別用6倍柱體積量的15％、30％、40％濃度的乙醇洗脫；

(5)收集步驟(4)30％乙醇洗脫的洗脫液，濃縮得干燥樣品，干燥樣品進一步用硅膠柱層析分離，先后分別用20倍柱體積的體積比20:1的二氯甲烷-甲醇和體積比30:1的甲醇-水洗脫，先后分別得到草大戟素、桑辛素M。每一千克鐵皮石斛葉片可提取得到10.7mg草大戟素、127mg桑辛素M。

草大戟素的核磁共振光譜數據如下：

¹H NMR(Acetone-d₆,400MHz)δ:12.210(1H,OH-5),9.019(2H,OH),7.290(1H,d,J＝8.4Hz,H-6'),6.465(1H,d,J＝2.4Hz,H-2'),6.415(1H,dd,J＝8.4,2.4Hz,H-5'),5.955(1H,d,J＝2.0Hz,H-8),5.936(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),5.692(1H,dd,J＝13.2,2.8Hz,H-2),3.163(1H,dd,J＝17.2,13.2Hz,H-3),2.703(1H,dd,J＝17.2,2.8Hz,H-3)；¹³C NMR(Acetone-d₆,100MHz)δ:197.8(C＝O,C-4),167.6(C,C-7),165.3(C,C-5),164.9(C,C-9),159.7(C,C-2'),156.5(C,C-4'),129.0(CH,C-6'),117.3(C,C-1'),107.9(CH,C-5'),103.6(CH,C-3'),103.1(C,C-10),96.8(CH,C-6),95.9(CH,C-8),75.4(CH,C-2),42.7(CH₂,C-3)。ESI-MS:m/z[M-H]^-287.1(C₁₅H₁₁O₆)。結構解析表明該化合物為草大戟素。

桑辛素M的核磁共振光譜數據如下：

¹H NMR(Acetone-d₆,400MHz)δ:8.60(3H,br s,OH),7.40(1H,d,J＝8.4Hz,H-4),7.20(1H,s,H-3),6.99(1H,d,J＝2.0Hz,H-7),6.86(2H,d,J＝2.0Hz,H-2',6'),6.81(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz,H-5),6.37(1H,t,J＝2.0Hz,H-4')；¹³C NMR(Acetone-d₆,100MHz)δ:159.83(C,C-3',5'),156.78(C,C-7a),156.71(C,C-2),155.58(C,C-6),133.47(C,C-1'),100.8(CH,C-3),122.65(C,C-3a),122.09(CH,C-4),113.31(CH,C-5),98.51(CH,C-3),103.92(CH,C-2',6'),103.61(CH,C-7),102.42(CH,C-4')。ESI-MS:m/z 241.0[M-H]^-(C₁₄H₉O₄)。結構解析表明該化合物為桑辛素M。

實施例2有效部位抑制酪氨酸酶活性的能力

將有效部位溶于DMSO，先配成1mg/mL溶液，然后分別稀釋到50、30、10μg/mL。以曲酸為陽性對照，曲酸溶液也分別配成濃度為50、30、10、10μg/mL的溶液。將有效部位、曲酸溶液各30μL，加到用970μL的磷酸鹽緩沖溶液中，再添加0.1mg/mL的酪氨酸1mL，然后加入1mL由磷酸鹽緩沖溶液配成的200U/mL的酪氨酸酶。在37℃下孵育20min，于492nm處測定吸光值。

酶活性抑制率＝[(A2-A1)-(B2-B1)]/(A2-A1)×100％

A1為0min時候未加抑制劑的吸收值；A2為20min后未加抑制劑的吸收值；

B1為0min時候加抑制劑的吸收值；B2為20min后加了抑制劑的吸收值。

有效部位在50、30、10μg/mL三個濃度下，對酪氨酸酶的抑制率分別為37.1％、22.5％、14.3％；陽性對照曲酸對酪氨酸酶的抑制率分別為24.7％、14.2％、9.3％。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。