本發(fā)明涉及一種有效制備果樹(shù)高分子量DNA的方法。

背景技術(shù)：

高純度、高質(zhì)量的大分子量（HMW）DNA 是復(fù)雜基因組限制性酶酶切分析和大片段基因組文庫(kù)構(gòu)建的前提。植物（HMW）DNA可以從原生質(zhì)體和細(xì)胞核中制備。用原生質(zhì)體法能制備很少被剪切的高質(zhì)量（HMW）DNA，但是該方法涉及到一系列降解細(xì)胞壁、分離、包埋和裂解等復(fù)雜、昂貴、耗時(shí)的過(guò)程，往往一種優(yōu)化的方法僅對(duì)某種特殊植物材料有效，而且從原生質(zhì)體中制備的（HMW）DNA有相對(duì)高的葉綠體和線粒體DNA 的污染，這不僅影響到用于所建基因文庫(kù)的真實(shí)性，而且影響到隨后的染色體步查及基因組分析結(jié)果的可靠性。

國(guó)外有研究團(tuán)隊(duì)首先從包埋于瓊脂糖中的植物細(xì)胞核中分離（HMW）DNA，經(jīng)過(guò)改進(jìn)，此法對(duì)許多植物材料都有效，且得到的（HMW）DNA濃度高，葉綠體DNA 污染少。但是在制備核和隨后裂解過(guò)程，造成相對(duì)嚴(yán)重的DNA 降解。Fu簡(jiǎn)化了植物細(xì)胞核的制備步驟，而通過(guò)脈沖電泳（PFGE ）來(lái)回收粗提核裂解物中的（HMW）DNA，得到了無(wú)葉綠體、線粒體DNA 污染、非特異小片段含量相對(duì)低的高質(zhì)量（HMW）DNA。對(duì)大多數(shù)果樹(shù)，很難分離原生質(zhì)體，雖然能從組培細(xì)胞中分離，但組培過(guò)程慢，費(fèi)事且易造成體細(xì)胞變異。因此，大多采用從核中制備果樹(shù)（HMW）DNA 2。由于大多數(shù)果樹(shù)葉片富含多酚多糖類物質(zhì)，它們會(huì)給（HMW）DNA的制備及隨后的分析帶來(lái)很大麻煩，同時(shí)在去除多酚和多糖的純化過(guò)程中，往往會(huì)影響了核DNA 的完整性，因而影響到所建大片段基因文庫(kù)的真實(shí)性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出一種有效制備果樹(shù)高分子量DNA的方法。

一種有效制備果樹(shù)高分子量DNA的方法，包括以下制備步驟：

（1）取蘋(píng)果或桃或杏或櫻桃或柿的鮮葉；核提取緩沖液：

（2）將10g鮮葉在液氮中研成細(xì)粉，加入200ml核提取緩沖液，置于冰浴中，用磁力攪拌器攪拌l0分鐘；該勻漿經(jīng)兩層紗布過(guò)后，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心20分鐘；

（3）棄上清，將沉淀物中加入少量核洗滌緩沖液，用毛刷輕輕打散，再加入約200ml核洗滌緩沖液混勻，以60轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心5分鐘，棄沉淀；

（4）將上清液于2000轉(zhuǎn)/分鐘的速度下離心20分鐘；

（5）將該沉淀洗滌l-3次，用lml lHB（無(wú)β-mercaptoet hanol ）將粗提核混勻，于45 C 下，與等量的l % LMP 瓊脂糖混合均勻；

（6）將步驟（5）產(chǎn)物裝入凝膠塊模具中，在4攝氏度溫度下凝固l小時(shí)，將包埋有細(xì)胞核的凝膠塊推入20倍體積的核裂解緩沖液中，50攝氏度下裂解24小時(shí)，其間更換裂解液兩次；

（7）將步驟（6）產(chǎn)物在4攝氏度下保存于0.5mol/L EDTA，lm mol／L PSMF 中；

（8）將上述凝膠塊置于大量的0.5xTBE中透析兩小時(shí)，然后包埋于l % 瓊脂糖凝膠的加樣孔中，進(jìn)行脈沖電泳，電泳結(jié)束后染色l0 分鐘后獲得的（HMW）DNA膠塊。

優(yōu)選地，電解液為：0. 5xTBE和濃度為l%（Bio- Rad）的瓊紙?zhí)悄z混合物。

優(yōu)選地，所述電泳的環(huán)境為：脈沖電壓：5V/cm， 脈沖角度：l20；脈沖溫度：11攝氏度，脈沖交變時(shí)間為5-l5秒；脈沖電泳時(shí)間為l8小時(shí)。

本發(fā)明一種有效制備果樹(shù)高分子量DNA的方法，步驟簡(jiǎn)單，容易操作，可以從絕大多數(shù)植物中制備（HMW）DNA，具有很好的推廣作用。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1。

一種有效制備果樹(shù)高分子量DNA的方法，包括以下制備步驟：

（1）取蘋(píng)果或桃或杏或櫻桃或柿的鮮葉；核提取緩沖液：

（2）將10g鮮葉在液氮中研成細(xì)粉，加入200ml核提取緩沖液，置于冰浴中，用磁力攪拌器攪拌l0分鐘；該勻漿經(jīng)兩層紗布過(guò)后，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心20分鐘；

（3）棄上清，將沉淀物中加入少量核洗滌緩沖液，用毛刷輕輕打散，再加入約200ml核洗滌緩沖液混勻，以60轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心5分鐘，棄沉淀；

（4）將上清液于2000轉(zhuǎn)/分鐘的速度下離心20分鐘；

（5）將該沉淀洗滌l-3次，用lml lHB（無(wú)β-mercaptoet hanol ）將粗提核混勻，于45 C 下，與等量的l % LMP 瓊脂糖混合均勻；

（6）將步驟（5）產(chǎn)物裝入凝膠塊模具中，在4攝氏度溫度下凝固l小時(shí)，將包埋有細(xì)胞核的凝膠塊推入20倍體積的核裂解緩沖液中，50攝氏度下裂解24小時(shí)，其間更換裂解液兩次；

（7）將步驟（6）產(chǎn)物在4攝氏度下保存于0.5mol/L EDTA，lm mol／L PSMF 中；

（8）將上述凝膠塊置于大量的0.5xTBE中透析兩小時(shí)，然后包埋于l % 瓊脂糖凝膠的加樣孔中，進(jìn)行脈沖電泳，電泳結(jié)束后染色l0 分鐘后獲得的（HMW）DNA膠塊。

優(yōu)選地，電解液為：0. 5xTBE和濃度為l%（Bio- Rad）的瓊紙?zhí)悄z混合物。

實(shí)施例2。

一種有效制備果樹(shù)高分子量DNA的方法，包括以下制備步驟：

（1）取蘋(píng)果或桃或杏或櫻桃或柿的鮮葉；核提取緩沖液：

（2）將10g鮮葉在液氮中研成細(xì)粉，加入200ml核提取緩沖液，置于冰浴中，用磁力攪拌器攪拌l0分鐘；該勻漿經(jīng)兩層紗布過(guò)后，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心20分鐘；

（3）棄上清，將沉淀物中加入少量核洗滌緩沖液，用毛刷輕輕打散，再加入約200ml核洗滌緩沖液混勻，以60轉(zhuǎn)/分鐘的速度，離心5分鐘，棄沉淀；

（4）將上清液于2000轉(zhuǎn)/分鐘的速度下離心20分鐘；

（5）將該沉淀洗滌l-3次，用lml lHB（無(wú)β-mercaptoet hanol ）將粗提核混勻，于45 C 下，與等量的l % LMP 瓊脂糖混合均勻；

（6）將步驟（5）產(chǎn)物裝入凝膠塊模具中，在4攝氏度溫度下凝固l小時(shí)，將包埋有細(xì)胞核的凝膠塊推入20倍體積的核裂解緩沖液中，50攝氏度下裂解24小時(shí)，其間更換裂解液兩次；

（7）將步驟（6）產(chǎn)物在4攝氏度下保存于0.5mol/L EDTA，lm mol／L PSMF 中；

（8）將上述凝膠塊置于大量的0.5xTBE中透析兩小時(shí)，然后包埋于l % 瓊脂糖凝膠的加樣孔中，進(jìn)行脈沖電泳，電泳結(jié)束后染色l0 分鐘后獲得的（HMW）DNA膠塊。

（9）所述電解液為：0. 5xTBE和濃度為l%（Bio- Rad）的瓊紙?zhí)悄z混合物

（10）所述電泳的環(huán)境為：脈沖電壓：5V/cm， 脈沖角度：l20；脈沖溫度：11攝氏度，脈沖交變時(shí)間為5-l5秒；脈沖電泳時(shí)間為l8小時(shí)。